生物化学蛋白质概论

第一章蛋白质的结构与功能StructureandFunctionofProtein

1833年

Payen和Persoz分离出淀粉酶。1864年

Hoppe-Seyler从血液分离出血红蛋白，并将其制成结晶。19世纪末

Fischer证明蛋白质是由氨基酸组成的，并将氨基酸合成了多种短肽

。1938年德国化学家GerardusJ.Mulder引用“Protein”

一词来描述蛋白质。

大事记1951年Pauling采用X（射）线晶体衍射发现了蛋白质的二级结构——α-螺旋(α-helix)。1953年FrederickSanger完成胰岛素一级序列测定1962年

JohnKendrew和MaxPerutz确定了血红蛋白的四级结构。20世纪90年代以后基因组计划。第一节蛋白质的重要性和一般组成一、什么是蛋白质?蛋白质(protein)是由许多氨基酸(aminoacids)通过肽键(peptidebond)相连形成的高分子含氮化合物。1、蛋白质是生物体重要的组成成分

分布广——蛋白质分布广泛，几乎所有器官、组织都含有蛋白质；

含量高——蛋白质是生物体中含量最丰富的生物大分子。占人体干重的45％，某些组织含量更高，例如脾、肺及横纹肌等高达80％。二、蛋白质具有重要的生物学功能2、酶的生物催化作用3、调控作用参与基因调控：组蛋白、非组蛋白等参与代谢调控：如激素或生长因子等4、运动与支持机体的结构蛋白：头发、骨骼、牙齿、肌肉等5、参与运输贮存的作用血红蛋白——运输氧铜蓝蛋白——运输铜运铁蛋白——贮存铁6、免疫保护作用抗原抗体反应凝血机制7、参与细胞间信息传递信号传导中的受体、信息分子等8、氧化供能

有些蛋白质还含有少量的P、Fe、Cu、Mn、Zn、Se、I等。

C50~55%H6~7%O19~24%N13~19%S0~4%主要元素组成三、组成蛋白质的元素

各种蛋白质的含氮量很接近，平均为16％。

由于体内的含氮物质以蛋白质为主，因此，只要测定生物样品中的含氮量，就可以根据以下公式推算出蛋白质的大致含量：100克样品中蛋白质的含量(g%)=每克样品含氮克数×6.25×1001/16%蛋白质元素组成的特点凯氏定氮法：第二节

氨基酸Aminoacid一、氨基酸的结构通式

氨基酸——

组成蛋白质的基本单位。在自然界中的氨基酸有300余种，但组成人体蛋白质的基本氨基酸仅有20种。H甘氨酸CH3丙氨酸L-氨基酸的通式R

基本氨基酸中，除脯氨酸和甘氨酸外其余均属于L-α-氨基酸例外：Pro——

亚氨基酸Gly——

没有手性非极性疏水性氨基酸极性中性氨基酸酸性氨基酸碱性氨基酸二、氨基酸的分类分类依据：R侧链基团的结构及理化性质的不同1、非极性疏水性氨基酸2、极性中性氨基酸——侧链基团在中性溶液中解离后带负电荷。3、酸性氨基酸天冬氨酸asparticacidAsp2.97谷氨酸glutamicacidGlu3.224.碱性氨基酸——侧链基团在中性溶液中解离后带正电荷。组氨酸

His（H）

7.59赖氨酸Lys（K）

9.74精氨酸

Arg（R）

10.76另外：1、蛋白质中的很多氨基酸是经过加工修饰的——修饰氨基酸如：脯氨酸羟基化成羟脯氨酸

赖氨酸羟基化成羟赖氨酸2、半胱氨酸Cys常以胱氨酸的形式存在半胱氨酸+胱氨酸二硫键-HHHS-CH2-CH-COO-HS-CH2-C-COO-+NH3-OOC-CH-CH2-S+NH3S-CH2-CH-COO--OOC-CH-CH2-S+NH3S-CH2-CH-COO-+NH31.紫外吸收苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸的最大吸收峰在280nm

附近。三、氨基酸的物理性质紫外分分光度法：大多数蛋白质含有这三种氨基酸残基，所以测定蛋白质溶液280nm的光吸收值是分析溶液中蛋白质含量的快速简便的方法。芳香族氨基酸的紫外吸收1.两性离子形式氨基酸是两性电解质，其解离程度取决于所处溶液的酸碱度。氨基酸的两性离子

四、氨基酸的酸碱性质2、两性解离和等电点+OH-+H++OH-+H+pH<pI阳离子pH=pI氨基酸的两性离子

pH>pI阴离子等电点(isoelectricpoint,pI)

在某一pH的溶液中，氨基酸解离成阳离子和阴离子的趋势及程度相等，使该氨基酸分子上所带正负电荷相等，净电荷为零，成为两性离子，在电场中既不向阳极也不向阴极移动，此时溶液的pH值称为该氨基酸的等电点。3、以丙氨酸为例计算等电点

氨基酸等电点的计算

可见，氨基酸的pI值等于该氨基酸的两性离子状态两侧的基团pK′值之和的二分之一。pI=2pK´1+pK´2一氨基一羧基AA的等电点计算：pI=2pK´2+pK´R二氨基一羧基AA的等电点计算：pI=2pK´1+pK´R一氨基二羧基AA的等电点计算：总结氨基酸带点状态的判定

pI－pH<0带负电

pI－pH>0带正电

pI－pH＝0不带电等电点的计算①侧链为非极性基团或虽为极性基团但不解离的氨基酸：pI=1/2（pK1+pK2）②酸性氨基酸（Glu、Asp）及Cys：

pI=1/2（pK1+pKR）③碱性氨基酸（赖、精、组）：

pI=1/2（pK2+pKR）五、显色反应

茚三酮反应：氨基酸可与茚三酮缩合产生蓝紫色化合物，最大吸收峰在570nm。

Pro与茚三酮反应产物则呈现黄色。该反应可作为蛋白质定性、定量分析的基础。第三节肽peptide一、肽的结构与命名

肽是由氨基酸通过肽键缩合而形成的化合物。+-HOH甘氨酰甘氨酸肽键肽键(peptidebond)：是由一个氨基酸的-羧基与另一个氨基酸的-氨基脱水缩合而形成的化学键，本质为酰胺键。氨基酸残基(residue):肽链中的氨基酸分子因为脱水缩合而基团不全，被称为氨基酸残基。两分子氨基酸缩合形成二肽，三分子氨基酸缩合则形成三肽……由十个以内氨基酸相连而成的肽称为寡肽(oligopeptide)，由更多的氨基酸相连形成的肽称多肽(polypeptide)多肽链(polypeptidechain)是指许多氨基酸之间以肽键连接而成的一种结构。

N末端：多肽链中有自由氨基的一端C末端：多肽链中有自由羧基的一端多肽链有方向性：Ala-Tyr-Asp-GlyNCN端C端N末端C末端牛核糖核酸酶二、几种生物活性肽1.谷胱甘肽(glutathione,GSH)GSH过氧化物酶H2O22GSH2H2OGSSG

GSH还原酶NADPH+H+NADP+GSH有抗氧化剂的作用，可还原细胞内产生的过氧化氢

体内许多激素属寡肽或多肽

神经肽(neuropeptide)2.多肽类激素及神经肽第四节蛋白质的分类*根据蛋白质组成成分单纯蛋白质：如，血清清蛋白结合蛋白质=蛋白质部分+非蛋白质部分

如：糖蛋白、脂蛋白、金属蛋白等*根据蛋白质形状纤维状蛋白质：多为结构蛋白，难溶于水球状蛋白质：多数具有生理活性，多数可溶如酶、免疫球蛋白等等第五节蛋白质的分子结构

TheMolecularStructureofProtein蛋白质是由许多氨基酸单位通过肽键连接起来的，具有特定分子结构的高分子化合物。构象是由于有机分子中单键的旋转所形成的。蛋白质的构象通常由非共价键（次级键）来维系。蛋白质的分子结构包括一级结构(primarystructure)二级结构(secondarystructure)三级结构(tertiarystructure)四级结构(quaternarystructure)高级结构定义：蛋白质的一级结构指多肽链中氨基酸的排列顺序。(包括蛋白质分子中所有的二硫键的位置）主要的维系键：肽键，有些蛋白质还包括二硫键。一、蛋白质的一级结构蛋白质一级结构的测定分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成测定多肽链的氨基末端与羧基末端为何种氨基酸残基裂解多肽链为较小的片段测定各肽段的氨基酸排列顺序，一般采用Edman降解法一般需用数种水解法，并分析出各肽段中的氨基酸顺序，然后经过组合排列对比，最终得出完整肽链中氨基酸顺序的结果，并确定二硫键的位置。（一）蛋白质测序的策略（二）氨基酸组成的分析酸水解法：一般采用盐酸或硫酸进行水解。优点是不消旋，缺点是色氨酸完全破坏，同时天冬酰胺和谷氨酰胺的酰胺基被水解下来。碱水解法：采用氢氧化钠进行水解。但是多数氨基酸被不同程度的破坏，并产生消旋现象。但是碱性条件下，色氨酸稳定。（三）N末端和C末端氨基酸残基的鉴定1、N末端分析二硝基氟苯DNFB法丹磺酰氯DNS苯异硫氰酯PITC法氨肽酶法：从多肽链的N末端逐个向里切。氨基酸与2,4一二硝基氟苯(DNFB)的反应

（sanger反应）DNFB（dinitrofiuorobenzene）DNP-AA(黄色)++HF弱碱中氨基酸

丹磺酰氯法:在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以与N-端氨基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰-氨基酸。氨基酸与苯异硫氰酯（PITC）的反应（Edman反应）PITC（phenylisothiocyanate）+苯乙内酰硫脲衍生物(PTH-AA)（phenylisothiohydantion-AA）弱碱中(400C)(硝基甲烷400C)H+2、C末端分析肼解法羧肽酶法肼解法：此法是多肽链C-端氨基酸分析法羧肽酶羧肽酶A：释放除Pro、Arg、Lys之外的所有C末端残基羧肽酶B：只水解以碱性氨基酸Arg、Lys为C末端残基的肽键羧肽酶A和B的混合物（四）二硫键的断裂使用最普遍的方法是用过量的巯基乙醇处理，使S—S转变为—SH，同时还需要8mol/L尿素同时存在，使蛋白质变性。（五）多肽链的裂解1、酶裂解法胰蛋白酶胰凝乳蛋白酶嗜热菌蛋白酶胃蛋白酶（Phe.Tyr.Trp）（Arg.Lys）（脂肪族）胰凝乳蛋白酶胃蛋白酶弹性蛋白酶羧肽酶胰蛋白酶氨肽酶羧肽酶（Phe.Trp）2、化学裂解法溴化氰断裂：专一性断裂由甲硫氨酸残基的羧基参与形成的肽键。羟胺断裂：在pH9.0情况下专一性断裂Asn—Gly之间的肽键。（六）肽段氨基酸序列的测定Edman化学降解法①—②—③—④—⑤

—①—②—③—④—⑤

—①+②—③—④—⑤

—②—③—④—⑤

—②+③—④—⑤（七）肽段在多肽链中次序的决定第一套：Arg—Cys—Glu；His—Lys—Trp；

Met—Phe第二套：Arg—Cys；Glu—His；Lys—Trp—MetPheArg—Cys—Glu—His—Lys—Trp—Met—Phe例题有人纯化了一个未知肽，其氨基酸组成为：Asp1，Ser1，Gly1，Ala1，Met1，Phe1和Lys2，又做了一系列分析，其结果如下：（1）DNFB与该肽反应再用酸水解得DNP-Ala；（2）胰凝乳蛋白酶CT消化后，从产物中分离出一个纯四肽，其组成为：Asp1，Gly1，Lys1，Met1，此四肽的DNFB反应降解产物为DNP-Gly；（3）胰蛋白酶T消化该肽后又可以得到组分分别为Lys1，Ala1，Ser1及Phe1，Lys1，Gly1的两个三肽，以及一个二肽，此二肽被CNBr处理后游离出自由天冬氨酸。请列出八肽的全顺序并简述推导过程Ala—Ser—Lys—Phe—Gly—Lys——Met—Asp通过核酸来推演蛋白质中的氨基酸序列按照三联密码的原则推演出氨基酸的序列分离编码蛋白质的基因测定DNA序列排列出mRNA序列二、蛋白质的二级结构蛋白质分子中某一段肽链的局部空间结构，即该段肽链主链骨架原子的相对空间位置，并不涉及氨基酸残基侧链的构象

。定义

主要的维系键：氢键

由于C=O双键中的π电子云与N原子上的未共用电子对发生“电子共振”，使肽键具有部分双键的性质，不能自由旋转。蛋白质立体结构原则

肽键平面——由于肽键具有部分双键的性质，使参与肽键构成的六个原子被束缚在同一平面上，这一平面称为肽键平面或肽单元。（一）肽单元

由于α-碳原子与其他原子之间均形成单键，因此两相邻的肽键平面可以作相对旋转

(二）蛋白质二级结构的主要形式

-螺旋(-helix)

-折叠(-pleatedsheet)

-转角(-turn)

无规卷曲(randomcoil)1.α-螺旋：α-螺旋是多肽链的主链原子沿一中心轴盘绕所形成的有规律的螺旋构象

结构特征：⑴为一右手螺旋，侧链伸向螺旋外侧⑵螺旋每圈包含3.6个氨基酸残基,螺距0.54nm；⑶螺旋以氢键维系（氨基酸的N-H和相邻第四个氨基酸的羰基氧C=O之间。氢键方向与螺旋轴基本平行）

影响α－螺旋形成稳定的因素（1）侧链基团（R）（2）在有脯氨酸、羟脯氨酸存在（3）氢键的稳定性2.-折叠β-折叠是由若干肽段或肽链排列起来所形成的扇面状片层构象β-折叠包括平行式和反平行式两种类型结构特征：⑴由若干条肽段或肽链平行或反平行排列组成

片状结构；⑵主链骨架伸展呈锯齿状；⑶两个氨基酸残基之间的轴心距是0.35nm；⑷借相邻主链之间的氢键维系。3.-转角

多肽链中氨基酸残基n的氮原上的氢与残基（n+3）羰基上的氧的之间形成氢键，肽键回折180度。无规卷曲是用来阐述没有确定规律性的那部分肽链结构。无规卷曲与其他二级结构一样，也是明确而稳定的结构。

4.无规卷曲（三）二级结构测定

通常采用圆二色光谱(circulardichroism，CD)测定溶液状态下的蛋白质二级结构含量。-螺旋的CD峰有222nm处的负峰、208nm处的负峰和198nm处的正峰三个成分；而-折叠的CD谱不很固定。三、蛋白质的超二级结构及结构域蛋白质中相邻的二级结构单位（即单个α－螺旋或β－折叠或β－转角）组合在一起，形成有规则的、在空间上能辩认的二级结构组合体称为蛋白质的超二级结构基本组合方式：αα；ββ；βαβ1、超二级结构定义（supersecondarystructure）超二级结构类型ααβββαβ2、结构域大分子蛋白质的三级结构常可分割成一个或数个球状或纤维状的区域，折叠得较为紧密，各行使其功能，称为结构域(domain)。三、蛋白质的三级结构疏水键、离子键、氢键和范德华力等。主要的维系键：整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置。即肽链中所有原子在三维空间的排布位置。1、定义

肌红蛋白(Mb)N端C端

为单肽蛋白质，含有153个氨基酸，有8个螺旋区对于单一多肽链的蛋白质，三级结构是它的最高级结构，只有具有完整的三级结构，才具有全部的生物学功能。*三级结构测定X射线衍射法(X-raydiffraction)和核磁共振技术(nuclearmagneticresonance,NMR)是研究蛋白质三维空间结构最准确的方法。*用分子力学、分子动力学的方法，根据物理化学的基本原理，从理论上计算蛋白质分子的空间结构。根据蛋白质的氨基酸序列预测其三维空间结构*通过对已知空间结构的蛋白质进行分析，找出一级结构与空间结构的关系，总结出规律，用于新的蛋白质空间结构的预测。四、蛋白质的四级结构

亚基(subunit)：有些蛋白质分子含有二条或多条多肽链，每一条多肽链都有完整的三级结构，称为蛋白质的亚基

。蛋白质分子中各亚基的空间排布及亚基接触部位的布局和相互作用，称为蛋白质的四级结构。亚基之间的结合力主要是氢键和离子键。血红蛋白的四级结构

血红蛋白的四个亚基紧密结合，亚基之间的维系键是亚基之间的8个盐键第六节蛋白质结构与功能的关系TheRelationofStructureandFunctionofProtein一、蛋白质一级结构是空间构象的基础牛核糖核酸酶的一级结构二硫键

天然状态，有催化活性

尿素、β-巯基乙醇

去除尿素、β-巯基乙醇非折叠状态，无活性（二）一级结构是功能的基础1、一级结构相似的多肽或蛋白质，其功能也相似。ThrIle牛胰岛素的一级结构人胰岛素的一级结构ValAla2、一级结构与分子进化生物与人不同的AA数目黑猩猩0恒河猴1兔9袋鼠10牛、猪、羊、狗11马12鸡、火鸡13响尾蛇14海龟15金枪鱼21角饺23小蝇25蛾31小麦35粗早链孢霉43酵母44

细胞色素C

从细胞色素c的一级结构看生物进化。物种进化过程中越接近的生物，细胞色素的一级结构越相似。例：镰刀形红细胞贫血N-val·his·leu·thr·pro·glu·glu·····C(146)血红蛋白Sβ肽链血红蛋白Aβ肽链N-val·his·leu·thr·pro·val

·glu·····C(146)镰刀形红细胞正常红细胞（三）一级结构改变与分子病二、蛋白质空间结构与功能的关系肌红蛋白Mb的结构血红素的结构（一）肌红蛋白的结构与功能○肌红蛋白与氧结合

肌红蛋白的氧饱和曲线1008060402002.65.38.010.613.3kPa静脉血动脉血氧饱和度(%)（二）血红蛋白的结构与功能肌红蛋白Hb血红蛋白Mb血红蛋白T态与R态互变

氧牵引亚铁离子接近卟啉平面变构效应变构效应：由于小分子（O2）与大分子（血红蛋白Hb）亚基结合，导致蛋白质分子构象改变及功能变化的现象称为变构效应。小分子物质，称为变构效应剂肌红蛋白(Mb)和血红蛋白(Hb)的氧解离曲线肌红蛋白与血红蛋白的氧合曲线有何不同？2.65.38.010.613.3kPa*协同效应(cooperativity)一个寡聚体蛋白质的一个亚基与其配体结合后，能影响此寡聚体中另一个亚基与配体结合能力的现象，称为协同效应。如果是促进作用则称为正协同效应(positivecooperativity)如果是抑制作用则称为负协同效应

(negativecooperativity)

不同空间结构的蛋白质执行不同的功能。蛋白质执行功能时依赖于正确空间构象的形成。PrPcα-螺旋PrPscβ-折叠正常疯牛病三、蛋白质构象改变与疾病这类疾病包括：人纹状体脊髓变性病、老年痴呆症、亨停顿舞蹈病、疯牛病等。蛋白质构象疾病：若蛋白质的折叠发生错误，尽管其一级结构不变，但蛋白质的构象发生改变，仍可影响其功能，严重时可导致疾病发生。第七节蛋白质的理化性质ThePhysicalandChemicalCharactersofProtein一、蛋白质的胶体性质蛋白质属于生物大分子之一，分子量可自1万至100万之巨，其分子的直径可达1～100nm，为胶粒范围之内。*蛋白质胶体稳定的因素：颗粒表面电荷(电荷层）水化膜+++++++带正电荷的蛋白质－－－－－－－－带负电荷的蛋白质在等电点的蛋白质水化膜++++++++带正电荷的蛋白质－－－－－－－－带负电荷的蛋白质不稳定的蛋白质颗粒酸碱酸碱酸碱脱水作用脱水作用脱水作用溶液中蛋白质的聚沉蛋白质的两性电离二、酸碱性质蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液pH条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。*蛋白质的等电点(isoelectricpoint,pI)

当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点（三）蛋白质的变性、沉淀和凝固*蛋白质的变性(denaturation)在某些物理和化学因素作用下，其特定的空间构象被破坏，也即有序的空间结构变成无序的空间结构，从而导致其理化性质改变和生物活性的丧失。

造成变性的因素如加热、乙醇等有机溶剂、强酸、强碱、重金属离子及生物碱试剂等。

变性的本质——

破坏非共价键和二硫键，不改变蛋白质的一级结构。

变性蛋白质的性质改变：①物理性质：旋光性改变，溶解度下降，沉降率升高，粘度升高，光吸收度增加等；②化学性质：官能团反应性增加，易被蛋白酶水解。③生物学性质：原有生物学活性丧失，抗原性改变。

应用举例临床医学上，变性因素常被应用来消毒及灭菌。此外,防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质制剂（如疫苗等）的必要条件。

若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的构象和功能，称为复性(renaturation)。

天然状态，有催化活性

尿素、β-巯基乙醇

去除尿素、β-巯基乙醇非折叠状态，无活性*蛋白质的凝固作用(proteincoagulation)

蛋白质变性后的絮状物加热可变成比较坚固的凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中。

四、蛋白质沉淀在一定条件下，蛋白疏水侧链暴露在外，肽链融会相互缠绕继而聚集，因而从溶液中析出。变性的蛋白质易于沉淀，有时蛋白质发生沉淀，但并不变性。盐析有机溶剂沉淀重金属盐沉淀生物碱制剂或某些酸类沉淀加热变性沉淀