第八章微生物监测环境

第八章微生物监测环境第一节环境污染的指示微生物第二节污染物生物毒性的微生物学检测方法第三节污染物致突变性的微生物检测方法一、一般污染指示微生物指示微生物：在常规环境监测中，用以指示环境样品污染性质与程度，并评价环境卫生状况的具有代表性的微生物。（一）细菌总数1、定义：环境中被测样品在一定条件下培养后所得的1mL或1g检样中所含有的细菌菌落总数。反映环境中异养型细菌的污染从度，也间接反映一般营养性有机物的污染程度。2、方法（1）液态与固态对象中的细菌总数：

将经过一定倍数稀释的样品悬液，定量接种（倾注或图布）于营养平板，有氧37℃培养48h后观察菌落。（2）空气中的细菌总数：平板暴露沉降法采用直径9cm平皿在1.2m高处暴露5min，培养计数；奥氏公式：5min内落在100cm2营养琼脂平板上的细菌数和10L空气中所含的细菌数相同最小采样量和最小沉降面积（为避免出现“0”粒的概率，确保结果可靠性）。仪器法采用固体撞击式采样器。C=1000×50NA×tC－空气细菌数A－捕集面积，cm2t－暴露时间，minN－菌落数，个菌落计算方法有效菌落：无片状菌落的平皿；若片状菌落不到培养皿一半，而另一半分布又均匀，可以半皿计数再乘2代表全皿；选择平均菌落数在30～300之间进行计算；若有两个稀释度的平均符合，按两者菌落总数之比来决定，<2报告平均数，>2则报告较少的菌落总数；若均大于300（小于30），按稀释度最高（低）的平均菌落数乘以稀释倍数报告；若所有稀释度均不在30～300之间，则以最接近的报告。报告方式：<100报告实有数字；>100采用两位有效数字，余者四舍五入；无法计算时，注明稀释倍数结果：cfu/ml或cfu/g细菌总数的卫生标准生活饮用水<100cfu/ml室内空气<500～1000/m3室内空气指示菌以咽喉正常菌丛中的绿色链球菌为最合适，在上呼吸道和空气中较易发现。对方法的评价：相对性无菌水1.

稀释平板计数法—固体培养法第一步：菌样巧妙稀释得到不同稀释度（10-x）菌液菌样被无菌水不同稀释倍率后平板培养图

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各取1ml，均匀涂布于冷固体培养基平板上或与温热液态固体培养基混合冷却。第三步：培养稀释度过低，菌落密集无法计数可以计数，但数量过多，费时费力数量合适，统计计算，作为结果数量太少，误差因素太大，不做计数第二步：接种平板每一个细菌会生成一个菌落一般计数平板的细菌生长菌落数以30~300个为宜。第四步：计数细菌数量=？细菌数量=数出的菌落数/稀释度例如：10-5稀释度时菌落数为125个细菌数量=125/10-5=1.25×107个/mL

平板计数法是采用最广的一种活菌计数法如国标法水中细菌总数的测定。注意：作空白及取平行样（2～3组）均值减小误差平均（二）霉菌和酵母菌总数意义：偏酸性好氧条件，存活力强，有机营养物广泛；反映环境的一般性污染。方法：虎红培养基、察氏培养基等；倾注平板法；25-28℃3-5天。结果：cfu/ml或cfu/g卫生标准：方法评价：主要适用于霉菌，酵母菌附带生长，均非环境中全部酵母菌。二、粪便污染指示菌（一）粪便污染指示菌的理想条件：是人畜粪便中的正常菌，且数量较粪便中其他菌为多受人畜粪便污染的环境中可检出，而未受污染环境无该菌存在排出至环境后，该菌存活时间与肠道致病菌相当或略长对氯等消毒剂及其他不良因素的抵抗力略强于肠道致病菌检出与鉴定方法比较简便迅速（二）总大肠菌群是一群能在37℃，24h内发酵乳糖产酸产气，需氧或兼性厌氧的G-无芽孢杆菌；主要包括四个菌属：埃希氏菌属、柠檬酸杆菌属、克雷伯菌属、肠杆菌属；方法：多管发酵法、滤膜法。不适于用大肠菌群作为粪便污染指示菌的食品冷冻食品经射线照射处理的食品

pH较高的食品在上述食品中大肠菌群的细菌比许多肠道病原微生物更易死亡1、多管发酵法初发酵：在2个各装有已灭菌的50mL浓乳糖蛋白胨的大发酵瓶中，无菌操作加入水样100mL；在10只含5mL培养基的发酵管中加水样10mL，混匀后37℃培养24h；如无酸及气体产生，为“－”；如有酸和气体，或无气体但有酸产生，为“＋”；如有气体产生，但没产酸，溶液也不浑浊，可能是操作技术问题，须重作检验；平板分离：从阳性管中取液，分别接种在品红亚硫酸钠培养基或伊红美蓝培养基上，注意编号，

37℃培养24h。多管发酵法如无细菌增殖现象，为“－”；如仅发现芒状、霉状或其他无关菌属的菌落，为“－”；挑取符合下列特征的菌落1/3涂片、G染色、镜检；品红亚硫酸钠培养基：紫红色，具金属光泽；深红色，不带或略带金属光泽；淡红中心色较深；伊红美蓝培养基：深紫黑色，具金属光泽；紫黑色，不带或略带金属光泽；淡紫红色，中心色较深。多管发酵法复发酵试验：挑取镜检G-无芽孢杆菌的其余部分菌落，接种于含10mL普通浓度乳糖蛋白胨培养基的发酵管中，37℃培养24h，观察产酸产气；根据复发酵结果，统计出阳性管及瓶数，查表得出总大肠菌群数。多管发酵法水源水检验时水样稀释10倍，预备15支发酵管，5支装5ml浓培养基，加水样10ml；10支装10ml普通培养基，5支加水样1ml，5支加稀释水样1ml；以后检测同饮用水，根据存在的阳性管数查另外的检数表。滤膜法比发酵法缩短时间，有可能在24h内完成。孔径0.45-0.65μm，多孔性硝化纤维膜；滤膜灭菌：蒸馏水煮15min×3次；滤器灭菌：酒精棉球火焰灭菌或121℃30min；过滤水样：粗糙面向上，过滤水量的确定以培养后滤膜上长出的菌落不多于50个为原则。滤膜法水样过滤后，继续抽气5s关闭，带菌滤膜置于品红亚硫酸钠培养基上，二者之间不得留有气泡，37℃培养24h；挑取特征菌落染色镜检；G-无芽孢杆菌的穿刺接种到乳糖蛋白胨半固体培养基（预先煮沸排气），37℃培养6～8h，产气者为“＋”，培养基内部形成龟裂状，甚至部分上浮；结果与卫生标准：大肠菌群数（个/L或个/ml）；饮用水标准：0个/100ml，土壤<100个/g大肠菌群值：水样中可检出1个大肠菌群细菌的最小水样容积；土壤>10-2方法评价：发酵法耗时长、滤膜法不适于混浊度高的水样、结果可能不准确、不能指示水中细菌；来源不单一；不能指示病毒新进展：“大肠菌群产色基质试验”两个活性底物邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷及4－甲基伞形酮基-β-D葡萄糖醛酸，分别被大肠菌群的β－半乳糖苷酶和大肠杆菌的β－葡萄糖醛酸酶分解产生黄色的邻硝基苯和发荧光的化合物，24h即可完成粪大肠菌群能在44.5℃发酵乳糖的大肠菌群，亦称耐热性大肠菌群。粪大肠菌群与粪便中大肠杆菌数直接相关，且在外环境中不易繁殖，因此意义更大。方法：多管发酵法、滤膜法EC培养基：三号胆盐、胰蛋白胨、乳糖M-TEC培养基：眎蛋白胨、酵母膏、乳糖、十二烷基磺酸钠、脱氧胆盐钠、溴甲酚紫、溴酚红等粪大肠菌群结果：同总大肠菌群卫生标准：方法评价：是种较好的水中肠道致病菌的指示菌粪链球菌意义：在人粪便中数量仅次于大肠菌群细菌在水中不会自行繁殖，但抵抗力弱于致病菌为水质细菌学评价提供有意义的补充材料根据Fe/Fs（粪大肠菌群/粪链球菌）∮来推测粪便污染的来源，仅适于新鲜污染方法：多管发酵法、滤膜法Fe/Fs≥4，认为污染主要来自于人粪；≤0.7，主要来自温血动物粪便<4而>2，混合污染以人粪为主<1而>0.7，混合污染以动物粪便为主产气荚膜梭菌∮意义：存在于人及温血动物粪便中，具有芽孢的厌氧杆菌；具有较强抵抗力，特别适用于含有毒物质的水体方法：多管发酵法、滤膜法、倾注法蛭弧菌∮意义：天然寄生菌，对污染的指示滞后，其指示污染可弥补大肠菌群的不足。方法：自来水双层琼脂平板法产气荚膜梭菌蛭弧菌第三节其他指示微生物致病菌的指示菌沙门氏菌志贺氏菌铜绿假单胞菌金黄色葡萄球菌链球菌破伤风梭菌肠炎沙门氏菌志贺氏菌铜绿假单胞菌产色素的铜绿假单胞菌金黄色葡萄球菌链球菌破伤风梭菌肠道病毒的指示微生物脊髓灰质炎病毒选用理由：脊髓灰质炎病毒疫苗株对环境压力相对稳定，抵抗力较其它病毒强，操作相对安全，与其他病毒比较易从环境样品中检测到浓缩方法：滤膜法、氢氧化铝吸附沉淀法、聚乙二醇脱水透析法检测方法：蚀斑实验、免疫学法噬菌体f2选用理由：与肠道病毒基本性状相似，核酸均为RNA，理化性质相近；存在于人类粪便中，在水和污水中存在的数目多于肠道病毒；对外环境和氯的耐受力与肠道病毒相似或稍强；检测方法简单检测方法：空斑定量测定法不足之处：在人粪便中数量不多；DNA大肠杆菌噬菌体在人类粪便中经常存在，并可能在水环境中繁殖，易掩盖或混淆。作为肠道病毒污染指标不理想，可作为消毒效果评价指标第二节

污染物生物毒性的微生物学检测方法

一、原核微生物检测法发光细菌——细菌生物发光抑制试验细菌发光的生物学机制：NADH2FMN细胞色素O2虫荧光色素酶O2，醛激活的虫荧光色素酶虫荧光色素酶+光（一）细菌生物发光抑制试验试验原理环境条件不良或有毒物存在时，因细菌荧光素酶活性或细胞呼吸受到抑制，发光能力受影响而减弱，其减弱程度与毒物的毒性大小和浓度成一定比例关系常用明亮发光杆菌“Microtox”法，是目前国际通用、使用最为广泛的污染物毒性微生物学检测方法细菌生物发光抑制试验试验方法菌种复苏：加入2％NaCl，稳定1～2h样品处理：样品稀释并调pH6~8，同时调溶液的渗透压使之含2％NaCl。毒性测定：定量加入菌液和样品，15℃培养5或10min，直接读出光量抑制百分率求不同剂量及其IR之间的回归方程，计算IC50冻干菌种：白色粉末状，含4％发光菌细胞，2％NaCl，保护剂和缓冲物质，－20～－25℃备用，有效期一年IR＝阴性对准组指标值－实验组指标值阴性对准组指标值×100％阳性有机对照－苯酚阳性无机对照－Zn2+阴性对照－蒸馏水细菌生物发光抑制试验质量控制同一剂量平行测定管间的发光强度差异值应<20％100mg/L苯酚的IC50,5min应为13～26mg/L100mg/LZnSO4•7H2O的IC50,15min应为3～10mg/L 细菌生物发光抑制试验方法评价与传统鱼类96h毒性试验有良好的一致性灵敏、快速，自动化程度高各实验室间重现性好，变异系数10～20％，明显好于传统鱼类96h毒性试验目前“Microtox”已有效地应用于化学物质的定量构效关系研究（二）硝化细菌——硝化作用抑制试验试验原理毒物抑制硝化作用的酶类导致亚硝化或硝化细菌对底物的利用能力或产物生产量下降。通过测量底物或产物的变化来检测污染物毒性作用的程度试验方法：方法评价：灵敏度与“Microtox”相当，但结果相关性较差菌种增至108个/ml定量加入菌液、NaNO2溶液、不同浓度样品，蒸馏水做对照30℃培养4h，定时取样分析NO2-含量随时间变化，得出硝化作用强度比较样品组与对照组，可得IC50二、真核微生物检测法（一）藻类——生长抑制试验试验原理：常用硅藻、栅藻、小球藻等，生长迅速，对水质变化敏感，通过测定其生长量来反应水质污染情况或物质毒性程度试验方法：藻体生长量；释出氧量；摄取14C量；细胞DNA及ATP测定结果评价与标准：藻细胞最大生长速率与对照相比降至50％以下，且呈剂量反应关系时，即可认为受试物有毒性作用（二）原生动物——微尺度群落级毒性试验试验原理：在正常条件下自然界水环境的微型生物群落种类、分布与构成均有一定规律。在外界环境因素的干扰下，群落的平衡被破坏，结构特征也随之变化。通过分析相关的微型生物群落结构参数，即可判断水环境的质量状况或污染物质的毒性特征。具有很强的生态学意义。原生动物——微尺度群落级毒性试验聚氨酯泡沫塑料块（PFU）法作为微型动物的生态岛，其上原生动物群集速度随种类上升而下降，两者交叉点及为平衡点，达到平衡时间取决于环境条件据报道：孔径100～150μm，厚度5cm，规格5×6.5×7.5cm3为好，可依靠垂坠物悬挂在任何水层据报道：其挤出液可见到水体中大约85％的原生动物种类，可以反映整个群落动态变化的全过程和基本趋势原生动物——微尺度群落级毒性试验试验方法与评价：一般情况下，随着污染程度的升高，原生动物种类数（S）会减少，多样性指数（d）会降低，Seq会下降；在一个以异养型生物为主的水体中，异养型指数（HI）高，表示存在有机污染，此时群集速度常数（G）会增大，T90会缩短三、活性污泥毒性检测法脱氢酶活性试验试验原理：活性污泥中微生物的脱氢酶类能使被氧化有机质的氢原子活化并传递给特定的氢受体，反映活性污泥对污水中有机质的氧化分解能力。毒性物质的存在会抑制脱氢酶的活性，可通过指示剂的还原变色速度来确定脱氢酶的活性，以判断毒性物质的作用强度。常用指示剂为TTC（氯化三苯基四氮唑），它受氢后变为红色TF（三苯基甲臜）（485nm）脱氢酶活性试验试验方法：TF标准曲线的制作驯化的活性污泥经离心洗涤制成悬浮液在测定管中定量加入悬浮液、Tris-HCl缓冲液、样品、TTC等，以蒸馏水做对照37℃水浴避光反应显色，加浓硫酸终止加入丙酮萃取TF，离心上清液485nm比色，得TF产生量，计算脱氢酶活性酶活：指酶催化化学反应的能力，衡量标准是酶促反应速度的大小，用单位时间内底物的消耗量或产生生成量来表示呼吸抑制试验试验原理：废水中有毒物质可以抑制微生物的呼吸，使其耗氧量和CO2产生量下降，下降的程度与毒性物质的浓度和强度有关试验方法：传统的瓦勃氏呼吸仪法和目前的直接测定DO法结果评价：相对好氧速率＝污泥的呼吸耗氧速率内源性呼吸耗氧速率×100％四、微生物学检测法评价简便灵敏快速经济结果的差异性结果的变异性与哺乳动物试验互为补充第三节

污染物致突变性的微生物检测方法一、基因突变试验二、DNA损伤修复试验三、DNA重组试验四、微生物致突变试验与致癌物的确定一、基因突变试验鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体酶试验（Ames试验）应用与评价：良好的环境致突变物与潜在致癌物初筛报警Ames试验已被我国食品安全性毒理学评价程序、农药登记毒理学试验方法、新药（西药）毒理学研究指导原则、化妆品安全性评价程序和方法、食品功能毒理学评价程序和检验方法等列为评价致突变性的必做试验鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体酶试验（Ames试验）原理：人工诱变的鼠伤寒沙门氏菌株，又称TA（his）菌株，是组氨酸营养缺陷型菌株，在致突变物的作用下，能发生回复突变为野生型根据该菌在特殊培养基上的生长能力，判断受试物是否具有致突变性哺乳动物肝匀浆中含微粒体混合功能氧化酶，对间接致突变物有生物活化作用鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体酶试验（Ames试验）常用菌株：TA97、TA98、TA100、TA102①组氨酸依赖性，+表示需要②深粗糙型脂多糖屏障丢失，+表示缺失，有抑菌③紫外线损伤修复基因缺陷，+表示缺失，无修复能力④抗氨苄青霉素因子，+表示有⑤抗四环素质粒，+表示有鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体酶试验（Ames试验）实验设计：菌株选择：TA97、TA98、TA100、TA102溶剂选择：根据受试物的理化性质，水溶性的最好用灭菌双蒸水，非水溶的一般常用二甲基亚砜（DMSO），每皿有机溶剂用量不得超过0.1ml鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体酶试验（Ames试验）剂量选择：在0.2~500μg/皿之间选择2或3个剂量，常用为0.2、2、20、500μg/皿。有杀菌作用的包括一个最低杀菌浓度，有沉淀的包括一个最小沉淀浓度，诱变阴性的包括一个最大溶解浓度，无杀菌作用的最高检测浓度至少应为500μg/皿。受试溶液应新鲜配制阳性对照物的选择：必须同时做阳性对照，用以检定菌株的回变性和特异性以及S-9混合液的效果鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体酶试验（Ames试验）试验设计的严密性：受试物最少应设三个剂量，以便观察剂量反应关系，同时设阳性对照、阴性对照和溶剂对照。阴性对照可反应菌株的自发回变情况，溶剂对照可排除溶剂引起突变的可能性。同一样品必须做加S-9混合液和不加S-9混合液的试验。试验时，每份样品（包括对照）均应做三个平行样，至少应做2次重复试验，方可正式报告结果鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体酶试验（Ames试验）培养基：S-9液取材：选用200g左右、健康雄性Sprague-Dawley系大鼠或150g左右、健康雄性Wister大鼠。营养肉汤培养基（增菌用）：含牛肉膏、蛋白胨Vogel-Bonner氏液：含多种无机盐底层琼脂（供细菌生长）：含V-B液、葡萄糖顶层琼脂（致突变试验）：含生物素、组氨酸鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体酶试验（Ames试验）营养琼脂（鉴定菌株特性）氨苄青霉素平皿（鉴定R因子）：含V-B液、葡萄糖、生物素、组氨酸、氨苄青霉素组氨酸/生物素平皿（鉴定His）：含V-B液、葡萄糖、生物素、组氨酸Master平板（短期保存菌种）：含V-B液、葡萄糖、生物素、组氨酸、氨苄青霉素鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体酶试验（Ames试验）试验方法：纸片点试法：定性试验结果评价：如果仅在平板上出现少量的散的菌落认为是阴性致突变物。如果浸有受试物的纸片周围长出较多密集的回变菌落与空白对照有明显区别者，可判定该受试物为阳性致突变物纸片周围回变菌落数<20，为“-”纸片周围回变菌落数<100，为“+”纸片周围回变菌落数<200，为“++”纸片周围回变菌落数<500，为“+++”纸片周围回变菌落数>500，为“++++”鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体酶试验（Ames试验）平皿渗入法：定量试验结果评价：阳性结果的判断：渗入试验必须同时获得下列结果，才能确定测试物为阳性致突变物背景菌落生长良好测试皿回变菌落数比对照皿回变菌落数增加2倍以上有剂量反应关系试验结果有重现性鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体酶试验（Ames试验）阴性结果的判断：渗入试验必须同时获得下列结果，才能确定测试物为阴性致突变物对于纯化学受试物，当试验浓度达500μg/皿（或对测试菌株最大无抑制用剂量）仍未见阳性结果者，±S-9试验结果阴性不同菌株试验结果均为阴性重复检验也均为阴性鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体酶试验（Ames试验）注意事项无菌操作。本试验全部操作必须严格无菌，所使用的溶液、培养基、器材等必须经过灭菌，以防其它细菌或霉菌污染测试菌株的菌液必须是新培养的新鲜菌液，每ml活菌数不得少于2×108个。菌株在使用前应进行鉴定试验中所用的阳性对照物对人体有害，操作时，应加强个人防护应有良好的、具通风换气设备的实验室鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体酶试验（Ames试验）注意事项一切带有测试菌的器皿，用后立即高压灭菌，若来不及灭菌则放在加盖容器内，严防任何小动物特别是老鼠接触所用有机溶液必须重新蒸馏。低温蒸馏必须用水浴及专用蒸馏器，并在通风柜内进行，严防明火接触，以免发生火灾使用的蒸馏水必须是重蒸水。配试剂及培养基要用新蒸的蒸馏水，保证一切溶剂无致突变物污染。所有器皿最后也应用新蒸出的蒸馏水洗净发光细菌试验原理：发光细菌的自发暗变异株与致突变物接触后，可恢复一定强度的发光能力。应用与评价：与Ames试验检测遗传毒性物质所反应的遗传毒性水平具有较好的一致性；美国Microbics公司标准化方法“Mutatox”发光细菌试验方法：步骤：菌株复苏→增菌→分装→20℃振荡24h→开始测定发光强度（每隔3~4h）结果判定：待测样品管发光强度是对照管3倍为阳性结果；样品管5个平行系列中阳性结果≥3，待测物具致突变性；不足3个为可疑；无阳性结果可认为不具有致突变性其他基因突变试验营养缺陷型菌株回复突变试验：类似于Ames试验细菌的正向突变试验：正向突变比回复突变的DNA有更多位点可以发生突变，可以检测更为广泛的化合物粗糙脉孢菌的正向突变试验：真核真菌，用于检测基因的正向和回复突变构巢曲霉的突变试验：第二节DNA损伤修复试验SOS显色试验SOS修复：“易错性DNA修复”，靠这种修复形成的DNA聚合酶由于识别碱基的精确性低，易造成复制的差错，进而引起突变原理：致突变因素作用于DNA产生的某些损伤可诱导细菌SOS修复系统的反应，通过检测SOS修复的能力来查明理化因素是否具有致突变、致癌的特性；可用特定菌株分解特定物质产生色素来反应其中酶的合成水平∮β-半乳糖苷酶分解Xgal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)和β－ONPG（邻硝基苯-β-D-半乳糖苷），分别产生蓝色不溶性色素和黄色可溶性色素SOS显色试验方法：检测细菌细胞原发直接的SOS反应，即用产色底物来监测大肠杆菌SOS修复反应；纸片法定性，液体法定量应用与评价：与Ames的敏感性、准确性相当，且操作简单、快速、经济、方便、不受测试菌株存活数的影响；可将二者互为补充共同作为研究遗传毒物的初筛试验聚合酶缺陷型菌株试验原理：多数致癌物质可与DNA结合使之发生一定的改变和损伤，而微生物具有修复DNA的功能；将同一受试物作用于具有修复能力的野生型菌株和缺乏修复能力的变异株，则微生物的生长可能出现差异；聚合酶缺陷型菌株DNA受损后即不能修复，细菌无法生存聚合酶缺陷型菌株试验菌株：E.coli

P3478（polA-）和E.coli

W3110（polA+）方法：点试法比较抑菌圈或划线接种带应用与评价：只对具有直接致突变作用的烷化物较为敏感对需要代谢活化的化合物如芳香胺、多环烃等不敏感，加肝匀浆活化系统亦效果不佳在液体培养基中测定对某些原致癌物检出率有所提高重组缺陷型菌株试验原理：利用检验重组修复能力来判断致突变性菌株：枯草芽孢杆菌重组缺陷型菌株－Bac.subtilis

M45（recA-）和对照菌株Bac.subtilis

H17（recA+）方法：点试法比较抑菌圈或划线接种带应用与评价：在无代谢活化条件下比Ames敏感在有代谢活化条件下检出率比Ames低溶源性细菌试验原理：溶源性细菌细胞受到某些诱变剂作用时，产生SOS修复，使菌体内原噬菌体活跃起来，在菌体内大量繁殖，使细菌发生裂解而释放；在固体培养基上裂解非溶源性细菌形成噬菌斑菌株：溶源性E.coli

K12（λ）和非溶源性E.coli

K12（S）方法：将两种菌液按一定比例同时接种于一个平板，放入受试物过夜培养观察应用与评价：可用于测定复杂混合物的潜在遗传毒性第三节DNA重组试验酿酒酵母的有丝分裂基因转变可测定致突变物质所致的缺陷型等位基因的转变异点等位基因二倍体的酵母菌株在其同一基因座位有两个不同的缺陷型等位基因，其存在导致一定的营养要求在致突变物损伤DNA，导致整个基因组的有丝分裂重组增强，基因转变随之发生，一个突变型整段转移取代另一突变型等位基因中有缺陷的核苷酸顺序，将其中一个基因恢复成野生型等位基因第四节微生物致突变试验与致癌物的确定ICPEMC于1983年提出致突变试验的遗传学终点分为5类DNA完整性的改变DNA重排或交换DNA碱基序列改变染色体完整性改变染色体分离改变目前没有一种致突变试验能涵盖所有的遗传学终点。ICPEMC认为需选用一组试验配套进行检测，包括5种遗传学终点。如选用Ames试验、微核试验、枯草杆菌DNA修复试验和外周血淋巴细胞姊妹染色单体互换（SCE）试验4个项目即可满足要求第十九章微生物监测技术的新发展第一节分子生物学技术在环境微生物监测中的应用第二节微生物传感器在环境监测中的应用第一节分子生物学技术在环境微生物监测中的应用分子生物学技术与环境微生物的分类、鉴定、监测传统方法难以及时动态监测，实验室培养使其偏离原生境，甚至改变可能基因组合多聚酶链反应核酸杂交技术核酸多态性技术rRNA、rDNA序列分析基因芯片技术微生物醌指纹法多聚酶链反应（PCR）试验原理：模拟天然DNA复制过程，在体外扩增特异性DNA片段基本要素：模板、引物、原料、DNA聚合酶应用：快速、灵敏、简便、特异产物可用凝胶电泳定性定量，也可进行克隆、转化或测序目前用于环境细菌、毒素、病毒及其他微生物的检测多聚酶链反应（PCR）试验方法模板DNA变性：90~95℃模板DNA分子与引物结合：45~72℃引物的延伸：72℃上述变性－复性－延伸称为一个PCR循环，DNA扩增量呈指数上升实际反应中因引物量减少、原料及酶浓度改变、终产物反馈抑制等原因不能达到理论值多聚酶链反应（PCR）核酸杂交技术探针：是能与特定核苷酸序列互补、已经标记的DNA（或RNA