第六章仪器分析荧光分析法

第6章荧光分析法用荧光抗体染色之原生动物澳大利亚科学家最新发现，一种叫“螳螂虾”的海里动物通过发出色彩鲜艳的荧光来恐吓警告敌对者或者吸引性配偶，

主要内容基本原理1荧光分光光度计2分析方法3概述荧光：物质分子吸收光子能量被激发后从激发态的最低振动能级返回到基态时所发射出的光。荧光分析法特点：灵敏度高，比UV-Vis的灵敏度高得多；选择性好；应用不广泛，主要是因为能发荧光的物质不具普遍性。荧光分析法：根据物质的荧光谱线位置和强度进行物质鉴定和物质含量测定的方法。概述分子和原子均可产生荧光：X射线荧光分析法——原子受X射线激发原子荧光分析法——原子特征谱线激发荧光分析法——紫外-可见光激发概述基态分子吸收一定能量后，跃迁至激发态，当激发态分子以辐射跃迁形式将其能量释放返回基态时，便产生分子发射光谱。依据激发的模式不同，分子发光分为光致发光（按激发的类型又可分为荧光和磷光两种）、热致发光、场致发光和化学发光等。光致发光：分子、原子吸收光辐射时被激发，然后再发射出与吸收的波长相同或更长光的现象。

按分子激发态的类型划分时，由第一激发单重态所产生的辐射跃迁而伴随的发光现象称为荧光。

由最低的电子激发三重态所产生的辐射跃迁，其发光现象称为磷光。概述1.1基本原理（1）分子中电子的激发过程

在每个电子能级上，都存在振动、转动能级。1.基本原理

基态(S0)→激发态(S1、S2、激发态振动能级)：吸收特定频率的辐射；量子化；跃迁一次到位。

激发态→基态：多种途径和方式；速度最快、激发态寿命最短的途径占优势。1.基本原理在光致激发和电激发光的过程中，分子中的价电子可以处在不同的自旋状态，可用电子自旋状态的多重性来描述。多重性(multiplicy,M)：电子自旋的状态单重态(singletstate,Sn)：分子中所有电子自旋都相反，自旋配对的电子态(M=1)三重态(tripletstate,Tn)：分子中电子对的电子自旋平行的电子态(M=3)1.基本原理电子激发态的多重性：M=2S+1

S为电子自旋量子数的代数和(0或1)；大多数有机分子的基态处于单重态（Pauli不相容原理）。

1.基本原理分立轨道上的平行自旋比成对自旋稳定(洪特规则)，三重态能级比相应单重态能级低。S0→S1、S2允许跃迁；S0→T1

禁阻跃迁；通过其他途径进入；进入的几率小；1.基本原理1.基本原理（2）分子荧光的产生

处于激发态分子不稳定，通常以辐射跃迁方式或无辐射跃迁方式去活化过程返回至基态。辐射跃迁方式荧光发射：处于第一激发单重态的最低振动能级的分子以辐射跃迁的形式返回基态各振动能级（S1→S0跃迁）时，产生荧光。磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级→基态（T1

→S0跃迁）。1.基本原理振动弛豫：同一电子能级内以热能量交换形式由高振动能级至低相邻振动能级间的跃迁。内转换：能量差较小的激发态之间，部分能量重叠，激发态由高电子能级转移至低电子能级的无辐射能级交换。外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转移能量的非辐射跃迁；外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。体系间跨越：不同多重态,有重叠的振动能级间的非辐射跃迁。无辐射跃迁方式1.基本原理1.基本原理

电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量；

激发态停留时间短、返回速度快的途径，发生的几率大，发光强度相对大；1.基本原理辐射跃迁荧光延迟荧光磷光内转移外转移系间跨越振动弛预无辐射跃迁传递途径1.基本原理（3）荧光和磷光的区别发光机制发光时间发光波长应用面荧光单重态单重态10-8-10-14s能量大，波长较短广泛磷光三重态单重态10-4-10s能量小，波长较长采用液氮在冷冻条件下检测1.2荧光光谱的类型和特征1）激发光谱和发射光谱任何因荧光化合物都具有两种特征光谱：

激发光谱和发射光谱1.基本原理荧光激发光谱（激发光谱）

通过测量荧光体的发光通量随波长变化而获得的光谱，它反映了不同激发光引起荧光的相对效率。激发光谱可供鉴别荧光物质，在进行荧光测定时供选择适宜的激发波长。1.基本原理荧光发射光谱

又称荧光光谱，如果激发光的波长和强度保持不变，而让荧光物质所产生的荧光通过发射单色器后，照射于检测器上，扫描发射单色器并检测各种波长下相应的荧光强度，然后通过记录仪记录荧光强度对发射波长的的关系曲线，所得到的谱图。荧光光谱表示在所发射的荧光中各种波长组分的相对强度。荧光光谱可供鉴别荧光物质，并作为在荧光测定时选择适当的测定波长或滤光片的根据。1.基本原理激发λ、ε荧光λ图形激发光谱变不变F~λex图发射光谱不变变F~λem图激发光谱：反应了不同激发波长激发荧光的相对效率；发射光谱：反应了不同发射波长激发荧光的相对效率。1.基本原理2）荧光光谱特征①Stokes位移在溶液中，分子荧光的发射相对于吸收位移到较长的波长，称为Stokes位移。这是由于受激分子通过振动弛豫而失去转动能，也由于溶液中溶剂分子与受激分子的碰撞，也会有能量的损失。因此，在激发和发射之间产生了能量损失。1.基本原理②荧光发射光谱的形状与激发波长无关

因为分子吸收了不同能量的光子可以由基态激发到几个不同的电子激发态，而具有几个吸收带。在荧光发射时，不论用哪一个波长的光辐射激发，电子都从第一电子激发态的最低振动能层返回到基态，所以荧光发射光谱只有一个发射带，与激发波长无关。1.基本原理③荧光光谱与激发光谱的镜像关系通常荧光发射光谱和它的吸收光谱呈镜像对称关系。吸收光谱是物质分子由基态激发至第一电子激发态的各振动能层形成的。其形状决定于第一电子激发态中各振动能层的分布情况。1.基本原理1.基本原理1.3影响荧光强度的因素（1）荧光效率与荧光产生的条件1）荧光寿命当激发停止后,分子的荧光强度降到激发时最大强度的1/e所需的时间称为荧光寿命，常用f表示。一般荧光物质的εmax为103~105，所以荧光寿命常为10-10~10-8s,利用分子荧光寿命的差别，可以进行荧光混合物的分析。1.基本原理2）荧光效率激发态分子发射荧光的光子数与基态分子吸收激发光的光子数之比，常用f表示：f(0~1)，f大的有荧光发射1.基本原理①强紫外-可见吸收②一定的荧光效率

π→π*跃迁强吸收带

n→π*跃迁弱吸收带存在共轭的π→π*跃迁，f高，荧光强度大。3）产生荧光的必备条件1.基本原理①共轭效应提高共轭度利于增加荧光效率并产生红移。绝大多数能产生荧光的物质都含有芳香环或杂环，因为芳香环或杂环分子具有长共轭的π→π*跃迁。π电子共轭程度越大，荧光强度（荧光效率）越大，而荧光波长也长移。

（2）影响荧光强度的结构因素1.基本原理②分子的刚性与共平面性在同样的长共轭分子中，分子的刚性和共平面性越大，荧光率越大，并且荧光波长产生长移。多数具有刚性平面结构的有机分子具有强烈的荧光。因为这种结构可以减少分子的振动，使分子与溶剂或其它溶质分子的相互作用减少，也就减少了碰撞去活的可能性。1.基本原理1.基本原理③取代基效应取代基的性质对荧光体的荧光特性和强度均有强烈影响。苯环上的取代基会引起最大吸收波长的位移及相应荧光峰的改变。通常给电子基团，如-NH2、-OH、-OCH3、-NHCH3

和-N(CH3)2

等，使荧光增强。因为产生了p-共轭作用，增强了电子共轭程度，使最低激发单重态与基态之间的跃迁几率增大。吸电子基团，如－Cl、－Br、－I、-NHCOCH3、－NO2

和－COOH，使荧光减弱。具有刚性结构的分子容易产生荧光。1.基本原理（3）影响荧光强度的外部因素①温度温度升高，荧光物质的荧光效率和荧光强度下降。

其中一个原因是分子的内部能量转化作用。当激发分子接受额外热能时，有可能使激发能转换为基态的振动能量，随后迅速振动弛豫而丧失振动能量。另一个原因是碰撞频率增加，使外转换的去活几率增加。1.基本原理溶剂极性增大，荧光波长随着而长移，荧光强度增强。这是因为在极性溶剂中，ππ*跃迁所需的能量差△E小，而且跃迁几率增加，从而使紫外吸收波长和荧光波长均长移，强度也增强。②溶剂1.基本原理溶剂粘度减小，荧光强度减弱。溶剂粘度减小时，可以增加分子间碰撞机会，使无辐射跃迁增加而荧光减弱。故荧光强度随溶剂粘度的减小而减弱。由于温度对溶剂的粘度有影响，一般是温度上升，溶剂粘度变小，因此温度上升，荧光强度下降。②溶剂1.基本原理③pH值的影响带有酸性或碱性官能团的大多数芳香族化合物的荧光与溶液的pH有关。具有酸性或碱性基团的有机物质，在不同pH值时，其结构可能发生变化，因而荧光强度将发生改变；对无机荧光物质，因pH值会影响其稳定性，因而也可使其荧光强度发生改变。

对于金属离子与有机试剂形成的发光鏊合物，一方面pH会影响鏊合物的形成，另一方面还会影响鏊合物的组成，因而影响它们的荧光性质。1.基本原理④

荧光熄灭剂的影响荧光熄灭是指荧光物质分子与溶剂分子或溶质分子相互作用引起荧光强度降低的现象。引起荧光熄灭的物质称为荧光熄灭剂。常见的荧光熄灭剂有卤素离子、重金属离子、氧分子、硝基化合物、重氮化合物、羰基化合物、羧基化合物。1.基本原理在浓度较高的荧光物质溶液中，单重激发态的分子在发生荧光之前和未激发的荧光物质分子碰撞而引起的自熄灭现象。i.碰撞猝灭有些荧光物质分子在溶液浓度较高时会形成二聚体或多聚体，使它们的吸收光谱发生变化，也引起溶液荧光强度的降低或消失。ii.静态息灭1.基本原理小部分光子和物质分子相碰撞，使光子的运动方向发生改变而向不同角度散射。⑤

散射光的干扰瑞利光：光子和物质发生弹性碰撞，不发生能量交换，只是光子运动方向发生改变。其波长与入射光波长相同。拉曼光：光子和物质发生非弹性碰撞，发生能量交换，光子把部分能量转移给物质分子或从物质分子获得部分能量。从而发射出比入射光稍长或稍短的光。1.基本原理散射光对荧光测定有干扰，尤其是波长比入射光波长更长的拉曼光，与荧光波长接近，对测定的干扰大，必须采取措施消除。拉曼光的干扰主要来自溶剂，当溶剂的拉曼光与被测物质的荧光光谱相重叠时，应更换溶剂或改变激发光波长。1.基本原理2.1荧光分光光度计由光源、单色器、液槽、检测器和信号显示记录器五部分组成。（1）激发光源氙灯光源：波长范围250~800nm连续光谱。是应用最广泛的光源。高压汞灯光源：光谱略呈带状常用荧光分析光源：

氙灯，高压汞灯。2.荧光分光光度计（2）单色器（3）样品池选择激发光波长的第一单色器选择发射光(测量)波长的第二单色器低荧光的玻璃或石英方形适用于90°测量（4）检测器（5）读出装置光电倍增管2.荧光分光光度计

(1)灵敏度校正

(2)波长校正

(3)激发光谱和荧光光谱的校正

2.荧光分光光度计2.2仪器的校正3.1荧光强度与物质浓度的关系F

∝

（I0－I）F:荧光强度

Io:入射光强度

I：出射光强度F

=K′（I0－I）根据比尔定律：I=I0×10－cl低浓度时，（cl≤0.05）F=Kc3.分析方法3.2定量分析方法①

标准曲线法用已知的标准物质经过和试样同样的处理后，配成一系列标液。测定标液的荧光强度，用荧光强度对标液浓度绘制标准曲线，然后根据试液的荧光强度，在标准曲线上求出试样中荧光物质的含量。3.分析方法②

比例法纯物质：cs、FS

FS－F0=Kcs试液：

cx、Fx

FX－F0=Kc