第五章紫外可见分光光度法

第五章紫外可见分光光度法

UltravioletandVisible(UV-Vis)Spectrophotometry

1第五章紫外可见分光光度法第一节分子吸收光谱概述；第二节

光吸收基本定律；第三节仪器部件及其类型；第四节显色反应及其影响因素第五节定性分析和定量分析方法及其应用。25.1概述一、分子吸收光谱的形成1.过程：运动的分子外层电子--------吸收外来辐射------产生电子能级跃迁-----分子吸收谱。2.能级组成：除了电子能级(Electronenergylevel)外，分子吸收能量将伴随着分子的振动和转动，即同时将发生振动(Vibration)能级和转动(Rotation)能级的跃迁！据量子力学理论，分子的振-转跃迁也是量子化的或者说将产生非连续谱。34分子的三种能级跃迁示意图

分子吸收外来辐射能后，其能量改变（ΔE）为：ΔE=ΔEe+ΔEv+ΔEr对多数分子而言，ΔEe

（电子）约为1-20ev，紫外可见ΔEv

（振动）约为0.05-1ev，近红外、中红外区ΔEr

（转动）小于0.05ev，远红外、微波区ΔEe>ΔEv>ΔEr5二、物质对光的选择性吸收●物质的颜色由物质与光的相互作用方式决定。●人眼能感觉到的光称可见光，波长范围是：400~760nm。●让白光通过棱镜，能色散出红、橙、黄、绿、蓝、紫等各色光。●单色光：单一波长的光●复合光：由不同波长的光组合而成的光，如白光。●光的互补：若两种不同颜色的单色光按一定比例混合得到白光，

称这两种单色光为互补色光，这种现象称为光的互补。6分子吸收现象CuSO4溶液吸收黄色光,其溶液呈现出蓝色；KMnO4分子强烈地吸黄绿色光，对其他颜色的光吸收很少或不吸收，溶液呈紫红色。问题：Na2SO4溶液无色透明,其分子吸光情况?

CuS(固态)呈黑色，其分子吸光又如何？700nm530nm420nm580nm470nm620nm7物质的颜色：是由于物质对不同波长的光具有选择性吸收而产生。

即物质的颜色是它所吸收光的互补色。无色溶液：透过所有颜色的光有色溶液：透过光的颜色黑色：吸收所有颜色的光白色：反射所有颜色的光物质的本色8

基于物质吸收紫外或可见光引起分子中价电子跃迁、产生分子吸收光谱与物质组分之间的关系建立起来的分析方法，称为紫外-可见吸光光度法（UV-vis）三、紫外-可见吸光光度法特点（1）灵敏度高，可测到10-7g/ml。（2）准确度好，相对误差为1%-5%，满足微量组分测定要求。（3）选择性好，多种组分共存，无需分离直接测定某物质。（4）操作简便、快速、选择性好、仪器设备简单、便宜。（5）应用广泛，无机、有机物均可测定。91011三、电子跃迁的类型

121.-*跃迁能量差大所需能量高吸收峰在远紫外(<150nm)

甲烷:125nm；乙烷:135nm2.-*跃迁能量差较小所需能量较低吸收峰紫外区(200nm左右)3.n-*跃迁能量较低收峰紫外区(200nm左右)（与-*接近）三甲基胺(CH3)3N-的n-*吸收峰在227nm134.n-*跃迁能量低吸收峰在近紫外、可见区(200~700nm)含有杂原子的不饱和基团，如-C=O，-CN等各种跃迁所需能量大小次序为：

-*>n-*

-*>n-*14基本概念1、生色团具有轨道的不饱和官能团称为发色团。有“共轭大键”（离域键）时，与*间的能量差减小，生色作用大大增强。2、助色团

本身不“生色”，但能使生色团生色效应增强的官能团。含有孤对电子的基团：

—NH2—OH—SH153、红移和紫移红移：吸收峰向长λ移动的现象；紫移：吸收峰向短λ移动的现象；增强效应：吸收强度增强的现象；减弱效应：吸收强度减弱的现象。

16四、

吸收光谱

吸收光谱(吸收曲线):吸光度（A）~波长（）吸收峰：曲线上比左右相邻处都高的一处；

max：吸收程度最大所对应的

谷：曲线上比左右相邻处都低的一处；

min：最低谷所对应的；肩峰：介于峰与谷之间，形状像肩的弱吸收峰；17吸收曲线示意图

18五、无机化合物的吸收光谱1、金属离子：d电子跃迁稀土离子：f电子跃迁2、配合物电荷转移

Fe3+—SCN-Fe2+—SCNhv195.2Lambert-Beer定律一、透射比和吸光度I0=Ia+It+IrI0——入射光强度Ia

——吸收光强度It——透过光强度Ir

——反射光强度20

若吸收池的质量和厚度都相同，则Ir

基本不变，在具体测定操作时Ir

的影响可互相抵消（与吸光物质的c及b

无关）：

I0=Ia+It

采用空白溶液作为参比：测量前在比色皿中装上空白溶液，测量此时的透过光强度It。21对光吸收程度表示：透光率：T=It/I0

吸光度：A=lg(1/T)=lg(I0

/It)T=10%时，A=1.0空白测定：设定空白溶液的吸光度为0，即透过率T＝100％。22二、Lambert-Beer定律

——光吸收基本定律“

Lambert-Beer定律”是说明物质对单色光吸收的强弱与吸光物质的浓度（c）和液层厚度（b）间的关系的定律，是光吸收的基本定律，是紫外-可见光度法定量的基础。23Lambert-Beer定律推导24A=

lc吸收介质之间没有相互作用吸光度具有加合性25Lambert定律：A=k'lBeer定律：A=k"cLambert-Beer定律：A=klc当c用g/L、b

用cm为单位时，k用吸光系数a

表示，单位为L/g·cm当c用mol/L、b

用cm为单位时，k用摩尔吸光系数表示，单位为L/mol·cm

26光吸收定律的有关名称和符号27吸光度的加和性

设某一波长（）的辐射通过几个相同厚度的不同溶液c1，c2···cn，其透射光强度分别为I1，I2···In，根据吸光度定义：这一吸光体系的总吸光度为：

A=lgI0/In

A1+A2+···+An=lgI0/I1+lgI1/I2+···+lgIn-1/In=lgI0/In

A=lgI0/In=A1+A2+···+An28三、引起偏离Lambert-Beer定律的因素

1.吸收定律本身的局限性

稀溶液中才能成立（吸收介质之间没有相互作用）2.化学因素

Cr2O42-+H2O2CrO42-+2H+

3.仪器因素（非单色光的影响）4.其它光学因素：散射和反射、非平行光295.3紫外-可见分光光度计

一、主要部件

光

源

单色器

信号输出

检测器

样品池301.光源：提供入射光的装置；（1）钨灯或碘钨灯

>350nm，可见光（2）氢灯或氘灯：

150~400nm，紫外光（3）氙灯

200~700nmUVregionVisibleregion312.单色器：色散元件：光栅狭缝准光镜聚焦元件光源色散元件入射狭缝323.吸收池：

光学玻璃吸收池

——只能用于可见区

石英吸收池

——可用于紫外及可见区334.检测器：硒光电池光电管光电倍增管二极管阵列photochathodeanodehighvoltagevoltagedividernetworkdynodeslightelectrons34LightLensEntranceSlitRotatingGratingExitSlitDetectorMeasureonewavelengthbandatatime.Serialdetectionscheme.ArrayDetectorMeasurealargerangeofwavelengthssimultaneously.Paralleldetectionscheme.355.显示器：电表指针数字显示荧光屏显示电脑36二.分光光度计的类型

1.单波长、单光束分光光度计（721、722、752型等）一个单色器；一种波长的单色光；一束单色光。2.单波长双光束分光光度计从一个单色器获取一个波长的单色光用切光器分成二束强度相等的单色光，消除了光源不稳定性。373.双光束双波长分光光度计二个单色器得到二个波长不同的单色光。两束波长不同的单色光（

1、

2

）交替地通过同一试样溶液（同一吸收池）后照射到同一光电倍增管上，最后得到的是溶液对

1和

2两束光的吸光度差值∆A。38SinglebeamDoublebeamDoubleλ,doublebeamSourceλselectorSampleTransducerOutputSourceλselectorSampleTransducerOutputBlankSourceλ2selectorTransducerOutputλ1selectorSample39三、分光光度计的校正通常在实验室工作中，验收新仪器或实验室使用过一段时间后都要进行波长校正和吸光度校正。建议采用下述的较为简便和实用的方法来进行校正：A.镨铷玻璃或钬玻璃都有若干特征的吸收峰，可用来校正分光光度计的波长标尺，前者用于可见光区，后者则对紫外和可见光区都适用。B.也可用K2CrO4标准溶液来校正吸光度标度。40§5—4显色反应及其影响因素一．显色反应和显色剂：（一）显色反应：在光度分析中将试样中的待测组分转变成有色化合物的反应叫显色反应。显色反应一般分为两大类：一类是配位反应；另一类是氧化还原反应。Fe3＋＋SCN－=FeSCN－；Mn2＋－5e＋4H2O=MnO4－＋8H＋在这两类反应中，用得较多的是配位反应。41（二）显色剂：与待测组分生成有色化合物的试剂叫显色剂；1．无机显色剂：许多无机试剂能与金属离子形成有色化合物，如铜离子与氨可生成深蓝色的化合物。但由于多数无机显色剂的选择性和灵敏度不够高，所以无机显色剂用的比较少。其中较好的，现在还在使用的无机显色剂主要有硫氰酸盐、钼酸盐、过氧化氢等少量几种。422．有机显色剂：1）优点：

a．具有鲜明的颜色，ε都很大（一般可达到104以上），所以测定的灵敏度很高；b．生成的一般为螯合物，稳定性很好，一般离解常数都很小；c．选择性好d．有些有色配合物易溶于有机溶剂，可进行萃取光度分析，提高了测定的灵敏度和选择性。433．常见的有机显色剂：1．磺基水杨酸：其结构式如下：它可用于测定三价铁离子。442．邻二氮菲（邻菲罗啉，1，10—二氮菲）：结构式为：直接在PH=3～9时与Fe2+生成红色螯合物。用于铁的测定。453．双硫腙：也叫二苯—硫腙。结构式为：测定很多重金属离子，如：铅、锌、铜、银、汞、镉等。46二．选择显色反应的标准：1．选择性要好：2．灵敏度要高：3．有色化合物的组成要恒定，化学性质稳定。4．显色剂的颜色与有色化合物的颜色差别要大5．反应的条件要易于控制。47三．影响显色反应的因素：（一）显色剂用量：显色反应就是将待测组分转变成有色化合物的反应，其反应一般可用下式代表：M＋R=MR反应具有一定的可逆性，当加入过量R的用量时，有利于反应向右进行。48但要注意，加入的显色剂用量也不能太多，否则产生副反应，对测定产生不利。例如：用SCN-与Fe3+反应生成红色配合物测定铁时，当加入的显色剂太多时，就会对测定产生不利。对于不同的情况，显色剂的用量对显色反应的影响是不同的。在实际选用时，一般是通过实验来确定的。49实验的方法为：固定待测组分的浓度和其它条件，分别加入不同量的显色剂，分别测定它们的吸光度，以吸光度为纵坐标，显色剂用量为横坐标作图，可得到吸光度—显色剂用量的曲线，其结果分为三种情况：50（二）溶液酸度：酸度对显色反应的影响很大，因为溶液酸度直接影响着金属离子、显色剂的存在形式和有色化合物的组成、稳定性等。1．酸度对金属离子存在形式的影响：很多高价金属离子都要水解，酸度较低时，不利于显色反应的进行。512．酸度对显色剂浓度的影响：很多显色剂都是有机弱酸，在溶液中有如下平衡：HRH+＋R－而显色反应为M＋RMR所以酸度太高对反应不利。523．酸度对显色剂颜色的影响：很多显色剂本身就是酸碱指示剂，酸度不同时，它们的颜色不同。如果控制不好酸度，就会使指示剂颜色与有色化合物的颜色相近而影响测定。比如：用二甲酚橙为显色剂，它与金属离子形成的配合物为红色，它本身在PH<6.3时为柠檬黄色，而在PH＞6.3时为红紫色。所以在PH＞6.3时，就无法进行测定。534．酸度对配合物组成的影响：有些显色反应当酸度不同时，要生成配位比不同的配合物，其颜色也有所不同。如：Fe3+与水扬酸的配合物：PH＜4 Fe(C7H4O3)+

紫色4＜PH＜9 Fe(C7H4O3)2－ 红色PH＞9 Fe(C7H4O3)

33－黄色由上可见，酸度对显色反应的影响是很大的，适宜的酸度要由实验来确定。54（三）显色时间：显色反应的速度有快有慢，快的几乎是瞬间完成，颜色很快达到稳定状态，并且能保持较长时间。大多数显色反应的速度是比较慢的，需要一定时间才能达到稳定。而且有些有色化合物放置过久也会褪色。适宜的显色时间要由实验来确定。55（四）温度：一般显色反应在室温下进行，但是也有一些反应要加热到一定温度下才能进行。而且还有一些有色配合物在室温下要分解。（五）溶剂的影响：1．影响有色化合物的溶解度；2．影响有色化合物的颜色；3．影响显色反应进行的速度；56（六）干扰离子的影响和消除方法：

1．与试剂生成有色配合物及大量干扰离子与试剂生成稳定的配合物；2．干扰离子本身有色；3．与被测离子形成难离解化合物。57消除干扰的方法主要有以下几种：1．控制酸度：2．加入掩蔽剂；3．分离干扰离子；4．进行同时测定；5．利用氧化还原反应改变价态；6、用参比溶液消除显色剂和某些共存有色离子的干扰；7、选择适当的波长；8、分离：以上方法均不奏效时，采用预先分离的方法。58二．测量条件的选择：1．测量波长的选择：一般选用待测物质的最大吸收波长作为测量波长（入射光）但当在最大吸收波长处有干扰时，则应根据“吸收最大干扰最小”的原则来选择波长。592．控制适当的吸光度范围：由测量误差可知，当吸光度在0.2～0.8之间时，测量误差最小，所以应尽量控制吸光度在此范围进行测定。控制的方法为：1）控制溶液的浓度；2）选用适当厚度的比色皿；60

3．选择适当的参比溶液：a.如果仅有显色剂与被测组分反应的产物有吸收，则可以用纯溶剂作参比溶液；b.如果显色剂和其他试剂有颜色，则用试剂溶液作参比液；c.如果显色剂与试剂中干扰组分反应，其反应产物有吸收，则按如下方式配置参比液：(1)吸收较弱时，直接用试剂溶液作参比液；(2)吸收较强时，可选用合适的掩蔽剂将被测组分掩蔽后再加显色剂和其他试剂，以此配制的溶液作参比液。61§5—5紫外—可见分光光度法的应用一．紫外-可见分光光度法在定性分析中的应用（一）定性分析：（二）结构分析：62（三）分析方法：

1．比较光谱法，2．制作试样的吸收曲线并与标准紫外光谱对照；3．利用Woodward-Fieser经验规则求最大吸收波长。631.定性分析(辅助方法)

在相同的条件下测定相近浓度的待测试样和标准品的溶液的吸收光谱，然后比较二者吸收光谱特征：吸收峰数目及位置、吸收谷及肩峰所在的位置等；分子结构相同的化合物应有完全相同的吸收光谱。641、Woodward-Fieser规则计算共轭二烯、多烯烃及共轭烯酮类化合物跃迁最大吸收波长的经验规则。共轭二烯、多烯烃:共轭烯酮类化合物:2、Scott规则类似于Woodward-Fieser规则，用于计算芳香族羰基衍生物的跃迁最大吸收波长的经验规则。65共轭二烯、多烯烃类化合物跃迁最大吸收波长计算

基值217nm基值253nm66增加一个共轭双键30环外双键5每个烷基取代5-O-乙酰基0-O-R6-S-R30-Cl,-Br5-NR260溶剂校正值067基值253nm环外双键5nm烷基取代(3×5)15nm273nm

68基值253nm环外双键5nm烷基取代(4×5)20nm共轭系统延长30nm308nm

692.14有两种异构体，α异构体的吸收峰在228nm(ε=14000)，而β异构体的吸收峰在296nm(ε=11000)。试指出这两种异构体分别属于下面两种结构中的哪一种。(1)(2)70二、结构分析1、判别顺反异构番茄红素、偶氮苯反式异构体的lmax和emax大2、判别互变异构烯醇式——酮式烯醇式的lmax和emax大712），不饱和酮最大吸收位置的计算值六元环或非环，不饱和酮基准值215nm位移增量（nm）同环共轭双键39

环外双键（C=C）5

延伸双键3072共轭体系上取代基α：10；β：12；

γ位或更高位：18

OCORαβγδ：6OHα：35；β：30；γ：50

Clα：15：β：12Brα：25；β：30NR2β：9573

基值

217四个烷基取代4520二个环外双键2510计算值(max)247nm实测值(max)247nm74三、定量分析半定量：比色法75定量分析方法的依据是Lambert-Beer定律（一）单组分定量1.标准曲线法：配制一系列（5~10）个不同c的标准溶液，在适当

(通常为max)下，以适当的空白溶液作参比，分别测定A，然后作A-c

曲线同条件下测定试样溶液吸光度Ax，查找对应的cx

。2.直接比较法：已知试样溶液基本组成，配制相同基体、相近浓度的标准溶液，分别测定吸光度A标、A样

76（二）多组分定量吸光度具有加合性的特点。混合组分的吸收光谱相互重叠的情况不同，测定方法也不相同，常见混合组分吸收光谱相干扰情况有以下三种：

771.第一种情况：各种吸光物质吸收曲线不相互重叠或很少重叠，则可分别在1及2处测定a

及

b组分的c；2.第二种情况：部分重叠，先在1

处测得

ca，再在2处测得混合组分的吸光度Aa+b

，根据吸收定律加和性：

Aa+b(2)

=Aa(2)

+Ab(2)

=a(2)

·b·ca+b(2)

·b·

cb应先求得a(2)与b(2)

，并使用相同b,即可求得cb。3.第三种情况：两吸收曲线互相重叠78如何提高分光光度法的检测极限？A=ebc

或c=A/eb，欲使待测组分浓度c尽可能小，决定于以下因素①可准确测量的吸光度A值愈小:这始终是仪器制造商追求的目标，目前，高精度分光光度计可准确测量到0.0001吸收单位。②增大吸收池光程:用1～4m全反射长光路毛细吸收管用于天然水中超痕量磷，可测至0.1ppt级。③增大有色化合物的e:目前，有不少二元或三元配合物的显色反应生成的有色络合物的e为105级,少数达106级。可以估算出常规分光光度法的极限测定浓度:

假定可准确测量的A=0.0001,采用5cm的比色皿