项目四发酵工业的无菌操作

项目四

发酵工业的无菌操作发酵工业污染的防治策略发酵工业无菌操作的基本概念发酵工业的无菌操作技术发酵培养基及设备管道灭菌空气除菌一、发酵工业污染的防治策略什么是染菌？即“杂菌污染”，是指在发酵培养中侵入了除菌种外，有碍生产的其他微生物。（一）污染的危害杂菌大量消耗培养基中的营养物质，使生产菌的生产能力下降杂菌产生的代谢产物，增加了发酵液中杂质类型或改变了发酵液理化性质，从而导致增加了下游产物分离纯化的难度，造成产物收率降低或产品质量下降。（降低发酵产率、提取得率、产品质量）杂菌代谢会改变培养体系的pH，使发酵过程异常。杂菌的代谢可能会降解产物，使产物得率降低。若细菌的培养过程中被噬菌体污染，细菌细胞会破裂，造成发酵失败。1.染菌对不同发酵过程的影响A．细菌谷氨酸：发酵周期短，培养基不太丰富，较少染杂菌，但噬菌体威胁大。肌苷：缺陷型生产菌，培养基丰富，易染菌，营养成分迅速被消耗，严重抑制菌生长和合成代谢产物。（1）染菌对不同菌种发酵的影响B.霉菌

PenG：青霉素水解酶上升，PenG迅速破坏，发酵一无所获。

柠檬酸：pH2.0，不易染菌，主要防止前期染菌。

C.酵母菌:易污染细菌以及野生酵母菌

D.疫苗：无论污染的是活菌、死菌或内外毒素，都应全部废弃。

2023/2/3（2）染菌种类对发酵的影响2023/2/3青霉素：怕染细短产气杆菌链霉素：怕染细短杆菌、假单孢杆菌和产气杆菌四环素：怕染双球菌、芽孢杆菌和荚膜杆菌柠檬酸：怕染青霉菌肌苷（酸）：怕染芽孢杆菌谷氨酸：怕染噬菌体，易造成连续污染2.染菌发生的不同时期对发酵的影响种子培养期发酵前期发酵中期发酵后期（1）种子培养期染菌菌体浓度低、培养基营养丰富，较易染菌，应严格控制。若将污染的种子带入发酵罐，则损失更大，因此一经发现，应立即灭菌丢弃，并对种子罐、管道等进行仔细检查和彻底灭菌。

采用备用菌种或以无污染的适当菌龄的发酵罐内的发酵液作为种子，接入新鲜培养基中进行发酵。2.染菌发生的不同时期对发酵的影响（2）发酵前期染菌发酵前期易染菌，且危害很大，需特别注意防止一旦发现染菌，如原料营养还比较丰富，则进行重新灭菌、接种发酵；如已消耗较多营养物质，则放掉部分料液、补充新鲜培养基，重新灭菌、接种发酵。2.染菌发生的不同时期对发酵的影响（3）发酵中期染菌中期染菌会造成发酵异常，产物产量下降，应尽力做到早发现、快处理。可通过加入一部分发酵旺盛的培养料，调节通风、温度、pH等措施挽救，如发酵单位到达一定水平则可提前放罐。2.染菌发生的不同时期对发酵的影响（4）发酵后期染菌后期染菌对抗生素、柠檬酸发酵影响不大，但对氨基酸、核苷酸等破坏较大。发酵后期如染菌量不多，可继续发酵。如染菌严重，破坏性较大，可提前放罐。2.染菌发生的不同时期对发酵的影响3.染菌程度对发酵的影响发酵罐中的杂菌数量越多，即染菌程度越大，则对发酵的危害越大。如生产菌大量繁殖后，发酵物中含少量杂菌，如每升发酵液中有1-2个杂菌，一般对发酵没有什么影响。4.染菌对产物提取和产品质量的影响对过滤的影响染菌后特别是污染细菌后，发酵液一般发粘，导致过滤困难。可采取加热、添加助滤剂等措施，或加絮凝剂使蛋白质沉淀，有利于过滤。4.染菌对产物提取和产品质量的影响对提炼与产品质量的影响染菌发酵液中含有较多水溶性蛋白和其它杂质。增加提炼难度，增加产物提取成本，降低产物纯度。4.染菌对产物提取和产品质量的影响二、杂菌污染的防治某药厂链霉素发酵染菌原因分析1.污染杂菌的检测检查杂菌的方法，要求准确可靠和快速，这样才能在短时间内获得效果，主要方法有：

显微镜检查平板划线检查肉汤培养检查发酵过程异常观察前3种检查法未发现染菌，还不能肯定未被染菌；原因是以上检查法只能检查杂菌浓度较大的染菌情况（>1个/ml）发酵过程的异常现象菌体生长差；pH值过高或过低；溶解氧水平异常；泡沫过多；菌体浓度过高或过低；CO2排放异常溶解氧水平异常变化显示染菌发酵时间溶氧浓度正常发酵污染噬菌体发酵时间溶氧浓度正常发酵污染好气性杂菌污染嫌气性杂菌CO2异常显示染菌工艺一定，尾气中CO2量变化有一定规律污染杂菌，糖耗加快，尾气中CO2量增加污染噬菌体，糖耗减慢，尾气中CO2量减少2.污染噬菌体的检测噬菌体是什么？噬菌体是病毒的一种，是一种极微小的生物，体积是细菌的1/1000左右，它可以通过细菌过滤器，只有在电子显微镜下才能看到。26消除潜在的污染隐患-1涉及菌体相关的操作要尽可能在生物安全柜中进行；在菌体培养过程中，尽量不要打开瓶口。如果实在需要打开瓶口的话，必需在无菌的环境下操作。生物安全柜和超净台应注意清洁和消毒；每年更换HEPA过滤膜。27使用胶头、移液器、电动移液器吸取溶液后，不能水平放置，以防液体进入。一旦液体进入要及时更换滤膜，并做好消毒措施。消除潜在的污染隐患-228消除潜在的污染隐患-3普通大肠杆菌的转化及划线后平板建议用石蜡膜完全密封后培养和放置。29消除潜在的污染隐患-4菌液培养时将盖拧紧30消除潜在的污染隐患-5菌体相关垃圾处理：生物安全柜或处理菌体的超净台应配备密封垃圾桶，以防止污染源外泄；带有菌体的垃圾要做到当日灭菌；如果当日不能灭菌，应使用垃圾袋密封后放置。31消除潜在的污染隐患-6分光光度计周围：菌体相关的废液建议收集到专门密闭容器，每日灭菌；盛放过菌液的比色皿应注意清洗，清洗液同上处理。32消除潜在的污染隐患-7高压灭菌后的枪头，务必烘干使用33消除潜在的污染隐患-8玻璃器皿特别是菌体培养用器具使用前用铝箔包裹后，在180℃干热灭菌。34消除潜在的污染隐患-9培养装置应经常清洗消毒；水浴摇床中的水要经常更换，长时间不用要将水排空，擦拭干净放置。35消除潜在的污染隐患-10在培养时最好使用无菌的棉塞（不要使用铝箔覆盖培养瓶）；不要使用潮湿或脏的瓶塞。灭菌时培养时36消除潜在的污染隐患-11接触菌体频率高，空隙多容易隐匿菌体的器具要经常清洗消毒。StandsCentrifuge&it’srotor37消除潜在的污染隐患-12脏的移液器反复使用的电击槽与噬菌体污染的培养液接触过的电极或buffer3.污染原因的分析染菌原因分析就是总结染菌的教训，防范于未然。主要染菌原因：①

种子带菌②无菌空气带菌③设备渗漏

④灭菌不彻底⑤操作失误⑥技术管理不善（1）染菌的时间分析种子培养阶段：种子，灭菌，操作；发酵前期：种子，灭菌，操作；发酵后期：空气，补料，设备渗漏，泡沫（2）染菌的杂菌种类分析：污染耐热芽孢杆菌：培养基或设备灭菌不彻底；污染不耐热杂菌：种子带菌、空气除菌不彻底、设备渗漏或操作问题；污染浅绿色菌落杂菌：冷却盘管渗漏引起；污染霉菌：无菌室灭菌不彻底，或操作问题；污染酵母菌：糖液灭菌不彻底。（3）染菌的规模分析大批量发酵罐染菌：种子、空气；

前期：种子带菌，灭菌问题；

中后期：空气带菌；部分发酵罐染菌：个别发酵罐连续染菌：设备渗漏（1）种子带菌及其防止原因

：菌种培养或保藏过程染菌、培养基及用具灭菌不彻底、菌种移接过程污染措施：严格控制无菌室污染，严格无菌操作；种子保存管的棉花塞应有一定的紧密度，且有一定的长度；培养和保存温度不宜有太大变化；菌种培养基或器具进行严格的灭菌处理；每一级种子培养物均应经严格检查，确保未受污染后才能使用4.杂菌污染途径及预防（2）空气带菌及其防止空气的净化工艺和设备的设计过滤介质的选用和装填过滤介质的灭菌和管理等（3）培养基和设备灭菌不彻底染菌及防止

原料含较多菌未充分排除罐内空气灭菌温度、时间未控制好设备、管道存在死角原料性状：淀粉质原料，升温过快或混合不均匀，易结块，团块中包埋的活菌不易杀灭；可升温前搅拌和加淀粉酶。实罐灭菌时未充分排除罐内空气：造成假压，升温时，应打开排气等阀门放气。连续灭菌时，蒸汽压力波动大，培养基未达到灭菌温度，导致灭菌不彻底。D.设备和管道存在“死角”

死角：由于操作、设备结构、安装或人为造成的屏障等原因，引起蒸汽不能有效到达或不能充分到达预定应该到达的局部灭菌部位，从而不能达到彻底灭菌的要求。常见的设备、管道“死角”发酵罐的“死角”：不锈钢衬里破裂造成死角，发酵罐罐底脓疱状积垢。2023/2/3法兰连接不当造成的“死角”2023/2/3灭菌时蒸汽不易通达的“死角”及其消除方法（4）设备渗漏染菌及防止原因发酵罐、补糖罐、冷却盘管、管道阀门等，因加工制作不良或遭受腐蚀等原因而形成微小漏孔后发生渗漏染菌。措施选用优质材料、科学合理加工、经常检查。（5）操作失误染菌及防止淀粉原料采用实罐灭菌，大颗粒应先筛去，再搅拌均匀，加入一定量淀粉酶液化或糖化后灭菌。在灭菌升温时，要打开排气阀门，排尽罐内冷空气。严防泡沫升顶，可添加消泡剂防止泡沫的大量产生。严格控制灭菌温度，避免蒸汽压力的波动过大。发酵过程越来越多采用自动控制，控制仪器如用化学试剂灭菌，一定要彻底。（6）噬菌体污染及其防治

染噬菌体对发酵的影响发酵过程如受噬菌体侵染，一般发生溶菌，随之出现发酵迟缓或停止，而且往往会反复连续感染，使生产无法进行，甚至使种子全部丧失，对发酵威胁很大。

噬菌体污染根本原因生产中把活菌体排放到环境中，造成了自然界中相应噬菌体大量增殖。这些噬菌体随风沙尘土和空气流动到处传播，有可能潜入生产的各个环节，尤其是通过空气系统进入种子室、种子罐、发酵罐。噬菌体的防治严禁活菌体排放，切断噬菌体的“根源”；净化生产环境，消灭污染源；保证纯种培养，严防种子本身带噬菌体，特别是溶源性噬菌体；轮换使用菌种或使用抗性菌株。2、染菌的处理染菌后处理染菌后必须对所有相关原料、仪器设备、管道等进行彻底灭菌。尽量查明染菌原因，以免重复污染。3.污染原因分析主要原因：①

种子带菌②无菌空气带菌③设备渗漏④灭菌不彻底⑤操作失误⑥技术管理不善从污染时间看：早期污染可能与①②④⑤→接种操作不当有关；后期污染可能与③⑤及中间补料有关。从杂菌种类看：耐热芽孢杆菌：与④有关球菌、无芽孢杆菌：与①②③⑤有关浅绿色菌落的杂菌：与水有关，即冷却盘管渗漏霉菌：与④⑤有关，即无菌室灭菌不彻底或操作问题酵母菌：糖液灭菌不彻底或放置时间较长

2023/2/3从染菌幅度看：各个发酵罐或多数发酵罐染菌，且所污染的是同一种杂菌，一般是空气系统问题，若个别罐连续染菌，一般是设备问题。2023/2/31）从污染杂菌的种类分析污染耐热芽孢杆菌：培养基或设备灭菌不彻底；污染不耐热杂菌：种子带菌、空气除菌不彻底、设备渗漏或操作问题；污染浅绿色菌落杂菌：冷却盘管渗漏引起；污染霉菌：无菌室灭菌不彻底，或操作问题；污染酵母菌：糖液灭菌不彻底。2）从污染时间分析发酵前期染菌：种子带菌、培养基或设备灭菌不彻底、操作不当或空气带菌；发酵后期染菌：中间补料污染、设备渗漏或操作问题。3）从染菌程度分析多个罐染菌：种子带菌、空气系统问题；个别罐染菌：设备问题、操作不当。采取哪些措施能够保持无菌发酵？物料、培养基、中间补料要灭菌；发酵设备及辅助设备（空气过滤装置、各种发酵罐进出口连接装置）和管道要灭菌；好气发酵通入的空气要除菌；种子无污染；接种无菌操作过关；为了保持发酵的长期无菌状态，需维持正压。2023/2/3三、发酵工业的无菌操作技术加热灭菌法1辐射灭菌法2化学药品灭菌法3过滤除菌法4二、发酵工业无菌操作的基本概念灭菌：用物理或化学的方法杀死物料或设备中所有的微生物。消毒：用物理或化学的方法杀死空气、地表以及容器和器具表面的微生物。

防腐:用物理或化学方法杀死或抑制微生物的生长和繁殖

。

二、发酵工业无菌操作的基本概念消毒与灭菌的区别消毒概念来自于卫生工作，仅仅是杀灭生物体或非生物体表面的微生物，而灭菌则是杀灭所有的生命体。因此，消毒一般只能杀死营养细胞，不能杀死细胞芽孢及真菌孢子，适合于发酵车间的环境和设备、器具的无菌处理。灭菌则适合培养基等物料的无菌处理。（一）加热灭菌法1.干热空气灭菌法在干燥环境（干热空气）进行灭菌的技术。灭菌温度/°C170160150140121灭菌时间/min60120150180过夜表1干热空气灭菌需要的温度和时间适用于玻璃、陶瓷、金属等制品。2.湿热灭菌法湿热灭菌法是指用饱和水蒸气、沸水或流通蒸汽进行灭菌的方法，以高温高压水蒸气为介质，由于蒸汽潜热大，穿透力强，容易使蛋白质变性或凝固，最终导致微生物的死亡，所以该法的灭菌效率比干热灭菌法高，是药物制剂生产过程中最常用的灭菌方法。湿热灭菌法的类型煮沸灭菌法巴氏消毒法间歇灭菌法高压蒸气法（1）煮沸灭菌法营养细胞——水中煮沸15~20min；芽孢——水中煮沸1~2h。适用于一般食品及器材的灭菌。（2）巴氏消毒法亦称低温消毒法，冷杀菌法，是一种利用较低的温度既可杀死病菌又能保持物品中营养物质风味不变的消毒法。70℃，保持15~30min，杀死病原菌和部分微生物营养体。巴氏杀菌机（3）间歇灭菌法利用反复多次的流通蒸汽加热，杀灭所有微生物，包括芽胞。方法同流通蒸汽灭菌法，但要重复3次以上，每次间歇是将要灭菌的物体放到37℃孵箱过夜，目的是使芽胞发育成繁殖体。若被灭菌物不耐100℃高温，可将温度降至75℃～80℃，加热延长为30～60分钟，并增加次数。适用于不耐高热的含糖或牛奶的培养基。4.高压蒸汽法适用行业：发酵工业、医疗保健、食品检测、微生物实验室等。适用范围：培养基、发酵罐以及附属设备和管道、玻璃器皿、工作服等的灭菌。方法：

121℃，103.42kPa，15~20min

生产中使用高压蒸汽灭菌锅的型号很多：手提式压力灭菌器立式压力灭菌器卧式蒸气高压灭菌锅注意事项灭菌包不宜过大过紧，灭菌器内物品的放置总量不应超过灭菌器柜室容积的85%。各包之间留有空隙，以便于蒸汽流通、渗入包裹中央，排气时蒸汽迅速排出，保持物品干燥。盛装物品的容器应有孔，若无孔，应将容器盖打开。布类物品放在金属、搪瓷类物品之上。灭菌锅密闭前，应将冷空气充分排空。随时观察压力及温度情况。注意安全操作，每次灭菌前，应检查灭菌器是否处于良好的工作状态。灭菌完毕后减压不要过猛，压力表回归“0”位后才可打开盖或门。3.火焰灭菌法采用火焰直接灼烧灭菌。适用范围：接种针、试管口、三角瓶口等。（二）射线灭菌射线灭菌是利用高能量的电磁辐射和微粒辐射来杀死微生物。常用的射线是紫外线和电离辐射。1.紫外线（ultraviolet，UV）：波长136nm～390nm的紫外线（包括日光中的紫外线）具有杀菌作用，以260nm左右的最强，与嘌呤和嘧啶的吸收光谱高峰一致。紫外线可使DNA链上相邻的两个胸腺嘧啶共价结合而形成二聚体，阻碍DNA正常转录，导致微生物的变异或死亡。紫外线穿透力较弱，普通玻璃、纸张、尘埃、水蒸汽等均能阻档紫外线，一般用于手术室、病房、实验室的空气消毒。紫外线可损伤皮肤和角膜，应注意防护。2023/2/32023/2/32.电离辐射：包括γ射线、X射线和加速电子等，对各种微生物均有致死作用，细菌繁殖体对射线比芽胞要敏感。其机制是直接或者通过产生游离基，破坏DNA分子的共价键。辐射源常用同位素钴60，用于一次性医用塑料制品批量灭菌。2023/2/3（三）化学药品灭菌法常用试剂有过氧化氢、过氧乙酸、环氧乙烷、卤素、甲醛、高锰酸钾、季铵盐（如新洁尔灭）、臭氧等。些物质易与微生物细胞中的一些成分产生化学反应，如使蛋白质变性、酶类失活、破坏细胞膜通透性而杀灭微生物。2023/2/3由于化学试剂也会与培养基中的一些成分作用，而且加入培养基后不易去除，它不能用于培养基的灭菌，但染菌后的培养基可用化学药剂处理。常见的化学灭菌剂（见表4-4）

2023/2/3来苏尔（Lysol）为甲酚、植物油、氢氧化钠的皂化液（含甲酚50%）。无色或黄色液体。使用方法和范围：1~2%溶液用于手消毒（也可用于处理染菌桌面），3~5%溶液用于器械物品消毒，5~10%溶液用于环境、排泄物的消毒。对一般致病菌包括抗酸菌杀菌效果确实，对芽孢则需高浓度长时间才有杀菌作用。2023/2/3新洁尔灭，别名为苯扎溴铵，为溴化二甲基苄基烃铵的混合物。创面消毒用0.01%溶液，皮肤及粘膜消毒用0.1%溶液，手术前洗手用0.05%～0.1%溶液浸泡5分钟；手术器械消毒用0.1%溶液(内加0.5%亚硝酸钠以防生锈)煮沸15分钟,再浸泡30分钟。2023/2/3（四）过滤除菌过滤除菌法是利用过滤方法阻截微生物以达到除菌的目的。

适用于热敏性物质和空气的除菌。是将液体或气体用微孔薄膜过滤，使大于孔径的细菌等微生物颗粒阻留，从而达到除菌目的。用于遇热容易变性而失效的试剂或培养液。

2023/2/3四、发酵培养基及设备管道灭菌工业上对培养基、发酵设备、管道、阀门、流加物料等都采用蒸汽灭菌。（一）湿热灭菌湿热灭菌是指利用饱和蒸汽灭菌的方法。原理：借助蒸汽释放的热能，尤其是饱和蒸汽冷凝时瞬间内释放的大量潜热，可使微生物菌体细胞温度迅速升高，促使蛋白质、酶和核酸分子内部的化学键（尤其是氢键）受到破坏二引起不可逆变性，造成微生物死亡。适用范围：培养基、设备、管路及阀门的灭菌。优点：灭菌效果可靠、彻底；蒸汽来源容易，本身无毒，操作方便、费用低，易管理等。缺点：对营养成分的破坏较强。葡萄糖灭菌温度过高会产生糠醛，培养基颜色变深，糠醛对菌体生长不利。如果培养基中的葡萄糖浓度很低，就不用单独灭菌，如果葡萄糖很高，培养条件又很严格，就单独灭菌。量少的话过滤，量多的话，实验室一般115度灭菌15min足够了，工厂一般115度20~30min。影响灭菌的因素：灭菌时间；灭菌温度；其他因素（如培养基成分、培养基的物理状态、pH值、搅拌、泡沫等）发酵工业上最常用的灭菌条件：121°C，30min。相关概念：致死温度：杀死微生物的极限温度称为致死温度。致死时间：在致死温度下，杀死全部微生物所需要的时间称为致死时间。一般认为灭菌彻底与否的是以能否杀死芽孢细菌为标准。（二）分批灭菌定义：培养基的分批发酵是指将配制好的培养基放在发酵罐或其他贮存容器中，通入蒸汽，将培养基及所用设备一起灭菌的操作过程，也称为间歇灭菌或实罐灭菌（实消）。适用范围：中小型发酵罐优点：设备要求简单，无需另外设置加热冷却装置；操作要求低，适合手动操作；适合于小规模生产；适合于固体物质含量大的培养基灭菌。缺点：升温降温较慢，培养基营养物质损失较多，灭菌后培养基质量会下降；灭菌过程需反复进行加热和冷却，能耗较高；间歇式操作，发酵罐利用率较低；不适合于大规模生产的培养基灭菌。丰原生化操作步骤配料罐空气分过滤器灭菌；配制培养基，准备灭菌；通入蒸汽，升温；灭菌：121°C，0.1MPa，保温30min左右；保温结束，降温。条件的确定

分批灭菌包括升温、保温和降温三个阶段。灭菌主要是在保温过程中实现的。注意事项培养基的配置应注意计量准确，所配置的培养基体积应扣除种子液的体积和灭菌过程冷凝水的预留体积；实消前，先空消，并校正pH、DO等传感电极