模块二光合色素的提取、分离

光合色素的提取、理化性质

分离、吸收光谱及含量的测定模块二模块实验2/3/2023实验背景１２３４５2/3/2023Caution!I光合色素的提取与理化性质2/3/2023I光合色素的提取与理化性质2/3/2023实验目的掌握光合色素的提取方法以及了解有关的理化性质。实验原理光合色素能溶于具有一定极性的有机溶剂，如丙酮、乙醇等。提取液中无任何电子受体，因此可以观察荧光现象。离体叶绿素在有氧气和光照条件下，发生光氧化作用，结构遭到破坏，形成加氧叶绿素等产物。叶绿素是一种双羧酸酯，可以发生皂化反应。叶绿素分子中Mg2+与仆啉环结合不稳定，可以被H+、Cu2+、Zn2+等离子所取代。I光合色素的提取与理化性质2/3/2023实验仪器及药品材料：小桐子叶片方法及步骤

光合色素的提取：将植物叶片洗净并用滤纸洗干，取1/2片叶片，放入研钵中并加入少许CaCO3和石英砂及5ml丙酮，充分研磨，再加入10ml丙酮，研磨，静止片刻，上清液过滤于三角瓶中，待用。I光合色素的提取与理化性质2/3/2023观察荧光现象：与光线垂直的方向观察色素颜色。光破坏作用：1ml色素提取液于室内，1ml于太阳光下，30min后观察颜色变化。I光合色素的提取与理化性质2/3/2023皂化反应：取一支试管，加入色素提取液2.5ml，再加入30%KOH甲醇溶液1ml，摇匀，再加入苯2.5ml，轻轻摇动，沿试管壁慢慢加入自来水1ml，轻轻摇动后观察，注意观察整个过程颜色的变化。取代反应：取一支试管，加入3ml色素，逐滴加入50%醋酸直至溶液变为黄褐色。倒出一半，加入少许醋酸铜粉末，酒精灯上加热，与另一半比较颜色的差异。I光合色素的提取与理化性质2/3/2023吸收光谱的变化：皂化和取代反应后的色素进行吸收光谱分析（见II）。结果与讨论

1、认真记录观察到的结果（颜色变化？分几层？为什么？），并加以讨论。

思考题

1、为什么在皂化反应中只能用20%KOH甲醇溶液，而不能用20%KOH水溶液？I光合色素的提取与理化性质2/3/2023实验目的掌握光合色素的分离方法以及了解有关的吸收光谱。实验原理光合色素能溶于具有一定极性的有机溶剂，如丙酮、乙醇等。不同光合色素的分子量、分子结构、极性、溶解度、支持物对它们的吸附力等不同，因而分配系数不同，故彼此可以分开。叶绿素的卟啉环结构对光有很强的吸收，主要是红光和蓝紫光。II光合色素的分离与吸收光谱2/3/2023实验仪器及药品材料：菠菜叶片方法及步骤

光合色素的提取：将植物叶片洗净并用滤纸洗干，取1/3片叶片，放入研钵中并加入少许CaCO3和石英砂及5ml丙酮，充分研磨，再加入10ml丙酮，研磨，静止片刻，上清液过滤于三角瓶中，待用。II光合色素的分离与吸收光谱2/3/2023光合色素分离：剪取适当长度和宽度的滤纸条→用上行纸层析法分离色素→启动剂：石油醚：丙酮：苯=10：2：1。启动剂II光合色素的分离与吸收光谱距离2/3/2023吸收光谱的测定：光合色素的吸收光谱：取色素溶液1mL，加入丙酮3mL，摇匀后在分光光度计上400到700nm处每隔10nm进行扫描。各色素的吸收光谱：上述层析出的3~4种色素，分别剪下后溶于3mL丙酮中，按上述方法扫描。II光合色素的分离与吸收光谱2/3/2023结果与讨论

1、画出你的层析结果，并加以分析。

2、总光合色素和各光合色素的吸收光谱有何不同，为什么？思考题

1、光合色素的吸收光谱对我们理解光合作用有何意义？

2、试论述高等植物光合色素的种类和生理功能II光合色素的分离与吸收光谱2/3/2023III光合色素含量的测定2/3/2023K652=34.5III光合色素含量的测定2/3/2023实验目的掌握用分光光度计测定叶绿素含量的方法。实验原理

混合液中的两个或多各组分，只要它们的光谱吸收峰不互相重叠，仍然可以根据Lambert-Beer定律（A=kLC）求出各组分含量。Lambert定律：A=kL；Beer定律A=kC。叶绿素a、b在80%丙酮溶液中的Amax分别为663nm、645nm，由此得出：见推导过程

Ca=12.7A663–2.69A645；Cb=22.9A645–4.68A663

Ca+b=8.02A663+20.20A645实验仪器及药品实验材料：植物叶片III光合色素含量的测定2/3/2023A663=Ca.ka1+Cb.kb1A645=Cb.kb2+Ca.ka2

分光光度计测出，故求二元一次方程组可得到此公式。k——比吸收系数。即溶剂和波长不变的情况下，当物质的浓度(C)为1g/L(0.1%)，比色皿的直径(光径，L)为1cm时所测出的吸光度即为比吸收系数。故其单位为：ε——摩尔吸收系数。即溶剂和波长不变的情况下，当物质的浓度(C)为1mol/L，比色皿的直径(光径，L)为1cm时所测出的吸光度即为摩尔吸收系数。故其单位为：由于k是一个常数，而A可以通过III光合色素含量的测定2/3/2023方法及步骤方法一：快速测定法由于叶绿素a、b在652nm处有共同吸收，k=34.5Lg-1.cm-1。可直接用便携式叶绿素测定仪测定植物叶片的叶绿素含量，最后浓度单位为mg/dm2方法二:分光光度计法色素提取：将上述植物叶片洗净并用滤纸吸干，准确称取已知Φ的叶圆片0.05g左右，加入少许CaCO3和石英砂及80%丙酮2ml，充分研磨，转入离心管中（离心机使用），再用5ml80%丙酮洗研钵，转入离心管中，平衡，5000rpm离心10min,记录上清液体积，取1ml稀释到4ml。测定：以1cm比色皿分别测定A663、A645。使A控制在0.1~0.8之间。III光合色素含量的测定2/3/2023结果与讨论

1、根据原理中计算出三类色素的浓度（mg/L）。

2、根据公式

分别计算出各种植物叶片色素含量。思考题

1、一般正常的植物叶片，Chla/Chlb=3/1，你所测定的结果符合此比例吗？为什么？

2、两种测定方法含量有何不同？为什么？

3、怎样把方法一中的叶绿素含量mg/dm2转换为方法二中的mg/gFW？怎样测定不同形态的植物叶片的叶面积？Chlcontent=

(mg.g-1FW)III光合色素含量的测定2/3/2023附1.叶面积的计算选取单位面积重量是一个常数的打印纸如A4或16K。一般A4打印纸为70~105GSM（g/m2）。用铅笔轻轻地沿着叶缘在A4纸上划线。用剪刀沿着叶缘剪下A4纸。称所剪下的A4纸的重量W(g)。计算：附2.高速冷冻离心机的使用方法III光合色素含量的测定2/3/2023温度调节1、插上电源插座2、按T接通电源3、按功能键调节温度上限4、按功能键调节温度下限5、按功能键显示目前温度III光合色素含量的测定2/3/20234、按功能键把Cd47改为Cd59