生物反应工程2010

生物工程反应姜梅2010.9联系方式：

Meijiang9@84396989(O)绪论本章重点：生物反应工程生物工程概念与内容；本章难点：生物反应过程与生物反应工程的区别。

1.1生物反应过程概述

1.1.1生物反应过程(bioprocess)

定义：

将生物技术的实验室成果经工艺及工程开发而成为可供工业生产的工艺过程。实质：利用生物催化剂从事生物技术产品的生产过程。青霉素的生产。抗生素——青霉素罗伯茨（W.Roberts，1874)首次报道微生物的颉颃（xiehang）现象（antagonism）灰绿青霉生长旺盛的液体会使人工感染细菌困难廷德尔（J.Tyndall,1876）青霉菌与细菌液体培养中有颉颃现象巴斯德和朱伯特（J.F.Joubert，1877)用炭疽芽孢杆菌培养物感染动物巴比斯和科尼尔（V.Babes&A.V.Cornil,1885)细菌之间……青霉素的生产1928.9英国Fleming发现青霉素1938英国Flory和Chain重复（实验室）少量败血病失败第二次世界大战美国D.Elder

液体深层发酵0.001g/L1945青霉素高产菌株——产黄青霉（Penicillium

chrysogenum)

育种技术培养基设计技术搅拌通气发酵罐为反应器（六叶平板桨）

氧的传递技术等等化学家钱恩（E.Chain）获得精制品，1940在美国产业化当前水平60000～80000U/ml(150m3)空气净化工艺流程生物技术

biotechnology侧重技术方法

应用自然科学及工程学的原理，依靠生物催化剂的作用将物料进行加工以提供产品或为社会服务的技术。生物科学

bioscience：侧重机理研究生命现象和生命活动规律的科学生物工程bioengineering：侧重工程（一）描述性生物学1．19世纪30年代，德国植物学家施莱登、动物学家施旺提出细胞学说。2．1859年，英国生物学家达尔文出版《物种起源》。（二）实验生物学阶段：（孟德尔遗传规律重新提出—1900年）（三）分子生物学阶段：

1．1944年，美国生物学家艾弗里首次证明DNA是遗传物质。

2．1953年，美国沃森，英国克里克提出DNA双螺旋结构模型。生物科学发展生物工程专业本科授予工学学士学位，生物科学和生物技术专业本科授予理学学士学位。以清华大学为例，生物科学与技术系是培养在生物科技领域从事科学研究、教学和应用开发工作的高水平人才的专门系科。现设有生物科学和生物技术两个本科专业，为了拓宽人才培养口径，招生时按生物科学一个专业招生。虽然分为两个专业，但课程安排和教学内容上并没有什么区别，只是在写毕业论文时各有侧重。生物科学专业主要涉及生物化学、分子生物学、生物物理学、结构生物学和细胞发育生物学等学科领域。生物技术专业主要包括生物芯片技术、微生物发酵工程、藻类技术、细胞工程及酶工程和生态环境工程。为使学生适应未来生物科技发展的需要，培养学生不仅注重生物学知识的学习和实验技术的训练，而且重视学生在数、理、化、计算机等方面的培养和训练，还需学习无机化学、分析化学、有机化学、物理化学、普通生物学、生物化学、细胞生物学、微生物学、遗传学、分子生物学、动物生理学、生物物理学及电工与电子技术、计算机软硬件技术基础课程。另有神经生物学、发育生物学、免疫学和生物工程学等一系列课程可选修。以上海交大为例，生物技术专业旨在培养具有扎实的现代生命科学理论基础和熟练的操作技能与工程基础知识、掌握计算机以及外语的高级专业人才。研究方向为生物大分子的结构与功能、基因分子生物学、人类与动物分子遗传学、微生物代谢与调控以及植物基因工程等。该专业主要学习与基因工程、蛋白质工程等相关的基础理论和操作技能。主要课程有：普通生物学、生物化学、神经生物学、微生物学、微生物原理、基因工程原理与方法、细胞工程、生化工程、酶与酶工程、发酵工程、计算机在生命科学中的应用、生命科学信息与情报、生命科学基础讲座等。示意图

细胞

酶

(游离或固定化)

空气

能量

提取精制

产品生物催化剂

副产品

灭菌

废物

原料

基质或培养基生

物

反

应

器检

测

控

制

系

统组成

原料的预处理——选择、加工（物理或化学）、培养基的配制和灭菌；生物催化剂的制备——菌种的选择、扩大培养和接种，酶的纯化和固定化等；（核心）生物反应器及反应条件的选择与监控——反应器的结构、操作方式、操作条件；反应

参数的检测与控制；产物的分离纯化——去除杂质，提高浓度。

以生物反应器为核心，之前反应上游加工；之后反应下游加工1.1.2生物反应过程的特点

一门综合学科——生物学：生物化学、分子生物学、微生物学

化学：无机、有机、分析、物理

工程学：化学工程、机械工程；采用生物催化剂——酶

Enzyme；采用再生资源为原料——丰富、低廉，危害性小；难控制，质量不稳定；设备简单，能耗低。1.1.3生物反应过程的分类

(1)

酶反应过程——游离、固定化酶(2)

细胞反应过程——微生物和动植物反应(3)

废水的生物处理过程废水的生物处理过程特点：①是由细菌等菌类、原生动物等各种微生物构成的混合培养系统；②几乎全都采用连续操作；③微生物所处的环境条件波动大；④反应的目的是消除有害物质而不是生成代谢产物和微生物细胞本身；⑤不计成本。1.2生物工程

1.2.1生物工程的定义

人们以现代生命科学为基础，结合先进的工程技术手段和其他基础学科的科学原理，按照预先的设计改造生物体或加工生物原料，为人类生产出所需产品或达到某种目的。1.2.2.生物工程的分类：

基因工程(Geneengineering)

细胞工程(Cellengineering)酶工程(Enzymeengineering)发酵工程(Fermentationengineering)蛋白质工程(Proteinengineering)细胞工程微生物工程菌发酵工程产品蛋白质或酶蛋白质或酶工程基因工程优良动、植物品系动、植物个体或细胞基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程、蛋白质工程之间的相互关系

1.2.3.生物工程涉及的学科

学科众多。分子生物学、微生物生理学、生物化学、免疫生物学等等。使用现代化器和设备——技术手段。

广阔的应用前景；医药林业环境保护能源采矿冶金农业材料畜牧业化工表1-1重要的现代生物技术仪器和设备

名称用途1DNA自动测序仪自动测定核酸的核苷酸2蛋白/多肽自动测序仪测定蛋白质、多肽的氨基酸序列3半自动DNA测序仪测定核酸的核苷酸序列4DNA自动合成仪合成已知寡核苷酸序列5蛋白/多肽自动合成仪的蛋白质或多肽6生物反应器细胞的连续培养7发酵罐微生物细胞培养8热循环仪（聚合酶链式反应仪、PCR仪）DNA快速扩增9序列分析软件核酸/蛋白质序列分析10基因转移设备将外源DNA引进靶细胞11色谱软件控制色谱仪、收集和处理数据12高效液相色谱仪物质的分离和纯化及纯度鉴定13电泳设备物质的分离和纯化及纯度鉴定14凝胶电泳系统蛋白质和核酸的分离和分析15毛细管电泳仪质量控制、组分分析16超速、高速离心机分离生物大分子物质17电子显微镜观察细胞及组织的超微结构图生物技术树1.2.4生物工程的研究的内容

运用化学工程的原理与方法将生物技术的实验室成果进行工业开发的一门学科。既为生物技术服务的化学工程。

化学工程的原理与方法——化学反应、原料的处理和产物的分离、能量的传递、设备的设计与放大、过程的控制和优化等一系列工程技术问题。化学工程——传递工程、分离工程、反应工程、化工热力学、化工过程系统工程

工程分类——生物（生化）反应工程和生物分离工程1.3生物反应工程

1.3.1定义：研究生物反应动力学，反应器的结构、设计、放大以及反应器优化的一个重要学科。实质：生物反应过程中带有共性的工程技术问题的学科。如何从生物现象中抽象出共性的内容从宏观看

以获得生物量为目的：

生物合成速率≈影响因素（生物体、基质、环境因素、操作条件等）

以获得目的产物为目的：从微观看转录与转译速率=（基因量、…….等)

调控速率=（表达速率、酶活力、……等）1.3.2反应器——生物反应过程的关键设备。

操作方式 产品的质量

操作条件产量

结构能耗

原因——物料的混合与流动传质与传热

三传一反

氧和基质的供养和传递等等1.3.3内容：

以生物反应动力学为基础，通过运用传递过程原理、设备工程学、过程动态学及最优化原理等化学工程学的方法，进行生物反应过程的工程分析与开发，以及生物反应器的设计、放、操作和控制等。1971英国

阿特金逊

B.Atkinson采用生化反应工程术语1974

编写《生化反应器》1979日本

山根恒夫

编《生物反应工程》1985德国

许盖尔特Schugerl

专著《生物反应工程》

A.

生物反应动力学

动力学——研究工业生产中生物反应速率问题；影响生物反应速率的各种因素以及如何获得最优的反应结果。

本征动力学（微观动力学）

反应器动力学（宏观动力系学）B.生物反应器

传递特性——传质、传热和动量传递设计与放大——选型、操作方式、计算优化与控制——优化操作与优化设计、反应参数测定与控制。表生物反应过程特征的比较生物反应过程生物反应特征酶反应过程

细胞反应过程

微生物反应过程

动植物细胞培养过程

单一菌体培养系统

多菌体混合培养系统

反应水平分子水平单一群体水平生态系水平细胞或组织水平反应过程的复杂性简单一般复杂很复杂基质的数量1-2基质

几种基质

几种基质几种基质产物的数量

1-2种

菌体和几种代谢产物

几种菌体和二氧化碳，厌氧反应过程、甲烷

细胞或组织或几种产物和二氧化碳

反应速率或生长速率

快一般慢很慢1.3.4发展历史

a

酿酒、生产酱油和醋——容器

最简单、最原始的生物反应器b.

1857Pasteur酵母发酵生产酒——控制——发酵罐c.

第一次世界大战

深层培养技术、无菌空气制备技术——分批、连续与流加操作d.

60年代固定化技术——新概念——生物反应器

e.70年代基因工程——特殊生物反应器

龙山文化（距今4000-4200年）已有酒具出现。公元前200年，作豆腐、酱油和酿醋。在我国最早的诗集《诗经》中就提出过采用厌氧进行亚麻浸渍处理。公元10年有了天花的活疫苗。龙山文化泛指中国黄河中、下游地区约当新石器时代晚期的一类文化遗存。因1928年首先在山东省章丘县龙山镇城子崖发现而命名。

20世纪中期前后生物化学工程学科的形成。20世纪后期（1970～80年）生物反应工程学科的形成。英国学者阿特金逊（1971）首次提出生化反应工程……。20世纪90年代基因工程与生物反应工程不断融合、发展。1.3.5发展方向

新型生物反应器的研究与开发；各种描述生物反应过程的数学模型的建立；生产过程参数与控制手段的改进。生物反应工程与相关学科的关系1.4生物反应工程的研究方法

数学模型法——用数学语言表达生物法反应过程中各个变量之间的关系。

不能替代实验研究。方法——机理模型或结构模型既过程机理出发推倒的。--------可外推使用半经验模型\

经验模型经验法参考资料国外1975年日本学者合叶修一等《生物化学工程---反应动力学》1979年日本学者山根恒夫《生物反应工程》1985年德国学者许盖特（Schugerl）《生物反应工程》1993年日本学者川濑义矩《生物反应工程基础》1994（02）年丹麦学者Nielsen等《生物反应工程原理》国内《生物反应工程原理》（1990和2003天津科技大学贾士儒）《生物工艺学》（1992华东理工大学俞俊棠等）《生化工程》（1993江南大学伦世仪）《生化反应动力学与反应器》（1996北京化工大学戚以政等）《生物反应工程》（2004戚以政等）《生物反应工程》2005浙江大学岑沛林等）《生物反应工程》（2005清华大学邢新会译）作业：

1.什么是生物工程？它包括哪几部分？

2.

生物工程对人类社会将产生怎样的影响？

3.

什么是生物反应工程？其内容包括那些？

4.什么是生物反应过程？其内容包括那些？

预习：

1.

概念：解离常数、平衡常数、速度常数；

2.酶的生物化学知识。

第1章均相酶催化动力学

本章的重点：①米氏方程的两种假设、两种推导方式及其参数的物理意义；②实验法求取米氏方程的动力学参数；③竞争性抑制剂和非竞争抑制剂的动力学方程的推导及判断；④根据实验数据，计算出动力学参数并判断动力学类型。本章的难点：①米氏方程及抑制剂动力学等有关的推导；②酶失活动力学的意义及推导。1.1酶催化反应的基本特征

1.1.1酶的分类与命名

氧化还原酶类、转移酶类、水解酶类、裂合酶类、异构酶类、合成酶类。1.1.

2酶的活力表示方法酶的催化效率与酶的转换数是同一概念。催化中心活力酶活力——1kat=6×107U或

1μkat=60U1U=1.7×10-8

比活力——每1mg（1mL）蛋白质所具有的酶的单位数。U/mg或

kat/mg1.1.3酶的特性

生物催化剂，具有一般催化剂所特有的特性——不能改变反应的平衡点，只能改变反应速率，反应条件温和。高效性；专一性；酶的催化作用需要辅因子——非蛋白质物质共同作用；金属离子、有机物质——辅酶（紧密）、辅基（疏松）

酶是蛋白质——失活与变性。酶失活的原因与再生的可能性化学修饰（微观变化）、空间障碍、高级结构的变化（宏观变化）、多肽链的断裂1.1.4酶的稳定方法

分类稳定化方法稳定的理由水溶性酶低温（冷冻）保存难以被化学物质和蛋白质破坏添加盐类

加入高浓度硫铵等后，酶高级结构的稳定性增加添加底物、辅酶等配体

常用

护酶活性中心，有利于酶分子高级结构的稳定性

添加多元醇

理由不明化学修饰，特别是分子架桥

稳定酶的高级结构或保护酶的活性中心

添加强变性剂

若能保护好一级结构，则可随时再生

大量添加蛋白质

添加清蛋白等用于保护在稀薄状态下易发生变性、失活的酶类添加有机溶剂

如加入丙酮，理由不明结晶化

有利于高级结构的稳定不溶性酶

固定化

常用能防止蛋白酶间的相互作用，其它理由不明1.2简单的酶催化反应动力学

1.2.1概念：

反应速率：在均相反应中，一般以单位时间、单位体积中反应组分的改变量。对于恒容反应，V为常数，故

aA+bB

cC+dD

②平衡常数K意义：衡量反应进行程度大小的一个常数。K越大。表示反应进行程度越大，即反应进行的越完全；反之，K越，表示反应进行程度越小，即反应进行的越不完全。K是温度的函数。③解离常数Ks：

aA+bB

cC+dD

Ks=1/K意义：衡量解离进行程度大小的一个常数。Ks越大。表示解离进行程度越大，即反应进行的越完全；反之，Ks越小，表示反解离进行程度越小，即解离进行的越不完全。Ks是温度的函数。④（反应）速度常数（比速度）：aA+bB+••••••lL+Mm+••••••[A]=[B]=1mol•L-1时，则r=k。k与温度、催化剂有关。物理意义：某在反应一定温度下，反应物为单位浓度时的反应速度。反应快，k数值大。阿仑尼乌斯公式：

Lnk=(-E/RT)+InA零级反应动力学一级反应动力学

AB二级反应动力学A+BCk1k1连锁酶反应ABC

k1k2如果A的初始浓度为a0，B和C的初始浓度为0，并且a+b+c=a0，则求得：[例]卵状假单胞菌（Pseudomonaso

valis)在分批反应中先把葡萄糖转变为葡萄糖内酯，再转化为葡萄糖酸。此反应为一级反应，反应如下

GLP

求中间产物（葡萄糖内酯）浓度达到最大时所需要的时间tmax及其最大浓度值[L]max。已知反应常数k和k分别为0.87h-1和0.7h-1。G0(初始葡萄糖浓度）=0.38mg/mL。解：GLPt=0[G0]00t=0[G][L][P]k1k2k1k2当葡萄糖内酯达到最大值时，有所以即在1.28h时，葡萄糖内酯达到最大值15.5g/L1.2.2简单的酶催化反应特点：

①简单的酶催化反应动力学——一种反应物（底物）参与的不可逆反应。酶反应动力学基础。

酶催化的水解反应、异构化反应和大部分裂解反应②对单一底物参与的简单酶催化反应：

SP反应机理可表示为：

S+EESE+P根据质量作用定律，P的生成速率可表示为

rp=k+2[ES]=k+2XEk+2k+1k-11.2.3米氏方程

假设

在反应过程中，酶的浓度保持恒定，即e0=efree+X与底物浓度[S]相比，酶的浓度是很小的。故可以忽略有于生成中间复合物ES而消耗的底物；产物的浓度是很低的，因而产物的抑制作可以忽略，同时也不考虑P+EES这个逆反应的存在。(反应的初始状态）

V.Henri于1902年根据转化酶(invertase)，苦杏仁酶(emulsin)及淀粉酶(amylase)的实验结果提出了反应速率方程①M——M方程

快速平衡学说（rapidequilibrium)原理:k+1＞＞

k-2

，k-1＞＞

k-2

即ESE+P反应慢，k+2较小，决定整个酶催化反应的速度。推导：

eo=e+Xk+1e[S]=k-1X

rp=k+2X动力学参数：KS为rP=1/2rP,max时的底物浓度，表示酶与底物相互作用的特性；rP,max表示当全部的酶分子都变成[ES]的反应速度；k+2表示单位时间内一个酶分子所催化底物发生反应的分子，即表示酶催化能力大小——转换系数。（kcat)②B-H方程拟稳态学说原理：中间复合物浓度维持不变，即生成产物速度与分解产物速度相等。推倒：动力学参数：同M——M③两种方程（学说）比较项目M—M方程B—H方程假设酶和底物生成不稳定复合物[ES]，酶催化反应是经中间复合物完成的。即[ES]在反应开始后与E及S迅速达到动态平衡k+1＞＞k-2，k-1＞＞k-2ES]的生成速率与其解离速率相等，其浓度不随时间变化。底物浓度远远高于酶的浓度。[S]＞＞e0酶量守恒

e0=efree+X产物生成动力学动力学方程Ks与Kmk-1④扩展方程若米氏方程中e数值大（结果见书[例3-5]）存在多个中间复合物是，催化活性中心速率常数S1+ES1EK1有辅因子反应S2+ES2EK2S1E+S2S1S2EK12S2E+S1S1S2EK21S1S2EE+Pk双底物反应E+CECKCEC+CECSKSECSE+C+Pk[例1]假设单底物S生成产物P的酶促反应机理下式，试建立可逆反应动力学方程。E,[S],X和[P]分别与下式对应的浓度。

E+S[ES]E+P

e[S]Xe[P]解：M-M：

rP=k+2X-k-2e[P]e=e+Xk+1[S]e=k-1Xk+2X=k-1e[P]

k+1k+1k--1k--2k+21.2.4动力学特征与参数求解动力学特征A.[S]＜＜Km（[S]＜0.01Km

），r为直线，B.[S]＞＞Km

（[S]＞100Km

），r为直线C.0.01Km

＜[S]＜100Km，r为曲线参数求解参数求解(a)Linewear-Bunk(b)Hane-Woolf

(c)Eadie-Hofstee(d）积分法参数求解L-B法，双倒数法（常用）特点：浓度小时，误差大；方便，快速。

H-W法特点：横坐标均匀，易作图，误差小，便于分析E-H法（误差小）特点：易作图，误差小，但不易测量积分法特点：误差小，不经变量计算，工程上常用例2有一均相酶催化反应，Km值为2×10-3mol/L,当底物的初始浓度[S]0为1×10-5mol/L，若反应进行1min，则有2%的底物转化为产物。试求：（1）当反应进行3min，底物转化为产物的百分数是多少？此时底物和产物的浓度分别是多少？（2）当[So]为1×10-6mol/L，也反应了3min，底物转化为产物的百分数是多少？（3）最大反应速率rmax值为多少？解（1）根据题意：[S]0＜＜0.01Km

ln([S]0/[S]）=（rmax/Km)t=Ktt=1min,Xs=0.02[S]=[S]0(1-XS)=0.98×10-5mol/L,K=0.0202min-1(2)[So]为1×10-6mol/L时，仍是一级反应，

t=3min,求得χ=6%[S]=0.94×10-5mol/L,[P]=6×10-6mol/L（3）K=rmax/Km=0.202min-1

rmax=4.04×10-5mol/(L•min)[例3]常温下利用蔗糖酶水解蔗糖，蔗糖的初试浓度[S]0=1.0mmol/L，酶的初试浓度e0=0.001mmol/L

在实验室反应器内进行分批操作，测得如下表中数据。试确定可否用米氏方程来描述反应速率，若可以，求Km和k+2。t/h1234567891011[S]/(mmol/L)0.840.680.530.380.270.160.090.040.0180.0060.005ln([S0]-[S])[S0]-[S]1.0901.2051.3511.5611.7942.1822.6263.3534.0915.1476.006

t[S0]-[S]6.2506.2506.3836.4526.8497.1437.6928.3339.16510.0611.028解：米氏方程转换为Rmax/Km=1截距=-5.0846-1/Km=-5.0846Km=0.197mmol/Lk2=19.7/h1.3有抑制剂的酶催化动力学不可逆抑制剂——失活可逆抑制剂——竞争、非竞争、反竞争、混合(用透析等物理方法除去抑制剂)定义：凡能减慢或停止酶促反应的化合物称抑制剂。作用机制：抑制剂的主要作用是直接或间接地影响酶活性中心，改变活性中心的三维构象，占据酶活性中心，从而使酶与底物的结合机率下降。1.3.1竞争性抑制的酶催化动力学概念：竞争性抑制剂和底物结构相似，能和底物分子竞争与酶的活性中心相结合，酶与抑制剂结合后，不能再与底物结合。

琥珀酸脱氢酶受丙二酸及草酰乙酸抑制。此二者竞争酶与底物的结合部位，但不能被酶催化脱氢，故一旦结合在活性中心部位，就抑制了酶与底物的结合

.机理

E+SESE+P

E+IEI推导:M-M：

rP=k+2X-e=e+X+[EI]k+1[S]e=k-1Xk-3[EI]=k+3

e[I]k+2k+3k-3k+1k-1方程图形讨论

A.Km[I]KmI

B.处理方法[S]＞＞

[I]可解除抑制[S]/r[S]无竟-kIm-km1.3.2非竞争性抑制的酶催化动力学

概念：机理推导方程图形讨论

[S]不能解除抑制

无有1/[S]1/rs核苷对霉菌酸性磷酸酯酶1.3.3反竞争性抑制的酶催化动力学

概念：机理E+S[ES]E+P[ES]+I[SEI]推导方程图形讨论

无反

肼对芳香基硫酸酯酶1/[S]1/r竞争性和非竞争性抑制示意图1.3.4线性竞争性抑制的酶催化动力学

概念：机理E+SESE+PE+IEI

EI+SSEIES+ISEI推导方程图形讨论

A.KIS=KSI时，rSI为非竞争性抑制动力学；

B.KSI∞，

rSI为竞争性抑制动力学；

C.KSI∞，

rSI为反竞争性抑制动力学；

D.KIS=≠KSI，且为常数，rSI为混合竞争性抑制动力学

k+2KsαKsαKIKI1.3.5底物抑制的酶催化动力学

概念：机理E+S[ES]E+P[ES]+S[SES]推导方程图形讨论

1.3.6小结抑制形式最大速率米氏常数抑制百分数竞争性抑制rmax

Km(1+)非竞争性抑制rmax/(1+）Km反竞争性抑制rmax/(1+）Km/(1+)几种抑制动力学的比较抑制百分数,表示抑制剂对酶催化反应抑制的程度[例]在含有相同酶浓度的五个反应物系中，分别加入不同浓度的底物，并测定其初始速率，然后再在五个反应物系中分别加入浓度为1×10-6mol/L的抑制剂，并测定其初始的反应速率，其数据如下表.试根据上述数据决定其抑制类型及动力学参数。底物初始浓度[S]0mmol/L

无抑制时速率rsommol/(L·min)有抑制时速率rSImmol/(L·min)0.1028180.1536240.2043300.5063510.707463解:由题意作L-B图,有图可知-1/Km=-4.16-1/KmI=-0.27，

-1/rmax=1×10-2

rmax=100Km=0.24KmI=0.44102KI=0.27-4.16-0.271.4复杂酶催化动力学A+B+C+•••P+Q+R+•••

随机机制顺序机制双底物机制

有序机制乒乓机制

T-C机制1.4.1随机机制1.4.2有序机制①顺序机制②T-C机制③乒乓机制多底物反应可看成是一组反应。类似这样反应多糖和蛋白质等高分子化合物的酶的水解反应是类似这样反应。最初底物具有一定的聚合度分布，底物种类很多；一般高分子底物的聚合度越大，酶促的反应速率越大。1.5影响酶催化速率的因素内部酶的结构特性、底物的结构特性外部浓度因素：[E]、[S]、[P]、[I]、[A]等操作因素：T、P、pH、离子强度1.1.5pH对影响酶催化速率的因素pH对酶的影响的两个方面´pH对酶稳定性影响（台形）pH对酶活性影响（钟形）产生的原因：

pH改变酶的活性中心，即改变其解离状态，从而反应速率。1.5.1pH值的影响

Michaelis假设①假定酶分子有两个可解离的基团，随着pH值的变化，分别呈现出EH2、EH-及E2-三种状态模型，既EH2

EH-E2-酸性条件下，酶呈现EH2状态；当pH增加，酶以EH-状态存在；当pH继续增加，酶以E2-状态在。②

上述三种解离状态中，只有EH-型具有催化活性。③底物的解离状态不变。④速率控制步骤为由EHS-生成产物的速率。

-H++H++H+-H+pH反应机制S推导：

-rs=rp=k+2[EHS-]E0=[EH2]-+[EH-]+[E2-]+[EH2S]+[EHS-]+[ES2-]方程讨论：

1.5.2温度的影响影响：

A.在较低温度的范围内，θ、r总

B.在较高温度的范围内，θ、r总动力学模型Arrhenius公式：温度与反应速率的关系Eryring过渡理论：实验建立模型(a)1.6酶的失活动力学影响酶活力因素：高温、pH、有机溶剂等；失活模型：双状态模型多状态模型机理

kdND

krDNDN1.6.1失活速率的实验测定失活曲线：在一定条件下，使酶溶液恒温保持一定时间，间隔时间定时取样，在酶的最适pH、温度条件下测定其活力，以残存酶活力与失活处理时间作图，即得失活曲线。分析：

A.均匀时间间隔取样

B.测定时间一致

C.注意有无底物

D.在最适pH、温度1.6.2酶的热稳定动力学热稳定曲线：在一定条件下，使酶溶液不同的恒温中保持一定时间，在酶的最适pH、温度条件下测定其活力，以残存酶活力与失活处理温度作图，即得该活曲线。表示酶的热稳定性双模型机理kr推导：

e0=et-[D]

利用初始条件t=0,et=e0，解方程方程：

（可逆）①（不可逆）②讨论大多数热失活模型服从②大多数pH失活模型服从①半衰期t1/2=ln2/kd；表示酶活力衰减的程度，是酶的稳定性参数；若考虑温度与时间的关系，则1.6.3反应时酶的热失活动力学

——操作稳定性

操作稳定性

：

酶在反应中的稳定性；机理：

E+S[ES]E+P

DD+S方程：

δkdk+1k-1k+2kdet=ef

+X分析

A.δ=1时，底物对酶失活没影响。B.δ=0时，酶完全被底物所保护，复合物[ES]完全不失活，此时只有游离酶失活。C．0<δ<1时，底物对酶有部分保护作用，能在一定程度上抑制酶的失活。D．δ>1时，底物加速酶的失活。E．若只有游离酶失活时，其分批反应的动力学方程F．如果还要考虑到在反应时温度对酶失活的影响。显然其速率方程更加复杂。这里只讨论零级不可逆酶催化反应的情况。对零级不可逆反应，[S]值趋于无穷大，因此有

对该式积分，得到当[s]足够大时，上式可简化为

进行积分得到

复习题：复杂酶催化动力学模型有哪几类型？Michaelis假设怎样描述pH对酶催化反应速率的影响？酶失活速率测定的方法？产物很高时，反应机制为

E+S[ES]E+PE+P[EP]试推导其反应速率方程。k-3k+3k-1k+1k+2第2章

固定化酶催化反应过程动力学

本章重点：①影响固定化酶性质动力学因素；

②Da准数与φ准数的意义；本章难点：①内扩散动力学模型建立原理；②外扩散动力学模型建立原理

酶与细胞的应用：

①

cheese生产：牛奶+凝乳蛋白酶；②

淀粉糖生产：大米（玉米）+α-淀粉酶+β-淀粉酶+异淀粉酶；③

原料处理：酒精、甘油、乳糖、氨基酸；④

生丝脱胶：丝蛋白（丝胶包裹着）——胰蛋白酶、木瓜蛋白酶处理脱胶；⑤

医药生产：L-氨基酸⑥

有机酸生产：L-苹果酸

固定化黄色短杆菌⑦

如用固定化氨基酸酰化酶生产L—氨基酸；⑧

固定化青霉素酰胺酶水解青霉素G生产6—氨基青霉烷酸；⑨

固定化葡萄糖异构酶生产高果糖浆；⑩

固定化糖化酶生产葡萄糖固定化酶定义定义：固定化酶亦称固相酶或水不溶酶。它是通过物理或化学的方法使溶液酶转变为在一定的空间内其运动受到完全约束、或受到局部约束的一种不溶于水，但仍具活性的酶。它能以固相状态作用于底物进行催化反应。优点：不仅固定化酶可以反复使用，而且产物不受污染容易精制；固定化后的酶大多数情况下其稳定性增加，仅有少数的稳定性下降；固定化酶有一定的形状和一定的机械强度，可以装填在反应器中长期使用，便于实现生产连续化和自动化。固定化酶方法：

载体结合法、交联法、包埋法

1.载体结合法：将酶结合于水不溶性载体的一种固定化方法。根据结合的形式不同，又可分为物理吸附法、离子结合法和共价结合法等。A.物理吸附法：指酶被物理吸附于不溶性载体的一种固定化方法。载体有活性炭、多孔玻璃、氧化铝、硅胶、淀粉、合成树脂等。

特点：酶活性中心不易被破坏，酶结构变化少的优点，但它有酶与载体相互作用力弱，酶易脱落的缺点。

1.载体结合法：B.离子结合法：酶通过离子键结合于具有离子交换基的水不溶性载体的固定化方法。此法的载体有多糖类离子交换剂和合成高分子离子交换树脂。例如DEAE—纤维素、GM—纤维素等特点：操作简单，条件温和，酶的高级结构和活性中心的氨基酸残基不易被破坏，能得到酶活回收率较高的固定化酶。但是载体与酶的结合力较弱，容易受缓冲液种类或pH的影响，在离子强度高的条件下反应时，酶易从载体上脱落。1.载体结合法：C共价结合法：酶以共价结合于载体的固定化方法，它是载体结合法中应用最多的一种。此法或是将载体有关基团活化，然后与酶有关基团发生偶联反应；或是在载体上接一个双功能试剂，然后将酶偶联上去。可与载体结合的酶的功能团有氨基、羧基、羟基、酚基等。特点：共价结合法反应条件比较苛刻，操作复杂，并且易引起酶高级结构产生变化，破坏了部分活性中心，酶活回收率一般为30％左右。代表性的方法有重氮法、溴化氰法等。2.交联法双功能或多功能试剂使酶与酶之间交联的固定化方法。此法与共价结合法一样也是利用共价键固定酶的，不同的是它不使用载体。做为交联剂的有形成希夫碱的戊二醛、形成肽键的异氰酸酯、发生重氮偶合反应的双重氮联苯胺等。特点：应用条件较激烈、酶活回收率低。3.包埋法

分网格型和微囊型网格型：埋在高分子凝胶细微网格中的方法。微囊型：包埋在高分子半透膜中的方法。特点：包埋法一般很少改变酶的高级结构，酶活回收率较高，因此可用于许多酶的固定化，但必须巧妙地设计反应条件。适合范围：小分子底物和产物的酶，因为只有小分子才可以通过高分子凝胶的网格进行扩散。

固定化酶的模式(5)疏水作用；（6）脂质体包埋；（7）微胶囊2.1固定化酶催化的动力学特征

酶固定化后性质的变化评价固定化酶指标：酶活力表现率和酶活力收率影响固定化酶动力学的因素固定化酶反应动力学2.1固定化酶催化的动力学特征

酶固定化后性质的变化：①

底物专一性的改变：②

pH的改变③

稳定性——热的稳定性、贮藏稳定性、操作稳定性④

动力学的改变。原因：①酶自身的变化——主要由于活性中心氨基酸残基、空间结构和电荷状态变化；②载体的物理和化学性质的变化。大多数酶在固定化后，其Km值增加，表示

催化反应活性将下降。也有少数酶固定化后活性无变化，甚至有所增大。评价这种活性变化可用下述两种指标来衡量：酶活力表现率和酶活力收率。酶活力表现率（相对活力）：实际测定的固定化酶的总活力与被固定化了的酶在溶液状态时的总活力之比。酶活力收率（活力回收）：实际测定的固定化酶的总活力与固定化时所用的全部游离酶的活力之比。上述两种指标之差别在于是否考虑了所剩余的未被固定化的酶。

影响固定化酶动力学的因素分子构象的改变位阻效应微扰效应分配效应扩散效应固定化酶反应历程①底物从液相主体传向固定化酶周围的滞流液层（外表面）；②底物扩散通过这一滞流液层到载体外表面；③进行酶促反应；④底物由载体外表面向载体内扩散；⑤产物由内部扩散到载体外表面；⑥产物由载体外表面到滞流液层；⑦产物由滞流液层传递到主体溶液当酶固定化于载体的外表面时，没有④和⑤两个阶段。①和②、⑥和⑦是属于外扩散过程，④、⑤则为内扩散过程。可以看出，固定化酶的催化反应受到了物质传递和酶促反应两个方面的影响。固定化酶反应历程影响固定化酶动力学的因素

（1）分子构象的改变：指固定化过程中酶和载体的相互作用引起酶的活性中心或调节中心的构象发生了变化，导致酶与底物的结合活力下降的一种效应。特点：难以定量描述与预测。多出现于吸附法和共价偶联法的固定化酶中。（2）位阻效应：载体的遮蔽作用(如载体的空隙太小，或者固定化位置或方法不当，给酶的活性中心或调节中心造成空间障碍，使底物和效应物无法与酶接触等)引起的。特点：选择适宜的载体与固定化方法，可消除这种不利因素的影响，但这种效应难以定量描述与预测。（3）微扰效应由于载体的亲水性、疏水性及介质的介电常数等，使紧邻固定化酶的环境区域(微环境)发生变化，改变了酶的催化能力及酶对效应物做出调节反应的能力。特点：这种效应难以定量描述和预见，但可以通过改变载体与介质的性质而做出判断与调节。空间效应模拟图（4）分配效应

分配效应是由于固定化载体与底物或效应物之间的疏水性，亲水性及静电作用所引起微环境(固定化酶紧邻的微观局部环境)和宏观环境之间物质的不等分配，改变了酶反应系统的组成平衡，从而影响酶反应速率的一种效应。

（4）分配效应分配效应可以通过分配系数Kp来定量描述。Kp的定义是载体内外底物(或其他物质)浓度之比。测定Kp方法：在已知浓度和体积的底物溶液中，放人不含底物的一定体积的载体，并保持适宜条件，当达到平衡时，测定载体外溶液中的底物浓度。（5）扩散限制指底物、产物及其他效应物的迁移和传递速度所受到的一种限制。

物质的传递过程包括分子扩散和对流扩散。这种扩散过程的速率在某些情况下可能会对反应速率产生限制作用。

扩散限制效应可分为外扩散限制效应和内扩散限制效应。

分配效应与扩散效应分配效应扩散效应分配和扩散效应同时作用固定化酶剖面图及浓度分布图固定化酶反应动力学本征动力学

指酶的真实动力学行为，包括溶液酶和固定化酶在内。对后者，它仅将空间效应的影响考虑在内。从这个意义上讲，固定化酶的本征动力学与溶液酶的本征动力学是有差别的。固有动力学

在本征动力学的基础上，仅仅考虑由于这种分配效应而造成的浓度差异对动力学产生的影响，所建立的动力学称为固有动力学

表观动力学表观动力学不论分配效应是否存在，固定化酶受到扩散限制时