临床检测样本RNA提取方法的比较研究分析 生物技术专业

临床检测样本RNA提取方法的比较研究（asonPusolPus和OTAA（DHARNAQueasyDNA/RNAPRV（CSV（JV三种RNAReal-timePCRRNAQueasyDNA/RNARNA病毒检测以及定性分析。对于Real-timeDNA/RNACTPlusTrollPlusRNA关键词：RNA；提取方法；比较；临床ComparisonofMethodsofclinicaltestsamplesRNAextractionAbstract：Threecommerciallyavailablecellsates(LiaisonPlus,TrollPlusandRNAOUT)andtwoDNA/RNAco-kits(ALCMENAdouble-kit,QueasyrapidDNA/RNAco-kit)wereselectedto extractthreeanimalRNACSFVandJEV）.TheRNAqualitywasevaluatedindirectlybyagaricgelelectroplateandReal-timePCR.Theresultshows,foragaricgelelectroplate,theclearlyandhighlightbandscanbeseenabovethegroupsofthethreecellsatesandQueasyrapidDNA/RNAco-kit,whichcanbeusedforclinicalRNAvirusdetectionandqualitativeanalysis.ForReal-timePCR,theCTvalueoftheQueasyrapidDNA/RNAco-kitgroupisthelowest,andthetwocellsatesgroups(LiaisonPlus,TrollPlus)followed.TheabovethreereagentscanbeusedforclinicalRNAvirusdetectionandquantitativeanalysis.Keywords:RNA；ExtractionMethod；Comparison；ClinicalRNA是生物体重要的遗传物质[1]2002Science10大科学成就中RNA名列榜首。RNA分子提取是生物学研究中的一项基本内容，是进行基因表达分析的基础[2]DNAPCRNorthern杂交等下游分子RNA[3]。RNARNARNARNARNA实验RNARNA对于分子克隆和基因表达分析等试验是至关重要的[4,5]ChomskySacchiRNA[6]，RNARNA提取方法有强变性剂法[7]、法[8]ADS-Phenol法[9]以及热硼酸法[10]RNA公司的LiaisonPlus；InvitingTripoliRNAPureLinkRNAMiniKit；上UNlQ-10TripoliRNARNA小量teriaRNAkit以及高纯RNA（HPtotlRNAkitEngageRNeasyProtectBacteriaMiniandMidiKitsRNA。PCR[11,12]（供体分子（受体分子）的激发光谱重叠时，供体荧光分子自身的荧光强度衰减，受体荧光分子的荧光强度增强。Ct值是指每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经CtPCRC（CltThsholdCtPCR产物的数量呈对应关系，只要对荧光信号进行“实时”检测并获得未知样品的Ct值，即PCRPCRPCR反应过程中每一个循环扩增产物的变化，PCRDNA（荧光探针RNA的方法很多，但是其基本都是把细胞破碎以后，以除去材料中糖、蛋白质、DNA等杂质为目标。而且材料自身物理化学性质的不同，不同的材料需要不同的提取方法［19,0。因此，需要通过对比RNA提取方法。材料与方法试剂（JXA1-R（成都天邦生物制品有限公司日本乙型脑炎弱毒活疫苗SA1142株TrollPlusRNA（南京天为生物科技有限公司，RNO（北京天恩泽基因科技有限公司LiisonPlu（宝生物工程有限公司，柱式病毒D双提试剂盒（北京天恩泽基因科技有限公司，QaDA/RNA共提试剂盒（上海快灵生物科技有限公司，氯仿（乙醇，异丙醇（上海申博化工有限公司，逆转录试剂盒（，Mixtur（）RNA提取RNA(1)LiaisonPlus法100μd2O500u700μL5min；12000rpm/min，45min600μL上清，加入等体积的异丙醇，沉淀RNA，缓慢摇匀；-2030min以上；12000rpm/min15min，弃上清；加入400μL，75%的乙醇，颠倒4次；12000rpm/min离心5min，弃上清；12000rpm/min30—40μLReleasefreedH2O，-80℃保存备用。其中，疫苗稀释液有三种（PRRSV、SVJERNAOUT法100μd2O500u700μL5min；12000rpm/min，45min600μL上清，加入等体积的异丙醇，沉淀RNA，缓慢摇匀；-2030min以上；12000rpm/min15min，弃上清；加入400μL，75%的乙醇，颠倒4次；12000rpm/min离心5min，弃上清；12000rpm/min30—40μLReleasefreedH2O，-80℃保存备用。其中，疫苗稀释液有三种（PRRSV、SVJETrollPlus法100μd2O500u700μL5min；12000rpm/min，45min600μL上清，加入等体积的异丙醇，沉淀RNA，缓慢摇匀；-2030min以上；12000rpm/min15min，弃上清；加入400μL，75%的乙醇，颠倒4次；12000rpm/min离心5min，弃上清；12000rpm/min30—40μLReleasefreedH2O，-80℃保存备用。其中，疫苗稀释液有三种（PRRSV、SVJEDHARNARNA1.5mL100μL600μLA30s混匀A465℃水500μL溶液转移到离2min12000rpm1min2min；12000rpm700μL的通用洗柱液到离心吸附柱中，12000rpm室温1min12000rpm室温离1mi（干甩Freebase1.5mL30—40μL的洗脱2min；12000rpmRNA（PRRSV、SVJEQueasyDNA/RNARNA1.5mL100μL300μL2—3min400μL12000rpm5min，600μL50%600μL75%乙醇，振荡混匀，12000rpm1min，弃净溶液；离心管短暂5—10s10μL10—30uL洗脱液，振荡混匀后短暂离心，置于-80℃保存备用。（PRRSV、SVJE1.3RNA质量检测1.3.1琼脂糖凝胶电泳检测RNA6μLReactionMix（4X）2μL，混匀后室温放置2miACrtRationShoppr52μ5XAllineTmter4μ，AntinuclearH2O20μL8℃5minNPCRRNA—5L1.085V25minRNA样品有三种（PRRSV、SVJE1.3.2Real-timePCRRNA6μLReactionMix（4X）2μL，混匀后室温放置2miACrtRationShoppr52μ5XAllineTmter4μ，AntinuclearH2O20μL℃8℃5min。RNA样品有三种（PRRSV、SVJEReal-timePCR体系，如下：体系： SYRPrmixEXⅡ（2x：10ALPCRForwardPrimer： 0.6ALPCRReversePrimer： 0.6ALDNA模板 2AL三蒸水 6.8AL20AL两步法PCR扩增标准程序：Stage1：预变性Reps：195℃30秒Stage2：PCR反应Reps：4095℃5秒60℃30秒Real-timePCR的扩增曲线和融解曲线，按照内参基因和目的基2ΔΔCTCTABI7300PCR（AppliedBiosystems公司进行。其中，每组试验设立三个重复。2.结果琼脂糖凝胶电泳检测结果高致病性猪繁殖于呼吸综合症活疫苗（JXA1-R株）检测结果从图1可以看出，LiaisonPlus、RNAOUT、TrollPlus和Queasy快速DNA/RNADHARNA图1PRRSVDNA琼脂糖凝胶电泳结果（M为Marker，0为空白对照，1-3、4-6、7-9、10-12、13-15分别为3个平行组，依次对应LiaisonPlus、RNAOUT、TrollPlus、柱式病毒DHARNA双提试剂盒、Queasy快速DNA/RNA共提试剂盒）猪瘟耐热保护剂活疫苗检测结果从图2可以看出，LiaisonPlus、RNAOUT、TrollPlus和Queasy快速DNA/RNA快速DNA/RNA共提试剂盒对应的组条带最清晰、亮度最高；LiaisonPlus和RNAOUT对应的组条带中度清晰、亮度中等，但两组之间无肉眼可见差距；TrollPlus对应的组清晰度较低，亮度低；柱式病毒DHARNA双提试剂盒对应的组未发现条带，表现不理想。图2CSFVDNA琼脂糖凝胶电泳结果（M为Marker，0为空白对照，1-3、4-6、7-9、10-12、13-15分别为3个平行组，依次对应LiaisonPlus、RNAOUT、TrollPlus、柱式病毒DHARNA双提试剂盒、Queasy快速DNA/RNA共提试剂盒）日本乙型脑炎弱毒活疫苗检测结果从图3可以看出，LiaisonPlus、RNAOUT、TrollPlus和Queasy快速DNA/RNA共提试剂盒对应的组之间，电泳条带亮度和清晰度很高。其中，QueasyDNA/RNA共提试剂盒对应的组条带最清晰、亮度最高；LiaisonPlusRNAOUTPlusDHARNA双提试剂盒对应的组未发现条带，表现不理想。图3JEVDNA琼脂糖凝胶电泳结果（M为Marker，0为空白对照，1-3、4-6、7-9、10-12、13-15分别为3个平行组，依次对应LiaisonPlus、RNAOUT、TrollPlus、柱式病毒DHARNA双提试剂盒、Queasy快速DNA/RNA共提试剂盒）Real-timePCR检测结果高致病性猪繁殖于呼吸综合症活疫苗（JXA1-R株）检测结果4可以看出，LiaisonPlusRNAOUT、TrollPlusDHARNAQueasyDNA/RNACT值均较低。其中，QueasyDNA/RNACT值最低；LiaisonPlus和RNAOUTCTPlusCTDHARNACT值最高。图4PRRSVReal-timePCR检测结果LiaisonPlusRNAOUTTrollPlusDHARNA双提试剂盒、QueasyDNA/RNA共提试剂盒）猪瘟耐热保护剂活疫苗检测结果5可以看出，LiaisonPlusRNAOUT、TrollPlusDHARNAQueasyDNA/RNACT值均较低。其中，QueasyDNA/RNACT值最低；LiaisonPlus和RNAOUTCT值其次，但两组间差距不明显；TrollPlus和柱式病毒DHARNA双提试剂盒对应的组CT值稍最高，但两组间差距不明显。图5CSFVReal-timePCR检测结果LiaisonPlusRNAOUTTrollPlusDHARNA双提试剂盒、QueasyDNA/RNA共提试剂盒）日本乙型脑炎弱毒活疫苗检测结果6可以看出，LiaisonPlusRNAOUT、TrollPlusDHARNAQueasyDNA/RNACT值均较低。其中，QueasyDNA/RNACT值最低；LiaisonPlus和RNAOUTCTPlusCT值稍高；柱式病毒DHARNA双提试剂盒对应的组CT值最高。图6JEVReal-timePCR检测结果LiaisonPlusRNAOUTTrollPlusDHARNA双提试剂盒、QueasyDNA/RNA共提试剂盒）讨论RNA的提取是分子生物学的基础[21]RNA更是科研研究和病原诊断的关键。只有获得高纯度、高浓度和完整性好RNADNAPCR、Northern杂交等下游分子生物学实验。RNA的提取关键在于组织细胞裂解。组织裂解方法有很多，包括胍盐裂解法、[22]。LiaisonPlusTrollRNAOUTRNA通常情况下，分子生物学试验只需单独提取一种类型的核酸（DNA/RNA）或蛋DNARNADHARNA双提试剂盒法、快灵生物科技有限公司QueasyDNA/RNADNARNA，毒性小，且获得的核酸完整性好，纯度高等。笔者所在实验室选取了市售的三种细胞裂解液（LiaisonPlus、TrollPlus和RNAOUT）DNA\RNA共提试剂盒（DHARNA双提试剂盒、Qa快速DNA/RNA共提试剂盒（PRRSV、RNARNAPCR并进行琼脂糖凝Real-timePCRPCRCTRNA质量作评价和比较。PRRSV，LiaisonPlusRNAOUTTrollPlusQueasyDNA/RNADNARNA质量好。因此，上述试剂可用于临床PRRSV的病毒检测以及定性分析。对于CSFV，Queasy快速DNA/RNALiaisonPlusRNAOUT，TrollPlusCSFV的病毒检测以及定性分QueasyDNA/RNALiaisonPlusRNAOUTJEV，QueasyDNA/RNA共提试剂盒所对应的组条带最清晰、亮度最高，LiaisonPlusRNAOUT，TrollPlusJEV的病QueasyDNA/RNA共提试剂盒、LiaisonPlusRNAOUT。Real-timePCRPRRSV，QueasyDNA/RNA共提试剂盒对CTDNARNALiaisonPlusRNAOUTDHARNA双提试剂盒TrollPlusPRRSVQueasyDNA/RNALiaisonPlus和RNAOUTCSFV，Queasy快速DNA/RNA共提试剂盒对应的组CT值最低，表明对应的DNA浓度和纯度最好，间接说明所提取的RNA质量最好。其次是LiaisonPlus和RNAOUTDHARNATrollPlus表现不理想。因此，CSFVQueasyDNA/RNA共提试剂盒、LiaisonPlusRNAOUTJEV，QueasyDNA/RNA共提试剂CTDNARNALiaisonPlusRNAOUTDHARNA双提试TrollPlusJEV的病毒检测以及定量分QueasyDNA/RNA共提试剂盒、LiaisonPlusRNAOUT。PRRSV，CSFVJEVRNARNA进行提取RNA病毒，具有代表性。通过比较分析实JEVRNA病毒进行检测QueasyDNA/RNALiaisonPlusRNAOUT两RNA质量好，利于后续实验的进行。随着科学技术的进步，市面上已经出现自动核酸提取仪，如ABI公司的ABIPRISMTM610096个样品的纯化工作，并且可RNADNA[23]96个样本，因此多数高校和科研机构并未普及。RNARNA提取方法应根据RNA提取的方法会越来越简便、快速、高效。参考文献：JunHChanHAsimplerapidandeffectivemethodfortotalRNAextractionfromTendentiousness[J].Biotechnology,2006,28:Brooks，Joseph，EdwardFKitsch，ThomasMannerist．MolecularCloning．ColdspringharborlaboratorypressNewYork，1989，2．[3]RNA[J]30(16):20-22．[4]王桂玲，黄东阳，刘戈飞.一种从动物组织中提取高质量总RNA的方法[J].生命科学研究,2003,03:275-278.[5]王桂玲，刘戈飞，黄东阳.从动物组织提取高质量总RNA方法的改进[J].生物技术通讯,2003,06:512-514.[6]ChomskySacchiN.SinglestepmethodofRNAisolationbyacidtheatre-in-the-roundphenol-chloroformextraction[J].Biochemist,1987,162:156-159[7]陈晖,何海福.植物组织总RNA提取方法的研究进展[J].甘肃农业,2006,8:228-230ChenH,HeHProgressofExtractionMethodsforPlantTissuesRNA[J].JournalofGinsuAgriculture,2006,8:228-230[8]杨占军,谷守琴,张健.几种植物组织总RNA提取方法的特点及疑难对策[J].安徽农业科学,2009,37(18):8341-8342YangZJ,GSQ,BhangJ.CharacteristicsofSeveralExtractionMethodsonTotalRNAinPlantTissuesandStrategiestoProblems[J].JournalofInhumanAgniSci,2009,37(18):8341-8342[9]吴丽娟,黎燕,胡美茹,等.改进ADS-Phenol法快速提取细胞总RNA[J].第三军医大学学报,1999,1(21):57-59WuLJ,LiY,HMR,ETAL.PreparationofcellulartotalRNAbyimprovedADS-phenolmethod[J].ActaAcademeMedicMilitantsInertial,1999,1(21),57-59姚玉新赵玲玲郝玉金RNA[J果树学报,2005,22(6):737-740FaoYX,ChaosLL,FaoYJ,ETAL.AModifiedBorateMethodSignificantlyEnhancestheYieldofHigh-QualityRNAfromApplePulp[J].Journal