定量与常规的差别

定量与常规的差别第一页，共二十七页，2022年，8月28日Opticon实时荧光定量PCR仪之如何定量？Ct值的概念Ct值的定义是PCR扩增过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的阈值所对应的循环次数。为什么要用Ct值定量实时荧光定量PCR方法利用循环阈值（Ct）的概念，在指数扩增的开始阶段进行检测，此时样品间的细小误差尚未放大，因此该Ct值具有极好的重复性。第二页，共二十七页，2022年，8月28日定量原理初始DNA量越多,荧光达到某一值（域值）时所需要的循环数越少Log浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数就可计算出样品中所含的模板量确定初始模板的浓度Opticon实时荧光定量PCR仪之第三页，共二十七页，2022年，8月28日SYBRGreen1MolecularBeacons

TaqMan荧光化学Opticon实时荧光定量PCR仪之第四页，共二十七页，2022年，8月28日AmplifluorRoche荧光化学Opticon实时荧光定量PCR仪之阴阳探针R1R2RQ第五页，共二十七页，2022年，8月28日SYBRGreenI工作原理Opticon实时荧光定量PCR仪之SYBRGreen1

结合到双链DNA的小沟部位SYBRGreen1

染料只有和双链DNA结合后才发荧光。GTTTGGCCCCCCCAAAGGGACTTGATAGCATCGTAA第六页，共二十七页，2022年，8月28日GTTTTTTGGGGCCCCCCCCAAAAATACCGGGGTTACGAACGGTAAT变性DNA未结合SYBRGreen1dye变性:无荧光信号SYBRGreenI工作原理Opticon实时荧光定量PCR仪之第七页，共二十七页，2022年，8月28日SYBRGreenI应用范围起始模板浓度定量融解曲线分析---可区分单一产物、变异产物、多种产物和（或）引物二聚体基因型分析Opticon实时荧光定量PCR仪之第八页，共二十七页，2022年，8月28日SYBRGreenI优点使用方便

---不必设计复杂的引物没有序列特异性

---可以用于不同的模板便宜灵敏Opticon实时荧光定量PCR仪之第九页，共二十七页，2022年，8月28日SYBRGreenI缺点与非特异性产物结合Opticon实时荧光定量PCR仪之第十页，共二十七页，2022年，8月28日Molecular

BeaconsMolecularBeaconsOpticon实时荧光定量PCR仪之发夹型杂交探针第十一页，共二十七页，2022年，8月28日MolecularBeacons原理：荧光谐振能量传递（FRET）

茎由互补配对的序列组成环与目标序列完全配对茎Opticon实时荧光定量PCR仪之荧光素淬灭剂环第十二页，共二十七页，2022年，8月28日变性:产生非特异性的荧光MolecularBeaconsOpticon实时荧光定量PCR仪之第十三页，共二十七页，2022年，8月28日MolecularBeaconsSNPTACCGGGGGTTACGAACGGTAATTTTTGCCCCCAAAAQ荧光素目标序列茎淬灭剂Opticon实时荧光定量PCR仪之第十四页，共二十七页，2022年，8月28日延伸:没有荧光MolecularBeaconsSNPOpticon实时荧光定量PCR仪之第十五页，共二十七页，2022年，8月28日MolecularBeacons应用范围定量起始模板浓度基因型分析鉴定产物单核苷酸多态性（SNP）检测Opticon实时荧光定量PCR仪之第十六页，共二十七页，2022年，8月28日MolecularBeacons优点对目标序列有很高的特异性用于SNP检测的最灵敏的试剂之一荧光背景低Opticon实时荧光定量PCR仪之第十七页，共二十七页，2022年，8月28日MolecularBeacons缺点设计困难无终点分析功能只能用于一个特定的目标价格较高Opticon实时荧光定量PCR仪之第十八页，共二十七页，2022年，8月28日TaqMan探针荧光素淬灭剂Opticon实时荧光定量PCR仪之TaqMan水解型杂交探针第十九页，共二十七页，2022年，8月28日TaqMan目标特异性探针5’为荧光素，3’为淬灭剂5’荧光素3’淬灭剂与目标序列互补Opticon实时荧光定量PCR仪之第二十页，共二十七页，2022年，8月28日TaqMan工作原理Opticon实时荧光定量PCR仪之退火:无荧光信号3’3’5’5’模板和探针杂交第二十一页，共二十七页，2022年，8月28日延伸:聚合反应5’5’3’3’TaqMan工作原理Opticon实时荧光定量PCR仪之第二十二页，共二十七页，2022年，8月28日3’3’5’5’延伸:Taq酶切下5’端荧光素出现荧光TaqMan工作原理Opticon实时荧光定量PCR仪之第二十三页，共二十七页，2022年，8月28日TaqManSNP分析TACCGGGGGTTACGAACGGTAATGA

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CCOpticon实时荧光定量PCR仪之第二十四页，共二十七页，2022年，8月28日TaqMan应用范围定量起始模板浓度基因型分析产物鉴定SNP分析Opticon实时荧光定量PCR仪之第二十五页，共二十七页，2022年，8月28日TaqMan优点对目标序列有很高的特异性

---特别适合于SNP检测与MolecularBeacons相比设计相对简单Opticon实时荧光定量PCR仪之第二十六页，共二十七页，2022年，8月28日兼容化学试剂总结结合于双链DNA的小沟中发夹型杂交探针水解型杂交探针