实验六质粒提取及琼脂糖凝胶电泳

实验六质粒提取及琼脂糖凝胶电泳第一页，共三十页，2022年，8月28日DNA重组：指不同来源的DNA片段共价连接，通过重新组合，构成了具有两个DNA分子遗传信息的新的重组体DNA。DNA体外重组技术：是在分子水平上，根据人们的需要以人工的方法感兴趣的目的基因，在体外与载体DNA分子重组，然后将重组子转入受体细胞，并筛选出表达重组DNA的活细胞，加以纯化、扩增、成为克隆，这一过程称为DNA体外重组技术。DNA体外重组技术是基因工程的核心内容。第二页，共三十页，2022年，8月28日基因克隆简介

目的基因

载体

酶切，连接

重组基因

转入

受体细胞筛选阳性克隆

分切、接转筛第三页，共三十页，2022年，8月28日第四页，共三十页，2022年，8月28日分子生物学实验流程图第一次第二次第三次第五页，共三十页，2022年，8月28日载体：可容忍外源性DNA片段插入，可在细胞间转移并能在细胞内自主复制的DNA分子。理想的质粒克隆载体应具有的特性：能在宿主细胞中独立复制，并能携带DNA片段一同扩增具有多种常用的限制性内切酶的单酶切位点,即多克隆位点(MCS,multiplecloningsites)，便于进行克隆分子量小，可插入较大的外源DNA而不影响复制易于导入受体细胞具有容易操作的检测表型。如抗生素抗性、α-互补显色反应（蓝白斑筛选）表达型载体应配备与宿主细胞相适应的启动子，前导序列，增强子等调控元件生物安全性好第六页，共三十页，2022年，8月28日载体种类：

质粒噬菌体载体酵母人工染色体（YAC）病毒载体常用的克隆载体第七页，共三十页，2022年，8月28日质粒1.定义：质粒是独立存在于细菌染色体外的，能独立复制的环状双链DNA分子。可赋予宿主细胞一定生物学性状，如：抗生素抗性Ampr等。第八页，共三十页，2022年，8月28日2．来源存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多。3．分类质粒按复制方式分为两种类型：松弛型质粒和严紧型质粒①严紧型质粒(Stringentcontrol)严紧型质粒只在细胞周期的一定阶段进行复制,当染色体不复制时,它也不能复制,通常每个细胞内只含有1个或几个质粒,如F因子。②松弛型质粒(Relaxedcontrol)松弛型质粒在整个细胞周期中随时可以复制,在每个细胞中有许多拷贝,一般在20个以上,如Col质粒。松弛型质粒的复制不需要质粒编码的功能蛋白，完全依赖于宿主提供的半衰期较长的酶。即使蛋白质合成受抑制，质粒的复制依然进行。当抑制蛋白质合成并阻断细菌染色体复制的氯霉素等抗生素存在时，质粒的拷贝数可达2000-3000拷贝。第九页，共三十页，2022年，8月28日4.质粒的构型（1）.超螺旋DNA（supercoiledDNA,scDNA）超螺旋第十页，共三十页，2022年，8月28日（2）.开环DNA(opencircleDNA,ocDNA)开环DNA第十一页，共三十页，2022年，8月28日（3）.线形DNA（linearcircleDNA，lcDNA)第十二页，共三十页，2022年，8月28日与本实验有关的两种质粒1.PBR322(作为目的基因供体)4363bp第十三页，共三十页，2022年，8月28日2.PUC18(作为载体）第十四页，共三十页，2022年，8月28日实验质粒DNA提取第十五页，共三十页，2022年，8月28日

实验目的1.掌握碱裂解法提取质粒的原理和方法。2.掌握琼脂糖凝胶电泳的原理和基本操作技术。第十六页，共三十页，2022年，8月28日碱裂解法提取质粒原理碱裂解法提取质粒DNA的原理是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA的分子大小和结构不同利用二者之间变性和复性的差异来实现分离的。第十七页，共三十页，2022年，8月28日强碱及机械剪切力①染色体DNA断裂成小片段线性DNA（机械剪切力)②染色体氢键断裂，双链解离变性（强碱）；①质粒DNA保持闭合环状；②双链DNA并未完全分离（强碱）。酸中和至中性变性的染色体DNA与变性的蛋白质以及细胞碎片凝聚成网络状大分子不溶性沉淀物质粒DNA又恢复天然构型，溶解在上清液中第十八页，共三十页，2022年，8月28日琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳分离DNA原理第十九页，共三十页，2022年，8月28日带电颗粒在电场中泳动的速度由于电场力的作用，使带电颗粒在电场中向一定方向泳动；此颗粒在泳动过程中还受到一个相反方向的摩擦力(f·υ)阻挡；当这两种力相等时，颗粒则以均匀速度(υ)向前泳动第二十页，共三十页，2022年，8月28日式中f为摩擦系数。根据Stoke公式，阻力大小取决于带电颗粒的大小、形状以及所处介质的黏度，即式中f——阻力，牛顿；r——粒子半径，米；

η——介质粘度，牛顿·秒/米2；第二十一页，共三十页，2022年，8月28日从公式看出，带电颗粒在电场中泳动的速度与电场强度和带电颗粒的净电荷量成正比，而与颗粒半径和介质黏度成反比

第二十二页，共三十页，2022年，8月28日电泳迁移率电泳迁移率（mobility）:在电位强度E的影响下，带电颗粒在时间t中的迁移距离d。d为带电颗粒泳动的距离(cm)；l

为支持物的有效长度(cm)；t为通电时间(秒)；V为加在支持物两端的实际电压(V)

单位是cm2·sec-1·V-1第二十三页，共三十页，2022年，8月28日实验步骤加1.5ml培养物于EP管，12000rpm×30S重复一次，最后一次将EP管放在吸水纸上扣干除去上清，加入冰的100µl溶液I，剧烈振荡EP管

以下动作要轻柔

加入200µl溶液II，温和颠倒数次，室温放置3min

加入150µl冰溶液III，温和颠倒2-3次，冰浴5min，12000rpm×10min转移上清到新EP管（统一吸400µl

）加入等体积氯仿，温和混匀，12000rpm×2min

上层水相转移到新EP管（统一吸300µl

）加入2倍体积无水乙醇，颠倒混匀，室温静置5min，12000rpm5min

弃上清，沉淀中加1ml70%乙醇，12000rpm×2min

去上清，管平放室温静置20-30min，40µlTE溶解DNA

第二十四页，共三十页，2022年，8月28日琼脂糖凝胶板的制备（封板、制备1%凝胶、倒胶、插梳、凝固后拔梳）倒缓冲液，加样（取质粒DNA样品液10μl+2μl上样缓冲液，轻轻混匀，避免气泡）电泳（100V0.5小时，5V/cm）检测（紫外灯下检测）第二十五页，共三十页，2022年，8月28日主要试剂及作用1.solutionⅠ：①蔗糖：增加溶液的粘度,减少抽提过程中的机械剪切作用,防止破坏质粒.(保护作用)②EDTA：络合掉镁等二价金属离子,防止DNA酶对质粒分子的降解作用。（保护作用）③Tris•HCl

：能使溶菌液维持溶菌作用的最适PH范围（缓冲作用）第二十六页，共三十页，2022年，8月28日2.solutionII：①SDS的作用裂解细胞和蛋白质变性作用②NaOH（PH>12）的作用是破坏氢键，使DNA分子变性（DNA变性作用）0.2mol/LNaOH1%SDS临用前新鲜配制.第二十七页，共三十页，2022年，8月28日3.solutionIII：①HAC溶液能中和溶液Ⅱ的碱性，使质粒DNA复性。②KAC会与SDS形成溶解度很低的盐，并与蛋白质形成沉淀而除去；溶液中的染色体DNA也会与蛋白质-SDS复合物缠绕成大分子而与