实验一显微摄影技术

实验一显微摄影技术第一页，共二十七页，2022年，8月28日一、实验目的1、了解光学显微镜结构原理并熟练掌握其操作方法；2、掌握显微摄影技术操作流程，了解传统摄影技术中照片洗印操作流程；3、了解暗视野显微镜、相差显微镜、荧光显微镜、微分干涉差显微镜、倒置显微镜、等的构造和使用方法。第二页，共二十七页，2022年，8月28日二、实验原理

显微镜的放大效能是由其照明系统所使用光的波长和透镜系统的数值孔径决定，缩短使用的光波长或增加数值孔径可以提高分辨率。可见光的光波振幅较窄，因此使用较短波长的紫外光作为光源系统，可以提高分辨率。而对于一台普通光学显微镜，一般来说，提高其分辨率主要通过提高数值孔径（选用镜口角大的透镜，提高介质折射率）。第三页，共二十七页，2022年，8月28日基础知识显微镜概述：

显微镜是观察细胞的主要工具。根据光源不同，可分为光学显微镜和电子显微镜两大类。前者以可见光（紫外线显微镜以紫外光）为光源，后者则以电子束为光源。1.光学显微镜普通生物显微镜由3部分构成：①照明系统：包括光源和聚光器。②光学放大系统：由物镜和目镜组成，是显微镜的主体。③机械装置：用于固定材料和观察方便，包括镜台(载物台)、调节器和、物镜转换器(旋转器)等。

尼康E-600显微镜

第四页，共二十七页，2022年，8月28日光学显微镜基本结构：1.

照明灯(Lamp)2.

聚光器(Condenser)3.

载物台和切片夹(Mechanicalstageandspecimenretainer)4.

推进器(Mechanicalstageadjustmentknob)5.

物镜(Objectives)6.

粗细螺旋(Courseandfinefocusknob)7.

目镜(Oculars)8.

照相机等接口(Connectiontocamera,etc.)第五页，共二十七页，2022年，8月28日2.荧光显微镜

尼康E800荧光DIC显微镜

荧光显微镜照片（微管呈绿色、微丝红色、核蓝色）

第六页，共二十七页，2022年，8月28日荧光显微镜(Fluorescencemicroscope)：以紫外线为光源,用以照射被检物体，使之发出荧光，然后在显微镜下观察物体的形状及其所在位置。用于研究细胞内物质的吸收、运输、化学物质的分布及定位等。细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线照射后可发荧光；另有一些物质本身虽不能发荧光，但如果用荧光染料或荧光抗体染色后，经紫外线照射亦可发荧光，荧光显微镜就是对这类物质进行定性和定量研究的工具之一。第七页，共二十七页，2022年，8月28日3.激光共聚焦扫描显微镜

LCSM照片蓝色为细胞核，绿色为微管

第八页，共二十七页，2022年，8月28日

用激光作扫描光源，逐点、逐行、逐面快速扫描成像，扫描的激光与荧光收集共用一个物镜，物镜的焦点即扫描激光的聚焦点，也是瞬时成像的物点。由于激光束的波长较短，光束很细，所以共焦激光扫描显微镜有较高的分辨力，大约是普通光学显微镜的3倍。系统经一次调焦，扫描限制在样品的一个平面内。调焦深度不一样时，就可以获得样品不同深度层次的图像，这些图像信息都储于计算机内，通过计算机分析和模拟，就能显示细胞样品的立体结构。激光共聚焦扫描显微镜既可以用于观察细胞形态，也可以用于细胞内生化成分的定量分析、光密度统计以及细胞形态的测量。

第九页，共二十七页，2022年，8月28日4.暗视野显微镜

暗视野显微镜（darkfieldmicroscope）的聚光镜中央有当光片，使照明光线不直接进人物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的背景是黑的，物体的边缘是亮的。利用这种显微镜能见到小至4-200nm的微粒子，分辨率可比普通显微镜高50倍。5.相差显微镜

一种介壳虫的染色体

第十页，共二十七页，2022年，8月28日

相差显微镜最大的特点是可以观察未经染色的标本和活细胞。活细胞和未染色的生物标本，因细胞各部细微结构的折射率和厚度的不同，光波通过时，波长和振幅并不发生变化，仅相位发生变化(振幅差)，这种振幅差人眼无法观察。而相差显微镜通过改变这种相位差，并利用光的衍射和干涉现象，把相差变为振幅差来观察活细胞和未染色的标本。相差显微镜和普通显微镜的区别是:用环状光阑代替可变光阑，用带相板的物镜代替普通物镜，并带有一个合轴用的望远镜。第十一页，共二十七页，2022年，8月28日6.偏光显微镜

将普通光改变为偏振光进行镜检的方法，以鉴别某一物质是单折射（各向同行）或双折射性（各向异性）。偏光显微是鉴定物质细微结构光学性质的一种显微镜。凡具有双折射性的物质，在偏光显微镜下就能分辨的清楚，当然这些物质也可用染色法来进行观察，但有些则不可能，而必须利用偏光显微镜。双折射性是晶体的基本特征。因此，偏光显微镜被广泛地应用在矿物、化学等领域。在生物学中，很多结构也具有双折射性，这就需要利用偏光显微镜加以区分。在植物学方面，如鉴别纤维、染色体、纺锤丝、淀粉粒、细胞壁以及细胞质与组织中是否含有晶体等。在植物病理上，病菌的入侵，常引起组织内化学性质的改变，可以偏光显微术进行鉴别。在人体及动物学方面，常利用偏光显微术来鉴别骨骷、牙齿、胆固醇、神经纤维、肿瘤细胞、横纹肌和毛发等。

第十二页，共二十七页，2022年，8月28日7.微分干涉差显微镜DIC显微镜其优点是能显示结构的三维立体投影影像。与相差显微镜相比，其标本可略厚一点，折射率差别更大，故影像的立体感更强。DIC显微镜下的硅藻（伪彩色）第十三页，共二十七页，2022年，8月28日8.倒置显微镜

组成和普通显微镜一样，只不过物镜与照明系统颠倒，前者在载物台之下，后者在载物台之上，用于观察培养的活细胞，具有相差物镜。第十四页，共二十七页，2022年，8月28日9.透射电子显微镜

JEM-1011透射电子显微镜

莱卡超薄切片机

第十五页，共二十七页，2022年，8月28日用透过样品的电子束使其成像的电子显微镜。在光学显微镜下无法看清亚显微结构或超微结构。电子束的波长要比可见光和紫外光短得多。目前TEM的分辨力可达0.2nm。由于电子束的穿透力很弱，因此用于电镜的标本须制成厚度约50nm左右的超薄切片。这种切片需要用超薄切片机（ultramicrotome）制作。电子显微镜的放大倍数最高可达近百万倍

第十六页，共二十七页，2022年，8月28日要知道的几个重要的分辨率

人眼：0.2mm光学显微镜：0.2um电子显微镜：0.2nm第十七页，共二十七页，2022年，8月28日内质网透射电镜图（伪彩色）

冰冻蚀刻电镜照片

第十八页，共二十七页，2022年，8月28日10.扫描电子显微镜

JEOL扫描电子显微镜人类血细胞SEM照片

第十九页，共二十七页，2022年，8月28日厚标本和薄标本4-5um2um基础知识第二十页，共二十七页，2022年，8月28日显微摄影装置的安装与调试↓显微镜的光路调整↓装入胶片↓取景聚焦↓暴光:1/15sec(应先测光:绿灯亮可以正确暴光)↓黑白胶片的冲洗:显影3min→停显10sec→定影15min→水洗:流水冲洗30min→晾干↓印相放大:取景聚焦→暴光→显影→停显10sec→定影15min→水洗:流水冲洗30min↓上光剪切三、传统胶片显微摄影过程第二十一页，共二十七页，2022年，8月28日显微摄影技术利用显微摄影装置拍摄显微镜(或解剖镜)视野中物象的技术称为显微摄影。显微摄影技术主要包括两个方面：拍摄：

需要一套完备的显微摄影装置洗印放大：需要一个较好的暗室和成套的洗印放大设备。第二十二页，共二十七页，2022年，8月28日三、实验用品双目显微镜，生物标本，擦镜纸等四、实验内容1、双目显微镜的操作规范：取送→放置→对光→低倍物镜使用→高倍物镜使用→油镜使用→保养维护第二十三页，共二十七页，2022年，8月28日显微镜使用及绘图（1）取、放显微镜的正确做法

一手握镜臂，一手托镜座，托在胸前。小心轻放，避免震动。放在距离桌边5-10cm左右为好。（2）对光

先将低倍物镜对准通光孔，调整反光镜（外光源显微镜）或电源电压（内光源显微镜），使视野中的光线明亮而不刺眼。也可以改变孔径光圈或改变聚光器的位置达到改变照明的目的，但反光镜一定要调到最佳的角度。（3）放置标本

将标本放在载物台上，固定好。将玻片中有标本的地方移到通光孔的中央。如果位置不是在中央，因为物镜的观察范围有限，有可能观察不到所要看到的内容。

第二十四页，共二十七页，2022年，8月28日显微镜的正确使用方法（4）调整焦距

眼睛不要看目镜，要从侧面注视低倍镜与标本。慢慢转动粗准焦距螺旋，使物镜与玻片标本接近。待目测低倍镜与标本盖玻片之间的距离比低倍物镜的工作距离（7.63mm）小一些时，即可注视目镜，并向相反的方向调节粗准焦螺旋，使物镜与标本的距离增大，慢慢会看到视野中物像的出现。注意这一操作如果违章有可能会损坏仪器或标本！（5）使用低倍镜观察移动标本，找到要观察的位置。用细准焦螺旋调清物像。（6）使用高倍镜观察

将需观察的位置移到显微镜视野的中央，将高倍镜换入即可。使用高倍镜前一定要用低倍镜进行观察。不可直接用高倍镜。第二十五页，共二十七页，2022年，8月28日显微镜的正确使用方法（7）使用油镜观察在观察细小结构时需要使用100倍的物镜。100倍的物镜需要在油的介质中工作，故称油镜或油浸物镜。油镜需在物镜与标本之间充上一种折光率与玻璃一样高的介质，通常使用香柏油，才能使物像清晰。方法是先低倍，后高倍，再用油镜。（8）显微镜用后应先转动物镜转换器，将高倍物镜或油镜旋出通光孔的上方，再取下玻片标本。一定要及时清除油镜上的油。将反光镜放在竖直的位置，以减少落上灰尘。保持清洁，罩好防尘罩。

第二十六页，共二十七页，2022年，8月28日生物绘图方法（1）看清楚把正常的、一般的结构与偶然的、人为的一些结构区分开，然后选择那些有代表性的典型的部位进行绘图。（2）定位置先确定