实验重组与细胞转化年博

实验重组与细胞转化年博1第一页，共三十九页，2022年，8月28日实验安排实验安排实验一：DNA重组与转化实验二：重组DNA提取与鉴定实验三：基因组DNA制备实验四：PCR实验五：SDS实验六：WesternBlot实验七八：SouthernBlot课程负责人：潘銮凤教师：邵红霞（秘书）王松梅支秀玲2第二页，共三十九页，2022年，8月28日实验流程图质粒重组转化鉴定制备探针实验一、二SouthernBlot实验七、八

细胞培养基因组DNA的制备浓度测定

PCR扩增实验三、四3细胞总蛋白提取浓度测定SDSWesternBlot实验五、六3第三页，共三十九页，2022年，8月28日温馨提醒女厕在3、5楼西侧；男厕在2、4楼西侧寄包柜密码仅一次有效，再次寄存需重新启动。非贵重物品建议不要寄存，可放置旁边的架子上走廊左侧有饮水机4第四页，共三十九页，2022年，8月28日实验注意事项1.实验用品分组（3人一组）标记，放于实验桌上。实验开始时清点；实验结束，请各组同学将用品归于原位，整理好本组桌面后再离开。需要回收的器皿初步冲洗后浸泡在水槽内的盆中（如玻璃耗材等，有疑问请咨询带教老师）实验开始前请勿乱翻动！每组2个盆，1个桶，分别放冰，液体垃圾，固体垃圾，结束时每组自行清理5第五页，共三十九页，2022年，8月28日2.实验试剂：常规试剂通常3人一组放在桌上，部分试剂一大桌放一管需要低温放置的试剂在讲台，需到讲台来加样，特别是酶，加完及时放回原位有些常规用试剂（如水，加样buffer），可室温保存，多次使用6第六页，共三十九页，2022年，8月28日3.离心机的正确使用：（注意安全和仪器保护）

平衡——15ml连同托架一起平衡，1.5ml目测体积，对应位置放置离心机盖（包括内盖）

最高速度不能超限离心时，请等到达设定转速并运转正常后再离开离心结束如是低温离心，请先开机将离心机预冷，离心间歇阶段关机盖，离心结束，请打开机盖晾干7第七页，共三十九页，2022年，8月28日4.加样枪Pipet的正确使用

当加样枪转到它的最高体积时，绝对不能再往前转，不然这把加样枪就会被损坏，完全不能再用。选用合适量程的加样器正确进行刻度调节（不能旋过头）清洁爱护加样器吸样品和加样品时的手势合理8第八页，共三十九页，2022年，8月28日加样枪的保护：吸取样品时，加样枪不要碰到管口或瓶壁吸取酚、氯仿等腐蚀性液体时，要慢吸快放刻度调试和清洗消毒保证吸取样品量的准确并且不造成试剂浪费

9第九页，共三十九页，2022年，8月28日加样前，先将EP管轻弹几下混匀，然后再进行短暂离心后才能吸取样品吸取样品的时候，为保证吸取量的准确，需尽可能将枪头深入液体深部吸取粘稠的样品如DNA时，宜慢慢吸取以保证量的准确，还可用同批枪头吸取水分以观察液体在枪头上的位置以保证吸取量的准确先加体积大的样品，特别是水，然后再加小体积的样品或酶等小体积的样品或酶要加入到液体中，并需轻轻吹打几次以混匀关于加样枪使用，以下说法正确吗？√×√√×10第十页，共三十九页，2022年，8月28日5.实验中请注意化学试剂对人体的伤害。（带手套）

如酚有腐蚀性；溴化乙啶有致癌之嫌；丙烯酰胺有神经毒性；某些酸碱，尤其浓酸浓碱的腐蚀性；等等。（严防手套造成二次污染）6.紫外线会造成眼睛损伤。在紫外检测仪上观察电泳条带时要盖好有机玻璃板，或戴上防护面罩。7.值日生将按组轮流，负责整理实验室。值日生负责清理实验室，倒垃圾，最后离开11第十一页，共三十九页，2022年，8月28日实验报告撰写实验名称、实验时间、学生姓名、学号、专业、带教老师等实验目的、实验原理、实验器材和试剂（可不写）、实验步骤（简单）、实验结果、实验注意事项等实验讨论（对实验过程、结果的讨论；自己的体会等）（重点）实验报告要求每人独立完成，分四次上交12第十二页，共三十九页，2022年，8月28日仪器及位置介绍恒温气浴摇床412室超净工作台13第十三页，共三十九页，2022年，8月28日410室制冰机低温冰箱14第十四页，共三十九页，2022年，8月28日402室PCR仪微孔板分光光度计+Take3™超微量多体积检测板15第十五页，共三十九页，2022年，8月28日交联仪杂交炉402室16第十六页，共三十九页，2022年，8月28日水浴锅实验室侧边台脱色摇床17第十七页，共三十九页，2022年，8月28日1.5ml离心机台式（低温）离心机实验室侧边台微波炉18第十八页，共三十九页，2022年，8月28日电热恒温培养箱实验室侧边台分光光度计19第十九页，共三十九页，2022年，8月28日15ml离心机台式（低温）离心机实验室后面边台20第二十页，共三十九页，2022年，8月28日实验室桌上漩涡振荡器常温低速小离心机21第二十一页，共三十九页，2022年，8月28日可调微量加样器和加样头实验室桌上22第二十二页，共三十九页，2022年，8月28日接种环推棒实验室桌上23第二十三页，共三十九页，2022年，8月28日长玻璃试管刻度吸管滴管实验室桌上离心管24第二十四页，共三十九页，2022年，8月28日一、实验目的1．CaCl2法制备感受态细胞（E.coliHB101）2．目的基因与载体的连接

（c-myc＋pSV；粘端连接）3．重组质粒转化大肠杆菌并筛选转化体

（HB101；Ampr）实验一 DNA重组与细胞转化第二十五页，共三十九页，2022年，8月28日二、基因工程技术的基本内容质粒载体（pSV）的构建目的基因（c-myc基因片段）的获取载体与目的基因的连接（粘端连接）重组体导入受体细胞（CaCl2法制备感受态细胞）重组体的鉴定目的基因在细胞中的表达表达产物的分离、鉴定26第二十六页，共三十九页，2022年，8月28日pBR322pSV3.5kbBamHIXbaIc-mycDNA片段4.8kbT4DNA连接酶大肠杆菌HB101CaCl2法感受态细胞转化Amp平板转化推板孵育过夜8.5kbBamHIXbaIpSV27第二十七页，共三十九页，2022年，8月28日pSV-c-mycBamHIXbaIc-myc基因片段4.8kbpSV2载体片段3.5kbpSVcmyc1[pmetD](ATCC®41029™)-TCTAGA--AGATCT-粘性末端防止载体的自身环化目的基因定向插入28第二十八页，共三十九页，2022年，8月28日目的基因（c-myc基因片段）的获取c-myc基因是myc基因家族的重要成员之一c-myc基因与多种肿瘤发生发展有关本实验采用的4.8kbc-myc基因位于2,3外显子区域BamHI和XbaI双酶切处理29第二十九页，共三十九页，2022年，8月28日

载体与目的基因的连接构建重组子1.平端连接

增加DNA浓度或提高连接酶浓度以提高连接效率2.粘端连接

效率较高，加入连接酶后可立即转化，即有转化子出现3.粘-平连接30第三十页，共三十九页，2022年，8月28日连接酶的选择：

T4DNA连接酶：适用粘端、平端连接

可用于DNA-RNA，RNA-RNA杂交体大肠杆菌DNA连接酶：适用粘端连接（也可用于平端，效率低）连接温度：

一般12~16℃，也可提高温度到22℃载体与目的基因的比例：

摩尔比约1：1~1：531第三十一页，共三十九页，2022年，8月28日转化：将异源DNA分子引入另一细胞，使受体细胞获得新的遗传性状。感受态细胞：受体细胞经特殊方法（如电击、CaCl2等处理，细胞膜的通透性发生改变，允许带外源DNA的载体分子进入的状态，称之。转化体的筛选：选择性培养基

如：Amp抗性平板32第三十二页，共三十九页，2022年，8月28日四、实验步骤

（详见实验讲义）

1.目的基因c-myc与pSV质粒载体的连接(粘端)目的基因片段（4.8kb），20ng/μl3μL载体DNA（3.5kb），20ng/μl1.5μL10×buffer1μLT4DNA连接酶（5U/μl)0.5μL

ddH2O4μL

总体积：10μL

混匀，22℃水浴中温育1小时，4℃保存备用。

注意：加样前短暂离心加样顺序保证每个样品加入其中加样完成后混匀后离心33第三十三页，共三十九页，2022年，8月28日2.CaCl2法制备感受态细胞注意：最好在超净工作台内进行，或火焰旁5cm无菌圈注意无菌操作和冰浴离心前必须平衡34第三十四页，共三十九页，2022年，8月28日倒入经冰预冷的15mL离心管，冰浴10min37℃振摇约2h，细菌长至云雾状取0.1mL大肠杆菌HB101培养物，加至5mLLB培养液中4℃，4000rpm，离心10min弃上清，在纸巾上倒置1min，重悬于200μL0.1mol/LCaCl2分装成50μL/管沉淀重悬于冰预冷的1mL，0.1mol/LCaCl2，混匀转入1.5mL离心管，冰浴10min4℃，4000rpm，离心10min弃上清，在纸巾上倒置1min35第三十五页，共三十九页，2022年，8月28日3.重组质粒转化感受态细胞5μL连接产物或阳性对照质粒1μL分别加入50μL感受态细胞，冰浴30min42℃90sec立即冰浴1~2min分别加入LB培养液150μL，37℃振摇45min分别取100μL铺板于含Amp的LB平板转移要快，温度要准确37℃温箱培养过夜36第三十六页，共三十九页，2022年，8月28日影响转化效率的因素1.感受