第二章蛋白质化学

第二章蛋白质化学导学掌握蛋白质的分子组成与结构熟悉蛋白质的理化；常用分离、纯化技术的基本原理。了解蛋白质分子结构与功能的关系；蛋白质的分类以及重要的活性肽。教学内容蛋白质的分子组成蛋白质的分子结构蛋白质的理化性质与分离纯化蛋白质的分类一、什么是蛋白质?蛋白质(protein)是由许多氨基酸(aminoacids)通过肽键(peptidebond)相连形成的高分子含氮化合物。二、蛋白质的生物学重要性1.蛋白质是生物体重要组成成分分布广：所有器官、组织都含有蛋白质；细胞的各个部分都含有蛋白质。含量高：蛋白质是细胞内最丰富的有机分子，占人体干重的45％，某些组织含量更高，例如脾、肺及横纹肌等高达80％。1）作为生物催化剂（酶）2）代谢调节作用3）免疫保护作用4）物质的转运和存储5）运动与支持作用6）参与细胞间信息传递2.蛋白质具有重要的生物学功能3.氧化供能蛋白质的分子组成

TheMolecularComponentofProtein第一节组成蛋白质的元素主要有C、H、O、N和S。

有些蛋白质含有少量磷、硒或金属元素铁、铜、锌、锰、钴、钼，个别蛋白质还含有碘。各种蛋白质的含氮量很接近，平均为16%。100克样品中蛋白质的含量(g%)=每克样品含氮克数×6.25×1001/16%蛋白质元素组成的特点一、氨基酸

——组成蛋白质的基本单位存在自然界中的氨基酸有300余种，但组成人体蛋白质的氨基酸仅有20种，且均属L-氨基酸（甘氨酸除外）。H甘氨酸CH3丙氨酸L-氨基酸的通式R氨基酸结构特点：20种编码氨基酸氨基酸的不同在于R侧链不同均为L-α-氨基酸（甘氨酸、脯氨酸除外）氨基酸的旋光异构除了甘氨酸以外，其它氨基酸的α-碳原子都是手性碳原子，有D和L构型之分，甘氨酸除外。什么是α-氨基酸连接一个氨基、一个羧基、一个氢原子和一个侧链基团（R）的碳原子叫作α-碳原子。具有α-碳原子的氨基酸称为α-氨基酸。合成蛋白质的20种标准氨基酸中，只有脯氨酸为亚氨基酸，其余都是α-氨基酸。（二）氨基酸的分类非极性中性氨基酸极性中性基氨基酸极性酸性氨基酸极性碱性氨基酸根据R基极性大小分：R基有极性，但不带电，呈亲水性R基无极性，呈疏水性R基有极性，电离后R基带负电荷R基有极性，电离后R基带正电荷甘氨酸

glycine

Gly

G

5.97丙氨酸

alanineAlaA

6.00缬氨酸

valineValV

5.96亮氨酸

leucineLeuL

5.98异亮氨酸

isoleucineIleI

6.02苯丙氨酸

phenylalaninePheF

5.48脯氨酸

prolineProP

6.30非极性疏水性氨基酸色氨酸

tryptophanTryW

5.89丝氨酸

serineSerS

5.68酪氨酸

tyrosineTyrY

5.66

半胱氨酸

cysteineCysC

5.07

蛋氨酸

methionine

MetM

5.74天冬酰胺

asparagineAsnN

5.41

谷氨酰胺

glutamineGlnQ

5.65

苏氨酸

threonineThrT5.602.极性中性氨基酸天冬氨酸

asparticacidAspD

2.97谷氨酸

glutamicacidGluE

3.22赖氨酸

lysineLysK

9.74精氨酸

arginineArgR

10.76组氨酸

histidineHisH

7.593.酸性氨基酸4.碱性氨基酸几种特殊氨基酸脯氨酸（亚氨基酸）

半胱氨酸

+胱氨酸二硫键-HH（二）氨基酸的理化性质1.两性解离及等电点等电点(isoelectricpoint,pI)

在某一pH的溶液中，氨基酸解离成阳离子和阴离子的趋势及程度相等，成为兼性离子，呈电中性。此时溶液的pH值称为该氨基酸的等电点。氨基酸具有氨基、羧基等能接受H+而成——NH3+具碱性能电离出H+而成——COO-具酸性pH=pI+OH-pH>pI+H++OH-+H+pH<pI氨基酸的兼性离子

阳离子阴离子2.紫外吸收色氨酸、酪氨酸的最大吸收峰在280nm

附近。大多数蛋白质含有这两种氨基酸残基，所以测定蛋白质溶液280nm的光吸收值是分析溶液中蛋白质含量的快速简便的方法。3.茚三酮反应氨基酸与茚三酮水合物共热，可生成蓝紫色化合物，其最大吸收峰在570nm处。由于此吸收峰值与氨基酸的含量存在正比关系，因此可作为氨基酸定量分析方法。茚三酮反应

（蓝紫色）脯氨酸、羟脯氨酸与茚三酮反应生成黄色化合物二、肽*肽键(peptidebond)是由一个氨基酸的-羧基与另一个氨基酸的-氨基脱水缩合而形成的化学键。（一）肽(peptide)+-HOH甘氨酰甘氨酸肽键肽键有部分双键性质肽键由于共振而具有部分双键性质，因此，肽键比一般C-N键短，且不能自由旋转肽键原子及相邻的a碳原子组成肽平面相邻的a碳原子呈反式构型肽键比一般C-N键短肽键为一平面相邻的a碳原子呈反式构型肽键平面*肽是由氨基酸通过肽键缩合而形成的化合物。*两分子氨基酸缩合形成二肽，三分子氨基酸缩合则形成三肽……*肽链中的氨基酸分子因为脱水缩合而基团不全，被称为氨基酸残基(residue)。*由十个以内氨基酸相连而成的肽称为寡肽(oligopeptide)，由更多的氨基酸相连形成的肽称多肽(polypeptide)。N末端：多肽链中有自由氨基的一端C末端：多肽链中有自由羧基的一端多肽链有两端*多肽链(polypeptidechain)是指许多氨基酸之间以肽键连接而成的一种结构。多肽链的结构

侧链N-末端C-末端主链骨架HOHN末端C末端牛核糖核酸酶（二）生物活性肽1.谷胱甘肽(glutathione,GSH)功能基：-SH解毒剂、抗氧化剂GSH过氧化物酶H2O22GSH2H2OGSSG

GSH还原酶NADPH+H+NADP+

体内许多激素属寡肽或多肽神经肽(neuropeptide)2.多肽类激素及神经肽蛋白质的分子结构

TheMolecularStructureofProtein

第二节第二节蛋白质的分子结构蛋白质的分子结构基本结构空间结构一级结构二级结构三级结构四级结构蛋白质的分子结构包括一级结构(primarystructure)二级结构(secondarystructure)三级结构(tertiarystructure)四级结构(quaternarystructure)高级结构定义蛋白质的一级结构是指多肽链中氨基酸的排列顺序。一、蛋白质的一级结构主要的化学键肽键，有些蛋白质还包括二硫键。

一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学功能的基础。二、蛋白质的二级结构蛋白质分子中某一段肽链的局部空间结构，即该段肽链主链骨架原子的相对空间位置，并不涉及氨基酸残基侧链的构象

。定义

主要的化学键：

氢键

（一）肽单元参与肽键的6个原子C1、C、O、N、H、C2位于同一平面，C1和C2在平面上所处的位置为反式(trans)构型，此同一平面上的6个原子构成了所谓的肽单元

(peptideunit)

。在肽平面上，2个C处于反式位置，N-C键和C-C键可以旋转，主链构象的形成与改变就是通过肽平面围绕C旋转来实现的。蛋白质二级结构的主要形式

-螺旋(-helix)

-折叠(-pleatedsheet)

-转角(-turn)

无规卷曲(randomcoil)

（二）-螺旋鲍林是著名的量子化学家，他在化学的多个领域都有过重大贡献。曾两次荣获诺贝尔奖金（1954年化学奖，发现蛋白质的-螺旋结构，1962年和平奖）。

α-螺旋（α-helix）

右手螺旋

肽平面围绕C旋转盘绕形成。

每周含3.6个残基

螺距0.54nm

作用键：氢键（由肽键的羰基O与向后第五个氨基酸的氨基H形成，非常稳定)。螺旋直径：0.5nm0.50nm0.54nm氢键α-碳原子侧链（三）-折叠-sheet多肽链局部肽段的主链呈锯齿状伸展状态2.β-折叠

（β-sheet）锯齿状一个折叠2AAR基两侧交错排列顺向平行(0.65nm)、逆向平行(0.7nm)作用键：氢键(相邻折叠肽段的连接)稳定平行俯视侧视反平行俯视侧视（四）-转角和无规卷曲-转角无规卷曲是用来阐述没有确定规律性的那部分肽链结构。-转角常位于肽链进行180度回转是的转角上4个AA组成氢键第一AA羰基O与第四AA氨基H形成第二个AA残基为脯氨酸，其它残基常为Gly、Asp、Asn、Trp（五）模体（超二级结构）在许多蛋白质分子中，可发现二个或三个具有二级结构的肽段，在空间上相互接近，形成一个特殊的空间构象，被称为模体(motif)。钙结合蛋白中结合钙离子的模体锌指结构与DNA或RNA结合（六）氨基酸残基的侧链对二级结构形成的影响蛋白质二级结构是以一级结构为基础的。一段肽链其氨基酸残基的侧链适合形成-螺旋或β-折叠，它就会出现相应的二级结构。三、蛋白质的三级结构整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置。即肽链中所有原子在三维空间的排布位置。（一）定义化学键氢键、疏水键、离子键、二硫键等次级键亲水基团：分子表面；疏水基团：分子内部较远氨基酸的相互作用一级结构彼此远离二级结构不同多肽链的进一步折叠相互靠近相互作用，形成稳定的空间结构是一条肽链构成的蛋白质具有生物活性的基础三级结构示意图二硫键极性基团离子键肌红蛋白(Mb)的三级结构

N端C端纤连蛋白分子的结构域（二）结构域大分子蛋白质的三级结构常可分割成一个或数个球状或纤维状的区域，折叠得较为紧密，各行使其功能，称为结构域(domain)。免疫球蛋白结构域

重链轻链结构域（三）分子伴侣分子伴侣(chaperon)通过提供一个保护环境从而加速蛋白质折叠成天然构象或形成四级结构。*分子伴侣可逆地与未折叠肽段的疏水部分结合随后松开，如此重复进行可防止错误的聚集发生，使肽链正确折叠。*分子伴侣也可与错误聚集的肽段结合，使之解聚后，再诱导其正确折叠。*分子伴侣在蛋白质分子折叠过程中二硫键的正确形成起了重要的作用。亚基之间的结合力主要是疏水作用，其次是氢键和离子键。四、蛋白质的四级结构蛋白质分子中各亚基的空间排布及亚基接触部位的布局和相互作用，称为蛋白质的四级结构。有些蛋白质分子含有二条或多条多肽链，每一条多肽链都有完整的三级结构，称为蛋白质的亚基

(subunit)。血红蛋白的四级结构

从一级结构到四级结构血红蛋白蛋白质的一级结构是它的氨基酸序列蛋白质的二级结构是由氢键导致的肽链卷曲与折叠Primary

structureSecondary

structure蛋白质的三级结构是多肽链自然形成的三维结构蛋白质的四级结构是亚基的空间排列Polypeptide

(singlesubunit

oftransthyretin)Transthyretin,withfour

identicalpolypeptidesubunitsTertiary

structureQuaternary

structure五、维持蛋白质分子空间构象的主要化学键

氢键、疏水键、离子键、范德华力、二硫键等离子键疏水键二硫键氢键范德华力蛋白质结构与功能的关系TheRelationofStructureandFunctionofProtein第三节蛋白质的一级结构决定其高级结构蛋白质的空间构象决定蛋白质的生物学功能（一）一级结构是空间构象的基础一、蛋白质一级结构与功能的关系牛核糖核酸酶的一级结构二硫键天然状态，有催化活性尿素、β-巯基乙醇去除尿素、β-巯基乙醇非折叠状态，无活性某些蛋白质的一级结构加工后，才具有生物学活性。如胰岛素原（proinsulin）的一级结构加工一级结构的改变可引起某些疾病的发生由于基因突变导致蛋白质分子的变异或缺失而产生的疾病，称为分子病（moleculardisease）。如镰状红细胞性贫血（二）一级结构与功能的关系例：镰刀形红细胞贫血N-val·his·leu·thr·pro·glu·glu·····C(146)HbSβ肽链HbAβ肽链N-val·his·leu·thr·pro·val

·glu·····C(146)（三）同源蛋白质存在序列同源现象不同种属来源的一些蛋白质的氨基酸序列非常相似，构象相似，功能也一致，这些Pro称为同源蛋白质。同源Pro氨基酸序列的这种相似性称为序列同源性。在同源Pro的氨基酸序列中，许多位置的AA是相同的，这些AA称为不变残基（维持构象和生物活性）。而其它位置差异较大的AA，称为可变残基（免疫学性质有关）。（一）肌红蛋白与血红蛋白的结构二、蛋白质空间结构与功能的关系目录Hb与Mb一样能可逆地与O2结合，Hb与O2结合后称为氧合Hb。氧合Hb占总Hb的百分数（称百分饱和度）随O2浓度变化而改变。（二）血红蛋白的构象变化与结合氧肌红蛋白(Mb)和血红蛋白(Hb)的氧解离曲线任何一个亚基接受氧分子后，会增进其它亚基吸附氧分子的能力环境氧浓度高时Hb快速吸收氧分子环境氧浓度低时Hb快速释出氧分子动脉静脉血红蛋白对氧的运输*协同效应(cooperativity)一个寡聚体蛋白质的一个亚基与其配体结合后，能影响此寡聚体中另一个亚基与配体结合能力的现象，称为协同效应。如果是促进作用则称为正协同效应(positivecooperativity)如果是抑制作用则称为负协同效应

(negativecooperativity)血红蛋白结合氧前后构象的变化Hb(T态)HbO2(R态)α1β1α2β215ºO2血红素与氧结合后，铁原子半径变小，就能进入卟啉环的小孔中，继而引起肽链位置的变动。变构效应(allostericeffect)蛋白质空间结构的改变伴随其功能的变化，称为变构效应。（三）蛋白质构象改变与疾病蛋白质构象疾病：若蛋白质的折叠发生错误，尽管其一级结构不变，但蛋白质的构象发生改变，仍可影响其功能，严重时可导致疾病发生。蛋白质构象改变导致疾病的机理：有些蛋白质错误折叠后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病，表现为蛋白质淀粉样纤维沉淀的病理改变。这类疾病包括：人纹状体脊髓变性病、老年痴呆症、亨停顿舞蹈病、疯牛病等。疯牛病中的蛋白质构象改变疯牛病是由朊病毒蛋白(prionprotein,PrP)引起的一组人和动物神经退行性病变。正常的PrP富含α-螺旋，称为PrPc。PrPc在某种未知蛋白质的作用下可转变成全为β-折叠的PrPsc，从而致病。PrPcα-螺旋PrPscβ-折叠正常疯牛病第四节蛋白质的理化性质与分离纯化ThePhysicalandChemicalCharactersandSeparationandPurificationofProtein（一）蛋白质的紫外吸收由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波长处有特征性吸收峰。蛋白质的OD280与其浓度呈正比关系，因此可作蛋白质定量测定。一、一般性质蛋白质（色氨酸、酪氨酸）（苯丙氨酸）

λ=280nm

紫外吸收（与蛋白质浓度成正比）λ=260nm10,000100010010200250300波长（nm）TrpPheTyr摩尔吸光度（M-1cm-1）（二）蛋白质的两性电离蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液pH条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。*蛋白质的等电点(isoelectricpoint,pI)当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。蛋白质的两性电离和等电点与氨基酸的两性电离、等电点相同（三）蛋白质的呈色反应⒈茚三酮反应(ninhydrinreaction)

蛋白质经水解后产生的氨基酸也可发生茚三酮反应。2.酚试剂反应：磷钨酸蛋白质蓝蓝色化合物色化合

蓝色化合物3.米伦试剂反应：米伦试剂蛋白质红色沉淀△磷钼酸4.双缩脲反应(biuretreaction)蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热，呈现紫色或红色，此反应称为双缩脲反应，双缩脲反应可用来检测蛋白质水解程度。双缩脲反应：Cu2+蛋白质紫色络合物OH-（一）蛋白质的胶体性质蛋白质属于生物大分子之一，分子量可自1万至100万之巨，其分子的直径可达1～100nm，为胶粒范围之内。蛋白质溶液是稳定亲水胶体溶液*蛋白质胶体稳定的因素颗粒表面同种电荷水化膜二、大分子特性蛋白质不能通过生物膜(半透膜)维持血浆和组织间液之间的胶体渗透压。可用透析(dialysis)的方法使蛋白质纯化透析：将有小分子杂质的蛋白质溶液封入半透膜制成的透析袋中，侵入流动水或缓冲液中，小分子物质从袋内析出而使蛋白质纯化的过程。

+++++++带正电荷的蛋白质－－－－－－－－带负电荷的蛋白质在等电点的蛋白质水化膜++++++++带正电荷的蛋白质－－－－－－－－带负电荷的蛋白质不稳定的蛋白质颗粒酸碱酸碱酸碱脱水作用脱水作用脱水作用溶液中蛋白质的聚沉（二）蛋白质的扩散与沉降蛋白质分子大，扩散速度慢沉降：通过超速离心克服布朗运动使蛋白质颗粒下沉的现象沉降系数（S）可粗略反映蛋白质分子大小（三）蛋白质的变性、沉淀和凝固*蛋白质的变性(denaturation)在某些物理和化学因素作用下，其特定的空间构象被破坏，也即有序的空间结构变成无序的空间结构，从而导致其理化性质改变和生物活性丧失。3.蛋白质的变性与复性

变性剂蛋白质空间构象破坏生物学活性丧失理化性质改变加热、酸碱、有机溶剂、尿素、盐酸胍、去污剂易水解易沉淀蛋白质非共价键和二硫键破坏，不涉及肽键造成变性的因素如加热、乙醇等有机溶剂、强酸、强碱、重金属离子及生物碱试剂等。

变性的本质——破坏非共价键和二硫键，不改变蛋白质的一级结构。应用举例临床医学上，变性因素常被应用来消毒及灭菌。此外,防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质制剂（如疫苗等）的必要条件。

若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的构象和功能，称为复性(renaturation)。天然状态，有催化活性尿素、β-巯基乙醇去除尿素、β-巯基乙醇非折叠状态，无活性*蛋白质沉淀在一定条件下，蛋白疏水侧链暴露在外，肽链融会相互缠绕继而聚集，因而从溶液中析出。变性的蛋白质易于沉淀，有时蛋白质发生沉淀，但并不变性。*蛋白质的凝固作用(proteincoagulation)蛋白质变性后的絮状物加热可变成比较坚固的凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中。

三、蛋白质的分离纯化鉴定技术蛋白质在细胞内常与核酸、多糖、脂类及其它小分子物质结合在一起，需要对其进行分离、纯化与鉴定。（一）离心原理：分子大小、密度不同→沉降速度不同分类：普通离心：3~10kr/min高速离心：10~25kr/min超速离心：＞25kr/min常用S值表示蛋白质分子质量相对大小（二）透析(dialysis)用透析袋（半透膜）把大分子和小分子分开的方法（三）沉淀