第十四章+维生素类药物的分析

第十四章

维生素类药物的分析维生素类药物的分析维生素维持人类机体正常代谢功能所必须的一类活性物质,主要用于机体的能量转移和代谢调节,体内不能合成,须从食物中摄取。通俗来讲，即维持生命的物质，是维持人体生命活动必须的一类有机物质，也是保持人体健康的重要活性物质。维生素在体内的含量很少，但不可或缺。维生素类药物的分析维生素醇从化学结构上来讲，维生素类均属于有机化合物，但并非同一类化合物。酯酸胺酚醛各具有不同的理化性质和生理作用按溶解度分维生素类药物的分析方法生物法微生物法化学法物理化学法都是依据药物的化学结构、理化性质与生物特性来进行分析AB1CDEVitaminsContents主要讲解维生素A是一种不饱和脂肪醇，在自然蜀中主要来源于鲛类海鱼肝脏中提取的脂肪油（鱼肝油）。具有多种异构体，有不同的名称，其中活性最好的是维生素A1，也是通常所指的维生素A第一节VitA维生素A具有一个共轭多烯醇侧链的环已烯，具有多个异构体维生素A具有一个共轭多烯醇侧链的环已烯，具有多个异构体维生素A醇（Retinol)维生素A具有一个共轭多烯醇侧链的环已烯，具有多个异构体维生素A醋酸酯

（VitaminAAcetate)维生素A具有一个共轭多烯醇侧链的环已烯，具有多个异构体维生素A棕榈酸酯

（VitaminAPalmitate)维生素A具有一个共轭多烯醇侧链的环已烯，具有多个异构体去氢维生素A

（A2dehydroretinol)维生素A具有一个共轭多烯醇侧链的环已烯，具有多个异构体去水维生素A

（A3anhydroretinol)912345678Retinol(VitAalcohol)VAacetateVApalmitate一、主要性质溶解性:与三氯甲烷、乙醚、环已烷或石油醚能任意混合，在乙醇中微溶，在水中不溶。不稳定性：含有多个不饱和键，性质不稳定，易被被空气中氧或氧化剂氧化，易被紫外光裂解，特别是在加热和金属离子存在时更易氧化变质从而失活。紫外吸收：共轭多烯醇侧链结构，在325-328nm之间有最大吸收，可用于鉴别与三氯化锑呈色:三氯甲烷+三氯化锑=不稳定的蓝色二、鉴别试验VitASbCl3CHCl3(无水无醇)蓝色紫红色1.三氯化锑反应(Carr-Price反应)维生素A和氯化锑中存在的亲电试剂氯化高锑作用形成不稳定的蓝色碳正离子反应应在无水无醇条件下进行。因为水可使三氯化锑水解，而乙醇可以使碳正离子作用使其正电荷消失而使反应不能进行。Notice2.UVVitA维生素A在无水乙醇盐酸溶液中溶解,立即进行UV扫描,在360nm处有一最大吸收峰.如1.水浴加热30s,迅速冷却,此过程发生脱水反应,扫描时出现三个吸收峰VitA3.TLC：三氯化锑显色，磷钼酸显色维生素A去水维生素A最大吸收峰向长波方向移动：红移三、含量测定维生素A的测定CHP收载三种HPLC法UV三氯化锑法UV维生素A常混有杂质，包括多种异构体，氧化降解产物，合成中间体，副产物等以及常用稀释油类。都有紫外吸收，干扰测定。咋办呢？请用三点校正法！维生素A在325-328nm的波长范围内具有最大吸收，其最大吸收峰的位置随溶剂的不同而异。如下：AnmVitAsamplepureVAacetateimpurities测定原理杂质的无关吸收在310~340nm波长范围内呈一条直线，且随波长的增大吸收度减小；物质对光的吸收具有加和性的原理。波长的选择：（1）1

VitA的max（328nm）（2）23

分别在1的两侧各选一点测定对象VitA醋酸酯第一法等波长差法第二法等吸收比法测定对象VitA醇测定方法一、基本步骤第一步：选择A

（A328或A328(校正后)）选择依据——所选A值中杂质的干扰已基本消除第二步：求第三步：求效价（每克供试品所含维生素A的国际单位数）规定具体步骤测定A1IU=0.344μgVitA醋酸酯1gVitA醋酸酯=106μg/0.344(μg/IU)=2.907×106IU

VitA

醋酸酯换算因子=1900第四步：求标示量(百分)Why?第四步：求标示量这是因为标示量是以效价的形式存在的第四步：求标示量测定含量单位质量1g对应的效价效价占单位样品质量的百分比效价占单位质量的百分比经过变形可得下式第四步：求标示量测定方法这是因为标示量是以效价的形式存在的方法：二、

直接测定法维生素A醋酸酯判断是否在326～329nm之间在326～329nm之间改用第二法是否求算并与规定值比较

规定值差值

判断差值是否超过规定值的有一个以上超过无超过

计算A328（校正）

用A328计算A328不校正◊A=A328校正◊第二法◊三、皂化法

——VitAalcohol（6/7)①样品前处理酯乙醚提取VA醇，洗涤，过滤异丙醇溶解残渣在300，310，325，334nm处分别测Ai②λmax应为325nm。若λmax不在323～327nm之间，则供试品中杂质含量过高，改为色谱法将未皂化部分纯化后进行测定。③计算，选择AA.若(A300/A325)≤0.73A325不校正◊A=A325校正◊A325(校正)=6.815A325-2.555A310-4.260A334B.若(A300/A325)>0.73色谱法纯化后再测应用示例一VitAD胶丸中VitA的含量测定精密称取本品(规格10,000VitAIU/丸)装量差异项下（平均装量0.07985g/丸）的内容物0.1287g至50ml量瓶中，用环己烷稀释至刻度，摇匀；精密量取2.0ml，置另一50ml量瓶中，用环己烷稀释至刻度，摇匀。以环己烷为空白，测定最大吸收波长为328nm，并在下列波长处测得吸收度如下，计算VitA的标示量百分含量。A=A328校正应用示例二称取VitA滴剂0.1082g(标示量50000I.U./g)，加环已烷至50.0ml，取出5.0ml置于另一50ml量瓶中，加环已烷至刻度，摇匀后置石英比色皿中，以环已烷为空白，分别于以下波长处测得相应的吸收度值，试求此滴剂中VitA的标示量百分率：A=A328校正(二)HPLCRF-HPLC同时测定人血清中VitA和VitE含量色谱条件

色谱柱：C18

流动相：甲醇-水流速：1.2ml/min

检测波长与AUFS：

0～8min(330nm);8min后(292nm)

内标：VitA酯VitAVitE(三)三氯化锑比色法λmax618nm～620nm缺点呈色不稳定（5~10s内）水分干扰与标准曲线温差≤1℃专属性差三氯化锑有腐蚀性第二节VitB亦称盐酸硫胺,具有维持糖代谢及神经传导与消化的正常功能，主要用于治疗脚气病、多发性神经炎和胃肠道疾病氨基嘧啶环噻唑环亚甲基季铵性质溶解性干燥品在空气中迅速吸收4%的水分。在水中易溶，在乙醇中微溶，在乙醚中不溶，水溶液呈酸性性质硫色素反应噻唑环在碱性介质中可开环，再与嘧啶环上的氨基环合，经铁氰化钾等氧化剂氧化成具有荧光的硫色素，后者溶于正丁醇中呈蓝色荧光性质分子中具有两个杂环，可与某些生物碱沉淀试剂如碘化钾、三硝基苯酚、碘溶液、硅钨酸反应生成恒定的沉淀紫外吸收特性性质维生素B1为盐酸盐，可呈氯化物的鉴别反应氯化物的特征一、Identification1.硫色素荧光反应——为维生素B1所特有NaOH－H2O噻唑环在碱性介质中可开环，再与嘧啶环上的氨基环合，经铁氰化钾等氧化剂氧化成具有荧光的硫色素，环合[O]－2H硫色素Thiochtome溶于丁醇，显蓝色荧光取本品约5mg，加NaOHT.S.2.5ml溶解后，加铁氰化钾T.S.0.5ml与正丁醇5ml，强力振摇2min，放置使分层，上层显强烈的蓝色荧光；加酸使呈酸性，荧光即消失；再加碱使呈碱性，荧光又重现。方法2.沉淀反应维生素B1与碘化汞钾生成淡黄色沉淀[B].H2HgI4维生素B1与苦酮酸生成扇形白色结晶维生素B1与碘生成红色沉淀[B].HI.I2维生素B1与硅钨酸反应生成白色沉淀[B]2.SiO2(OH)2.12WO3.4H2O3.氯化物反应本品是盐酸盐,水溶液呈氯化物的鉴别反应4.硫元素反应5.红外分光光度法本品对照品对照三、含量测定

非水溶液滴定法

(Non-aqueousTitrimetry)

紫外分光光度法

(UV)

硫色素荧光法

(Thiochrone

Fluoremetry)非水滴定法原理维生素B1分子中含有两个碱性的已成盐的伯胺和季铵基团,在非水溶液中均可与高氯酸作用,以电位指示终点.根据消耗的高氯酸量即可算出维生素B1的含量.Non-aqueousTitrimetry喹那啶红－亚甲蓝

（紫红→天蓝）紫外分光光度法原理维生素B1分子中含有共轭双键结构,在紫外区有吸收,根据最大吸收波长处的吸光度即可以计算含量.1——0.1MHCl2——H203——H3PO4buffer4——alcohol246232255VitB1铁氰化钾NaOH硫色素异丁醇荧光λex-365nmλem-435nm+NaOH+铁氰化钾+异丁醇+NaOH+异丁醇对照液+NaOH+铁氰化钾+异丁醇+NaOH+异丁醇供试液SdAb硫色素荧光法第三节VitC一、主要性质

溶解性酸性旋光性还原性L-抗坏血酸(有生物活性)L-二酮古罗糖酸L-去氢抗坏血酸无生物活性烯二醇结构，具有内酯环

水解性

糖类性质50℃

UV二、鉴别1.与AgNO3反应2.与2,6-二氯靛酚反应氧化型还原型酸式色碱式色3.与氧化剂反应4.与糖类反应H2O-CO2戊糖-3H2O糠醛50℃蓝色其它还有薄层色谱法,百分吸收系数法杂质检查溶液的澄清度与颜色检查维生素C长期贮存会被氧化变色,因而应通过此项检查控制其纯度.铁与铜离子的检查维生素C中可能存在一些铁与铜离子,因而可以采用标准添加对照法进行检查.草酸的检查一般加CaCl2形成草酸钙对测定其浊度.三、含量测定(强还原性)1.碘量法取本品约0.2g，精密称定，加新沸过的冷水100ml与稀醋酸10ml使溶解，加淀粉指示液1ml，立即用碘滴定液（0.05mol/L）滴定，至溶液显蓝色，在30秒内不褪。每1ml碘滴定液(0.05mol/L)相当于8.806mg的C6H8O62.2,6-二氯靛酚滴定法快速滴定，用于含VitC的制剂与食品分析3.HPLC人血浆中VitC浓度的HPLC法测定标准溶液制备：取VC对照品约25mg，精密称定，置25ml量瓶中，加10%偏磷酸稀释至刻度，得维生素C储备液浓度为1mg/ml，置冰箱中2℃保存，3日内可用。血浆样品预处理：取受试者静脉血，立即置肝素化的离心试管中，3000rpm离心5min；取血浆0.5ml，加入0.5ml10%偏磷酸溶液，涡旋混合0.5min，离心，分取上清液，置冰箱2℃贮存，直至测定。稳定性考察：VC在血浆中不稳定，在5%偏磷酸溶液中也难以保持长期稳定，应尽可能缩短药物分离和处理时间。样品测定：每天抽取的血样应当日测定，每天建立一条标准曲线，并随行测定高、中、低浓度的双样本质控样品。维生素D2－骨化醇一、结构与性质第四节VitD维生素D3－胆骨化醇维生素D2维生素D3溶解性:在三氯甲烷中极易溶解,在丙酮乙醇乙醚中易溶.

不稳定性:双键极不稳定,易氧化变色,毒性增强.

旋光性:有五到六个手性碳原子,均具有旋光性.

显色反应:在三氯甲烷+醋酐+硫酸会从黄到紫再到绿色.

紫外吸收:具有吸收基团二、鉴别显色反应:三氯甲烷+醋酐+硫酸三氯甲烷+三氯化锑三氯化铁=橙黄色初显黄色逐渐变红迅即变紫最后变绿溶液显橙红色,逐渐变粉红色二氯丙醇和乙酰氯=绿色比旋度鉴别测定比旋度进行鉴别其它鉴别法TLC\HPLC\熔点\UV\IR等三、杂质检查1、麦角醇的检查90％乙醇溶解后，加洋地黄皂苷溶液，放置18h，不得发生浑浊。2、前维生素D的光照产物λ＝280nm~320nmCh.P2010——NP-HPLC四含量测定USP34-NF29化学法色谱法微生物法BP2010化学法色谱法光谱法

固定相：硅胶

流动相：正己烷－正戊醇（997：3）

检测波长：254nm第一法：用于无维生素A醇及其他干扰的供试品第二法：(1)皂化提取;(2)净化用色谱柱系统分离收集维生素D，得供试品溶液B;(3)按第一法进行测定。第三法：当样品经皂化提取及净化用色谱系统分离收集后，前维生素D峰仍受干扰时，采用此法。第五节VitER1R2﹡﹡苯并二氢吡喃醇VitE(dl-α-TocopherylAcetate)SyntheticNatural苯并二氢吡喃环+饱和烃链溶解性水解性氧化性紫外吸收△二、鉴别1.硝酸反应生育酚HNO3（橙红色）生育红2.三氯化铁反应生育酚[O]对-生育醌3.UV0.01%无水乙醇中，λmax=284nm，λmin=254nm4.TLC薄层板硅胶G展开剂环己烷-乙醚（4：1）显色剂硫酸（105℃5′）VitERf

=0.7三、杂质检查1.酸度