内容文稿教案

中西医结合南方红豆杉对肺癌A549细胞的抑制作用及EGFR等靶点研2010年浙江省中 A549肺癌及对EGFR等靶点的 项目编号 一．立论依据（包括课题理由、研究意义、国内外研究现状分析和主要参考文献性支气管肺癌是目前世界上最常见的之一，率早中居于前列。时，80%患者已失去手术根治可能，90%须接受化疗。但是，化疗对肿瘤细胞易对正常细胞产生毒性损伤，导致严重的药物毒副反应发生且疗效有限。非小细胞肺癌（Non-SmallcelllungCancer）510%，小细胞肺癌（SmallcelllungCancer）3%，疗效很不理想。多年来，科研人病理研究是最为热点的领域[1]。分子靶向是靶向治疗中特异性最它针对的是可能导变的各个环receptor，EGFR（1）（2）receptorEGFRkinaseTK域。其胞内区域与erbB癌产物高度同源，胞外配体结合EGFR后引起EGFR构型改变，导致EGFR同二聚体或其他相关受体异聚化而活化它们的胞浆位点[4,5]EGFR（EGFEGFEGFRHER-2EGFR形成同源二聚体，而有着HER2异二聚体的功能较强。受体的二聚体化激活受体的膜内酪氨酸激酶，使其自身磷酸化，磷酸化的酪氨SH2PTB区的胞内信号分子（PLC-γ，grb2、Cbl等）结合后，将主要由有丝（3（3K/Akt-T通路把信号传递到细胞核内使转录增加促进细胞的增殖转化[6]因此其作为治疗靶点早已有提出并日益受到人们关注其中针对肺癌EGR酪氨酸激酶的易瑞Iessa和特罗（arcev也先后上市疗效确切。但其价格让患者及其家属重负，受用者了了。Brambilla-E研究认为[8]，肺癌的发生、发展是多、多步骤过程的结果，在恶变前状态，bal-2/bax比例失衡有助于细胞扩增。因为对细胞的易感性受控于胞质内bcl-2成分诸如bal-2和bax间的平衡，bax可促进细胞凋亡，所以其被看作抑癌Bax低表达有利于癌细胞存活，bcl-2高表达有利于癌细胞的扩增癌旁组织早期中bcl-2和bax的比例常有改变。两者比例能决定细胞的转化，其比例高，则易发展为癌。抑制凋 过表达促凋亡bax低表达，可使细胞凋亡抑制，细胞存活期延长扩增，这是肺癌发生的重要机制之一[9]。环氧化酶（cyclooxygenase,COX-2）是催化花生四烯酸转变为素和血栓素的限速酶，与机体的各种生理病理过程密切相关，有两种同工酶：COX-1、COX-2COX-1COX-2的结构相似，但在组织中的分布和功能都不尽相同。COX-2NSCLCNSCLC预后不良的独立预红豆杉中有40多种有效成分，其中主要有：紫杉醇、红豆杉多糖、巴卡亭Ⅲ、生物碱、紫衫黄酮、萜类、小分子类物质（鞣质）等。红豆杉细胞提取物可通过诱导肿瘤细胞SMMC-7721和Hep-2发生凋亡，抑制肿瘤 1、2、肿瘤坏死因子，干扰素等细胞因子的合成；激活巨噬细胞、T淋巴细胞， 研究员曾于2006年5月20SD660180天，大鼠各项生理者欢迎。但迄今为止，尚无南方红豆杉靶向治疗抑制肿瘤机理研究。若能从分子水平加以阐述，揭昂贵的靶向治疗西药费用，减轻患者及其家属沉重负担，而且对中的发掘、整理、提高及世界有重 [2]．韩宝惠主编.肿瘤生物免疫靶向治疗 科学技 ，魏金星，等.肾细胞癌中血管密度与肿瘤细胞凋亡的关系[J].中华实验外 [4]．PaoW,MillerVA.Epidermalgrowthfactorreceptormutations,small-moleculekinaseinhibitors,andnon-small-celllungcancer:currentknowledgeandfuturedirections[J].JClinOncol,2005,23(11):2556-[5]．WangChengxin,CaoYA.AtumortheapytargetingEGFRandit`smutation[J].JournalofInternationalPathologyandClinicalMedicine,2000,20(2):137-140. 2004,31（1：26-[7]．，梁婷婷，宋文哲.Survivin在肿瘤中的研究进展[J].中国医，2004,39（5：22-[8]．Brambilla-E,Gazzeri-S,Lantuejoul-S,etal.p53mutantimmunophenotypeandderegulationofp53transcriptionpathway(bcl-2,bax,andwafl)inprecursorbronchiallesionoflingcancer.Clin-cancer-Res,1998,4(7):1609-[9]．Zhang-H,Yousem-SA,Franklin-WA,etal.Differetiationandprogrammedcelldeath-relatedintermediatebiomarkersforthedevelopmentofnon-smallcelllungcancer:apilotstudy.Hum-Pathol,1998,29(9):965-[10]．ReddyBS,RaoCV,SeibertK.Evaluationofcyclooxygenase-2inhibitorforpotentialchemopreventivepropertiesincoloncarcinogenesis[J].CancerRes,1996,56(3):4566-4569.[11]．SweeneyCJ.Whycycooxygenase-2inhibitorpluschemotherapy[J].AmJClinOnocol(CCT),2003,26(4):[12]．MeertAP,MartinB,DelmotteP,etal,TheroleofEGFR-Rexpressiononpatientsurvivalinlungcancer,asystematicreviewwithmeta-ysis[J].EurRespirJ,2002,20(4):975-998.[13]．，梅兴国，龚伟等.SMMC-7721HEp22的作用研究，中国药2003,19（7：801-[14]．本样主编.现代中药药理学[M].第一版.：科学技术，1999,1449-二通过体内外实验，观察南方红豆杉对人肺癌A549细胞生长的影响，并探讨其如何对人肺癌A549细胞A549A549细胞株增殖的，EGFR总蛋白和蛋白磷酸化表达（Western-Bloting技术）变化情况，EGFR、Survivin、bcl-2、bax、cox-2（ELISA法）A549细胞株增殖的主要靶点，为进一步开展相应信号传 对于3种方法对于上述 分为中剂量特罗凯3.5mg/kg/d组，标准剂量特罗凯7mg/kg/d组，低剂量红豆杉186.65mg/kg/d组，中剂量红豆杉373.3mg/kg/d组，高剂量红豆杉746.6mg/kg/d组，中剂量红豆杉373.3mg/kg/d+中剂量特罗凯3.5mg/kg/d时后，清醒状态下无菌心脏采血，分离，同组兔混合，过滤除菌，-20℃保存备用。组，10%中剂量特罗凯组，10%标准剂量特罗凯组，10%低剂量红豆杉组，10%中剂量红豆杉组，10%624、488A549细胞株增殖的影响（MTT法EGFR、Survivin、bcl-2、bax、）变化情况，EGFR、Survivin、bcl-2、bax、cox-2水平检测（ELISA法）统计学处理：以SPSS统计软件包进行统计分析，正态分布的各项资料均以均数±标准差表示，采用t检x2检验、直线相关与回归等。 A549 组

中 标剂 准量 剂特 量罗 特++凯 罗++ 组（MTT（MTT法ELISA技术测定2的表达RT-PCR技术测 、COX-2mRNA的表达技术测定COX-2bax总蛋南方红豆杉由宁波泰康红豆杉生物工 制成颗粒剂，8克/包，于正规途径购得细胞系：人肺癌A549细胞株引 细胞生 实验动物：购自浙江 大学实验动物中心含药的：选择纯种新西兰家兔162kg8组，根据人和动物体表面积折算的3.5mg/kg/d7mg/kg/d186.65mg/kg/d特罗凯3.5mg/kg/d组，中剂量红豆杉373.3mg/kg/d+标准剂量特罗凯7mg/kg/d组，及对照组。连续灌胃31小时后，清醒状态下无菌心脏采血，分离，同组兔混合，过滤除菌，-20℃保存南方红豆杉对人肺癌A549细胞生长的影响：取对数期A549细胞，接种于96孔板，分别设10%盐水血清组，10%中剂量特罗凯组，10%标准剂量特罗凯组，10%低剂量红豆杉组，10%中剂量红豆杉组，每组设6个复孔，分别培养24、48小时后终止实验，观察肿瘤细胞的增殖活性，收集上清液和细胞EGFR变化情况，EGFR、Survivin、bcl-2、bax、cox-2水平检测（ELISA法）SPSSt检A549细胞，得到通过体内代谢的实验，观察南方红豆杉对肺癌A549细胞生长的影响，并探讨如何对人肺癌A549细胞EGFR、COX-2mRNA、Survivin、bax、bcl-2及总蛋白的表达进行干预，揭示南方红豆杉抗肺癌A549细胞通过南方红豆杉抗人肺癌A549细胞生长机理及靶点的研究，探讨其安全、有效的剂量，开拓中药分子 于浙江中大学动物实验中心兔 于浙江省中医院中心探索南方红豆杉含药抑制肺癌A549细胞生长的作用 测定EGFR、COX-2mRNA、Survivin、bax、bcl-2及总蛋白的表达明确含药不同浓度的南方红豆杉对肺癌A549细胞株有一定的抑制作用及主要作用靶点。动物实验部