自学自讲(基因敲除)

基因敲除技术及其应用Contents基因敲除的步骤及方法2基因敲除的定义1基因敲除的应用34Subtitle基因敲除的定义

基因敲除(Geneknockout)是指一种遗传工程技术，针对某个序列已知但功能未知的序列，改变生物的遗传基因，令特定的基因功能丧失作用，从而使部分功能被屏障，并可进一步对生物体造成影响，进而推测出该基因的生物学功能。基因敲除的基本步骤

第一步：ES细胞的获得第二步：重组载体的构建

第三步：重组DNA转入受体细胞核内

第四步：目的细胞的筛选

第五步：转基因动物的获得基因敲除的方法一．Cre-LoxP系统Cre-LoxP系统属于传统的同源重组载体,但是具有了时空调控的功能。它由Cre重组酶和LoxP位点两部分组成。Cre-LoxP系统可以实现对基因的不同发育阶段、不同组织类型中特异性的删除,可以消除由于基因位置改变造成的影响,加强了对基因的控制能力,使研究者可以更方便地有针对性地进行目标阶段的研究工作;Cre-LoxP系统可以实现染色体间的基因重排;但同时也可以看出该系统对基因的了解要求极高,并且对基因片段的操作能力要求也很高,基因片段的大小通常在10kb以上,这些都不利于研究工作进行。基因敲除的方法二．转座子系统

转座子系统自从20世纪50年代被McClintock发现以来,已经成为许多组织器官进行基因分析的工具。在人和小鼠的基因组中,转座子衍生序列多达整个基因组的40%,这提示在发育过程中转座子有重要作用。转座子系统易于操作,所需时间短,具有高通量的特点,可以携带多种抗性标记,方便了同时进行多基因功能研究。但其应用范围有限,适用于有一段克隆到的原始基因组序列,长度在10～15kb,且转座子应满足以下条件:①转座子本身应该很短,易于操作,并对任何期望敲除区域有高效率;②在删除目的区域后应留下足够长的两臂用于同源重组。这些都限制了转座子的应用。基因敲除的方法三．基因捕获载体系统基因捕获技术是将突变基因导入小鼠ES细胞从而获得小鼠基因组文库,进行小鼠基因组的功能研究,它属于大规模随机敲除。典型的基因捕获载体通常包括一个无启动子的报道基因,并通过调控元件使含有小鼠基因组文库的ES克隆很容易被选择性培养基筛选出来。基因敲除的方法四．Hit和Run法Hit和Run法也称进退策略。它包括两次同源重组:第一步(Hit)用插入型载体进行同源重组,在靶位点插入带有突变的基因组序列以及带有两个筛选标记(如neo和tk)的载体序列;第二步(Run)利用tk抗性筛选,富集发生去除了含有负筛选标记基因的载体序列的回复突变的克隆。Hit和Run法的不足之处是:①无法精确控制染色体内的同源重组,可能会失去携带突变的同源序列,而保留未修饰的内源片段;②整个过程需要采用两种培养基分别进行先后两次筛选;③无法同时引进多个位点突变。基因敲除的方法五.双置换法双置换法也属于精细突变敲除。它首先用含有Hprt基因的打靶载体转染Hprt-ES细胞,通过在次黄嘌呤、氨喋呤和脱氧胸腺嘧啶苷培养基中筛选并用PCR进行基因组分析,筛选发生同源重组、Hprt基因阳性克隆。然后用只携带突变同源序列的打靶载体转染上一步获得的Hprt+ES细胞。同源重组发生后,突变序列将Hprt置换出来。这种方法的优点在于,第一步获得的Hprt+ES细胞,除了可用于产生普通的基因剔除小鼠外,也可以作为将不同突变引入靶基因的基础。基因敲除的研究和应用1.1在人类疾病动物模型方面的应用1.2基因和蛋白功能研究方面的应用1.3药物依赖性研究方面的应用1.4毒理学研究方面的应用1.5免疫学方面的应用1.5免疫学方面的应用1.6治疗措施研究方面的应用

在人类疾病研究方面的应用人类几乎所有的疾病都与基因有关,基因敲除动物模型的建立,为研究人类疾病提供了一个崭新方法,尤其是遗传性疾病。OA1(眼球白化症,ocularalbinism)是一种基因紊乱遗传性疾病,能引起视力严重下降,斜视、光恐怖、眼球震颤。Incerti[3]通过敲除法去除小鼠OA1基因,眼科检查显示眼球底部黑色素不足,临床症状表现与人的相似,从而用来研究OA1的发病机制。在基因和蛋白功能研究方面的应用klotho(kl)基因是Matsumura等在研究自发型高血压时发现的与衰老有关的新基因[7]。kl基因主要在肾脏和脑表达,其表达产物有膜结合型和分泌型两种蛋白异构体形式,二者可能分别是膜结合受体和体液调节信号蛋白。kl基因敲除小鼠过早出现和人类衰老相关的多种行为和病理生理改变,如寿命缩短、运动失调、性功能障碍、痴呆、白内障、动脉粥样硬化、肺气肿、骨质疏松、免疫功能降低等[8]。药物依赖性研究方面的应用利用基因敲除技术可以选择性敲除某一特定受体基因,获得先天缺失该受体基因的动物,通过比较基因缺失动物和野生型动物在依赖性模型上的行为差别,可以准确判断该受体所发挥的作用。阿片受体是阿片类物质直接作用的受体,不仅在介导阿片类镇痛中发挥重要作用,而且也与精神活性药物的依赖性有关。毒理学研究方面的应用金属硫蛋白(MT)是细胞内富含半胱氨酸巯基(SH)的小分子蛋白,目前认为MT具有调节细胞内锌和铜等功能性金属离子的体内稳态、拮抗有害重金属毒性、捕获自由基、抗过氧化应激、抗凋亡和参与细胞生长调节等功能[17]。利用MT基因敲除小鼠还可进一步观察多环芳烃化合物免疫毒性机制与MT之间的关系。另有研究选用MT基因敲除小鼠和野生型小鼠对DMBA的免疫毒性反应进行了观察比较,结果发现DMBA对MT基因敲除的动物所造成的免疫损伤比含有MT的动物要明显严重,提示MT对DMBA的免疫毒性具有明显的保护作用。免疫学方面的应用近年来,在免疫学方面出现了几十种免疫分子基因敲除动物模型,将免疫学研究特别是免疫耐受的研究推到一个新的阶段。例如:TCR基因敲除后,小鼠胸腺发育不全,脾中B细胞增多;免疫球蛋白u链基因被敲除后,B细胞发育受阻;MHCI和II类抗原基因敲除后,小鼠缺乏CD4+、CD8+型T细胞;β2微球蛋白基因敲除后缺乏CD4+、CD8+型T细胞;RAG重组酶基因被敲除后,出现免疫球蛋白重排障碍等[18]。

治疗措施研究方面的应用载脂蛋白E(ApoE)基因敲除小鼠是目前在动脉粥样硬化(AS)治疗研究领域中应用最多的基因工程动物。若干研究表明,通过正常体细胞基因转移治疗,可以延缓ApoE基因敲除小鼠AS病变的发展。内抑素是近年来发现的有效的血管新生抑制剂,Moulton和Kruger[19,20]发现通过大剂量持续注射内抑素全组蛋白能够有效的抑制ApoE基因敲除鼠AS斑块的发展。实验证明,将正常小

治疗措施研究方面的应用鼠的骨髓移植到ApoE基因敲除小鼠后,其血清中即可发现ApoE,而血浆清除脂蛋白的能力明显增强,血清胆固醇亦达到正常水平。故认为骨髓移植是防止饮食所致小鼠AS的有效措施。

治疗措施研究方面的应用人类器官移植在人类疾病治疗中起举足轻重的作用,但有两大问题一直未得到解决:一是器官来源,目前器官来源主要是尸体,受到时间和运输等条件的限制,在有些地方还涉及到宗教的问题;二是器官移植的免疫排斥反应。基因敲除动物模型可能会解决这两个难题。Kuwaki等采用基因敲除法,将引起超

治疗措施研究方面的应用急性排斥反应的半乳糖转移酶基因敲除,用此方法培育的动物的器官可以移植到人体而无排斥反应。他们已成功培育半乳糖转移酶基因敲除猪,且已经开展了将该基因敲除猪的心脏移植至狒狒体内的实验,经移植后的狒狒存活了2-6个月(均值为78天),且均未出现超急性排斥反应的表现。参考文献[1]陈系古,都同功.基因打靶技术在转基因动物中的进展[J].中国实验动物学杂志.1997,7:47-50.[2]黄冰,黄文革,陈系古,等.小鼠胚胎干细胞在六种培养体系的培养观察[J].中国实验动物学报,2000,8:1-6.[3]IncertiB,CorteseK,PizzigoniA,etal.Oa1knock-out:newinsightsonthepathogenesisofocularalbinismtype1[J].HumMolGenet.2000,9(19):2781-2788.[4]WittingPK,PetterssonK,Ostlund-LindqvistAM,etal.InhibitionbyacoantioxidantofaorticlipoproteinlipidperoxidationandatherosclerosisinapolipoproteinEandlowdensitylipoproteinreceptorgenedoubleknockoutmice[J].FASEBJ.1999,13(6):667-75.参考文献[5]LehesteJR,MelsenF,WellnerM,etal.Hypocalcemiaandosteopathyinmicewithkidney-specificmegalingenedefect[J].FASEBJ.2003,17(2):247-249.[6]KisanukiYY,HammerRE,MiyazakiJ,etal.Tie2-Cretransgenicmice:Anewmodelforendothelialcell-lineageanalysisinvivo[J].DevBiol.2001,230(2):230-242.[7]UtsugiT,OhnoT,OhyamaY,etal.Decreasedinsulinproductionandincreasedinsulinsensitivityintheklothomutantmouse,anovelanimal