蛋白质与酶工程第三章酶的分离纯化层析技术

酶的分离纯化

离心技术

层析技术第四章层析技术引言层析法的基本原理层析法的分类引言层析法的发现与进化历史

思想层析法的基本原理根据引言内容,是否可以总结概括出层析法的基本原理？层析法的分类第一节吸附层析技术第二节分配层析技术第三节凝胶过滤层析技术第四节离子交换层析法第五节亲和层析法第六节高压液相层析（HPLC）引言1850年德国科学家朗格首先发现了色谱分离的现象，当他把一种有颜色的物质滴到一张滤纸上，观察到它们扩散成一圈圈的圆环。探索与发现11906年俄国植物学家茨维特（MichaelTswett）:将碳酸钙细粉装入玻璃瓶，石油醚抽提叶子的色素溶液倾入，接着倒入石油醚洗涤，柱上部出现了绿色的叶绿素，中间是黄色的叶黄素，而在下面则是胡萝卜素橙黄色色带叫作“色谱”，方法叫色谱法（Chromatography),层析法。探索与发现2概念:固定相,流动相,色谱柱现代色谱柱图有误Whichiswhich?1905-1930.Whocares!Why？1931年德国库恩(Kuhn)重复了茨维特实验,用氧化铝和碳酸钙分离了α-,β-,和γ-胡萝卜素，此后用这种方法分离了60多种这类色素，1938年他从维生素

B

中分离出

B

6.1938年的诺贝尔化学奖。探索与发现3WhynotTswett?论文发表在不知名的期刊上相同时期发生在中国大地的事件1894年：中日甲午战争,侵占台湾。1897年：德国侵占胶州湾。1900年：八国联军侵略中国。1914年：占领青岛,夺取胶州湾。1931年：九一八事变,占领东北,建立满州国。1937年：卢沟桥事变。1941年生物化学家Martin（马丁）和Synge（辛格）把色谱法应用于氨基酸的分离。将淀粉作为色柱里的填料:淀粉色谱法滤纸作为载体:纸色谱法覆盖了吸附剂表面的并与流动相不发生混溶的固定液来代替以前的固体吸附剂:Liquid-liquid(partition)Chromatography,LLC).提出色谱塔板理论;预测气相色谱;提出用细小颗粒作填料,而两端可以加压(HPLC).1952年：马丁，辛格对分配层析的研究和发现，诺贝尔化学奖羊毛中的氨基酸分离探索与发现4塔板理论将色谱柱看作一个分馏塔，待分离组分在分馏塔的塔板间移动，在每一个塔板内不同组分分子在固定相和流动相之间形成平衡，随着流动相的流动，组分分子不断从一个塔板移动到下一个塔板，并不断形成新的平衡分配系数,partitioncoefficient:在平衡状态下，组分在固定相中的浓度和在流动相中的浓度之比.例:将MgCl2溶解于辛醇和水的混合液体,分别测量MgCl2在辛醇和水中的浓度,计算比值.好溶解的分配系数小,不好溶解的分配系数大.1952年，马丁同詹姆斯(James)，把LLC技术原理应用在分离气体上。各种气体或蒸汽的混合物利用氮或氦一类情性载气的气流通过吸收性固体的表面。混合的气体通过后,在另一端出现时就分开了。气相色谱的产生(GC)探索与发现5高效液相色谱(HPLC)的应用20世纪60年代以来,气相色谱作为分析方法已经不能满足对生物成分分析测试的要求。高效液相色谱采用了压力泵及填有很细的颗粒高效色谱柱。HighPerformanceLiquidChromatography.探索与发现6液相色谱与气相色谱法比较

气相液相对象气体,沸点低液相,沸点高固定相固体,固体涂层液固体,固液流动相惰性气体,起运载作用液体，与组分可产生亲和力环境高温常温应用化工分析，环境生物分子，蛋白核酸，医药层析法的基本原理层析法是利用混合物中各组分物理、化学性质（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等）的差异使各组分在两相（固定相和流动相）中的分布程度不同，从而使各组分以不同的速度移动而达到分离的目的。

物理、化学性质（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等）

（1）按流动相状态分类：液相色谱液-固层析液-液层析气相色谱气-固层析气-液层析层析法的分类两种固定相：(固定相不一定是固体)*固体吸附剂作为固定相*吸附在固体上的液体（硅胶吸附的水作固定相，以氯仿作流动相，分离羊毛中的氨基酸）（2）按层析原理分类：吸附层析：利用吸附剂表面对不同组分吸附性能

的差异，达到分离鉴定的目的。分配层析：利用不同组分在流动相和固定相之间的分配系数（或溶解度）不同。离子交换层析:利用不同组分对离子交换剂亲和力的不同。凝胶层析：利用某些凝胶对于不同分子大小的组分阻滞作用的不同。（3）按操作形式不同分类：柱层析：将固定相装于柱内，使样品沿一个方向移动而达到分离。纸层析：用滤纸做液体的载体，点样后，用流动相展开，以达到分离鉴定的目的。薄层层析：将适当粒度的吸附剂铺成薄层，类似纸层析。层析技术第一节

吸附层析技术第二节分配层析技术第三节凝胶过滤层析技术第四节离子交换层析法第五节亲和层析法第六节高压液相层析（HPLC）√√√第一节吸附层析技术吸附柱层析薄层层析聚酰胺薄膜层析疏水层析√√吸附柱层析

吸附柱层析是以固体吸附剂为固定相，以有机溶剂或缓冲液为流动相构成柱状的一种层析方法。常用的吸附剂有羟基磷灰石、硅胶、氧化铝、人造沸石和活性炭等。这种层析方法已成为科研、医学、化工及发酵等部门常规使用的一种分离手段。吸附柱层析一、常用术语1.层析：以基质为固定相（柱状或薄层状），以液体或气体为流动相，有效成分和杂质在这两个相中连续多次地进行分配、吸附、交换作用，最终结果是使混合物得到分离。吸附柱层析一、常用术语2.洗脱体积（Ve）：是指某一成分从柱顶部到底部的洗脱液中出现浓度达到最大值时的流动相体积。第一节吸附层析技术吸附柱层析吸附薄层层析聚酰胺薄膜层析疏水层析√薄层层析(TLC)

薄层层析是以涂布于玻板或涤纶片等载体上的基质为固定相，以液体为流动相的一种层析方法。薄层层析可根据固定相的种类分为吸附薄层层析（吸附剂为固定相）、分配薄层层析（固定在支持剂上的水溶液或有机溶剂为固定相）和离子交换薄层层析（离子交换剂为固定相）等。薄层层析薄层层析的优点：1.展层时间短，薄层层析分离混合物一般仅需15-60min；2.设备简单，操作方便，既适用于分析，也适用于制备；3.灵敏度高。薄层层析纸色谱法（分配TLC，纤维结构，固定相是纤维-水）吸附TLC固定相是硅胶，氧化铝等，层析是依据吸附力不同第三章层析技术第一节吸附层析技术第二节分配层析技术第三节凝胶过滤层析技术第四节离子交换层析法第五节亲和层析法第六节高压液相层析（HPLC)第二节分配层析技术分配层析法（液-液层析法，LLC）原理：利用混合物在两种不相混溶的液相（固定相和流动相）之间的分配系数的不同而达到分离各组分的目的。固定相液体均匀覆盖于载体表面，流动相流过固定相。分配系数：当一种溶质分布在两个互不相溶的溶剂中时，它在流动相和固定相两相内的浓度之比是个常数，称为分配系数。K=c1/c2分配系数小的溶质在流动相中的分配的数量多，移动慢；分配系数大的溶质在固定相分配的数量多，移动快。因此可彼此分开。hH（分配TLC，纤维结构，固定相是纤维-水）纸色谱法第四章层析技术第一节吸附层析技术第二节分配层析技术第三节凝胶过滤层析技术第四节离子交换层析法第五节亲和层析法第六节高压液相层析（HPLC)第三节凝胶过滤层析技术一、基本原理

概念：当生物大分子通过装有凝胶颗粒的层析柱时，因分子大小不同而分离。又名分子筛层析。原理：凝胶颗粒为多孔网状结构。混合物流过时，比凝胶孔径大的分子不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下移动，并最先被洗脱出来；比网孔小的分子能不同程度的自由出入凝胶孔内外，在柱内经过的路程较长移动速度较慢，最后被洗脱出来。吸收洗脱体积ml凝胶固定相与流动相：凝胶层析的固定相是惰性的珠状凝胶颗粒，流动相是流动的洗脱液。排阻极限：指不能进入凝胶颗粒孔穴内部的最小分子的分子量。排阻极限为30000表示30000Da的分子将直接从凝胶颗粒之外被洗脱出来。3.凝胶颗粒大小

常以目数(mesh)或者颗粒直径(mm)来表示。分辨率和流速都与凝胶颗粒大小有关。颗粒大，流速快，但分离效果差；颗粒小，分离效果较好，但流速慢。100目~0.250毫米。二、常用概念三、凝胶的种类和性质

1.交联葡聚糖凝胶（Sephadex)

1)SephadexG(SephadexG-25；SephadexG-50)G后的数字为凝胶吸水率（单位是ml/g干胶）的10倍。2）SephadexLH-20，是SephadexG-25的羧丙基衍生物，溶于水和亲脂性溶剂，用于分离不溶于水的物质。

交联葡聚糖凝胶是由葡聚糖和甘油基通过醚桥交联而成的。

2.琼脂糖凝胶（Sepharose；Bio-Gel)依靠糖链之间的次级键维持网状结构，琼脂糖密度越大，网状结构越密集。3.Superdex是由高交联度多孔琼脂糖与葡聚糖共价结合而成的。分辨率非常高，化学物理稳定性也很好。

4.聚丙烯酰胺凝胶一种人工合成的凝胶，以丙烯酰胺为单位，由甲叉双丙烯酰胺交联而成。交联剂越多，孔隙度越小。商品名为生物胶-P（Bio-GelP)。凝胶技术参数指标凝胶型号：如SephadexG-10;G-25;粒度范围：100-200mesh床体积（ml/g）:每克干胶溶涨后的体积有效分离范围：如1x1031x107工作pH:4-12最大流速：1ml/min最大承受压力:2MPa三、凝胶的选择和保存

1.凝胶的选择

例如样品中各个组分差别较大，则可以选用大颗粒的凝胶，这样可以很快的达到分离的目的；如果有个别组分差别较小，则要考虑使用小颗粒凝胶以提高分辨率。2.凝胶的保存

凝胶的保存一般是反复洗涤去除蛋白等杂质，然后加入适当的抗菌剂，通常加入0.02％的叠氮化钠,或20%酒精,4C下保存。

四、

凝胶过滤在试验室中的应用1）生物大分子物质的分离纯化2）分子量的测定3）脱盐及去除小分子杂质4）溶液浓缩5）去热源物质LogMABCLogM测Ve蛋白质通过凝胶柱的速度即洗脱体积与其分子量有关，LogM=（k1-k2）Ve

（Ve为洗脱体积）先测得几种标准蛋白质的Ve，并以其分子量对数对Ve作图得一直线，再测出待测样品的Ve，查标准曲线即可确定分子量。第四章层析技术第一节吸附层析技术第二节分配层析技术第三节凝胶过滤层析技术第四节离子交换层析法第五节亲和层析法第六节高压液相层析（HPLC)一、原理:是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。离子交换剂可以分为三部分：高分子聚合物基质、电荷基团和平衡离子。

第四节离子交换层析法纤维素—O—CH2—

COO-—Na+图纤维素阳离子交换剂组成示意图离子交换层析的基本原理示意图++++———++++++++++—+++二、离子交换基质的分类及常见种类：（一）分类阳离子交换剂：磺酸（-SO3H）、磷酸（-PO3H2）、

羧酸（-COOH）、酚羟基（-OH）等

阴离子交换剂：伯胺（-NH2OH）、仲胺（-NHCH3OH）、

叔胺（-N（CH3）2OH）、季胺（-N（CH3）3OH）等

（二）种类1）树脂型离子交换剂2）纤维素离子交换剂3）交联葡聚糖离子交换剂4）琼脂糖离子交换剂三、离子交换剂的再生与保存

离子交换剂可在柱上再生也可室内瓶装保存。如离子交换纤维素可用2mol/LNaCl淋洗柱，若有强吸附物则可用0.1mol/LNaOH洗柱；若有脂溶性物质则可用非离子型去污剂洗柱后再生，也可用乙醇洗涤，其顺序为：0.5mol/LNaOH-水-乙醇-水-20％NaOH-水。保存离子交换剂时要加防腐剂。对阴离子交换剂宜用0.002％洗必泰，阳离子交换剂可用0.02％叠氮钠。四、离子交换层析的实验室应用除去离子（纯净水）聚苯乙烯树脂广泛的应用于高纯水的制备、硬水软化以及污水处理等方面

分离纯化改变成分（青霉素-Na＋——青霉素-K＋）浓缩与提取（抗生素、蛋白质、工业废液中微量金属的提取）离子型化合物分离发展：自动化方向与光谱技术结合－专门用途的综合性自动分析仪与计算机相连－进行自动分析与自动控制第四章层析技术第一节吸附层析技术第二节分配层析技术第三节凝胶过滤层析技术第四节离子交换层析法第五节亲和层析法第六节高压液相层析（HPLC）原理：

利用生物大分子间特异的亲和能力来纯化生物大分子，如：抗原和抗体；酶和底物或辅酶或抑制剂；激素和受体等。亲和层析包括三个共价结合的组分：不溶性的基质（matrix）、一个间隔臂（spacer）及特异的配基（ligands）第五节亲和层析法目前亲和层析技术主要运用在实验室中

FractionandmonitoringVolumeofeluentAbsorbanceFractions123456789Anactualexampleforgel-filtrationSDSanalysis第四章层析技术第一节吸附层析技术第二节分配层析技术第三节凝胶过滤层析技术第四节离子交换层析法第五节亲和层析法第六节高压液相层析（HPLC)第六节高压液相层析（HPLC）特点：①使用的固相支持剂颗粒很细，表面积很大,因而分辨率很高.（颗粒细，理论塔板数多）

②溶剂系统采用高压，因此洗脱速度增大。（颗粒硬度大、流速快，耐高压）③重复性好④色谱柱可以反复使用⑤自动化操作，分析精确度高许多类型的柱层析都可用HPLC来代替，如分配层析、离子交换层析、吸附层析、凝胶过滤等。分类

正相色谱法：

共价结合到载体上的集团都是极性的集团，流动相的极性比固定相的极性弱。在这种层析过程中非极性分子或极性小的分子比极性大的分子移动的速度，先从柱中流出来。

反相色谱法

共价结合到载体上的集团是一些直链碳氢化合物，流动相的极性比固定相的极性强。在这种层析过程中，极性大的分子比极性小的分子移动的速度而先从柱中流出。快快一般来说，分离纯化极性大的分子（带电离子等）采用正相色谱（或正相柱），而分离纯化极性小的有机分子（有机酸、醇、酚等）多采用反相色谱（或反相柱）。

实践中，一种物质如蛋白的分离纯化往往不是单一实验技术能够达到的。Whatdoesthismean？层析基本原理固相，流动相，色谱柱的概念洗脱体积，洗脱曲线的概念凝胶过滤层析高压液相层析离子交换层析亲和层析吸附层析分配层析(薄层层析)吸附柱层析一、常用术语1.固定相：是由层析基质组成的。其基质包括固体物质（如吸附剂、离子交换剂）和液体物质（如固定在纤维素或硅胶上的溶液），这些物质能与相关的化合物进行可逆的吸附、溶解和交换作用。2.流动相：在层析过程中推动固定相上的物质向一定方向移动的液体或气体称为流动相。在柱层析时，流动相又称洗脱液或洗涤剂。在薄层层析时流动相又称展层剂。吸附柱层析一、常用术语2.操作容量：即在特定条件下，某成分与基质反应达到平衡时，存在于基质上的饱和容量。一般以每克（或毫升）基质结合某种成分的毫摩尔数或毫克数来表示。其数值大，表明基质对某种成分的结合力强，否则反之。吸附柱层析二、基本原理吸附层析法（液-固层析法，LSC）原理：利用固定相的固体吸附剂表面对不同组分吸附力的大小及洗脱液对它的溶解度的差异进行分离。成分的极性决定于其分子中所含官能基团的极性和分子结构，物质的极性越大则越容易被固体吸附剂(硅胶或氧化铝)吸附。特点：适合分离不同种类（例如分离醇和芳香烃）的化合物。三、吸附剂1.吸附剂的选择及预处理：活性多孔固体，表面积大、颗粒均匀、吸附选择性好、稳定性强和成本低廉等性能。常用的吸附剂有活性炭、硅石、氧化铝、羟基磷灰石等。羟基羟基磷灰石（HA）[Ca10(PO4)6.(OH)2],可用于分离蛋白质、酶、核酸及病毒等生命物质。其表面有Ca2+和PO43-两种带电基团。羟基磷灰石层析在实验室中最大的用途是分离双链DNA和单链DNA。亦可除去混合物中的DNA。三、吸附剂硅胶(Silicagel)：略带酸性，适用于酸性与中性样品之分离，碱性样品容易产生反应或拖尾。A.含水量活性硅胶是多孔的、表面含有很多硅醇基团（-Si-OH）颗粒状极性吸附剂。含水量高时，则结合力小（或活性小）。B.粒度

供层析用的氧化铝，用于拄层析的，其粒度要求在100～160目之间。粒度大子100目，分离效果差：小于160目，溶浓流速大慢，易使谱带扩散。样品与氧化铝的用量比，一般在1：20～50之间层析柱的内径与柱长比例在1：10-20之向。三、吸附剂活性炭(Silicagel)：是使用较多的一种非极性吸附剂。一般需要先用稀盐酸洗涤，其次用乙醇洗，再以水洗净，于80℃干燥后即可供层析用。层析用的活性炭，最好选用颗粒活注炭，若为活性炭细粉，则需加入适量硅藻土作为助滤剂一并装柱，以免流速太慢。活性炭主要用于分离水溶性成分，如氨基酸、糖类及某些甙。活性炭的吸附作用，在水溶液中最强，在有机溶剂中则较低弱。故水的洗脱能力最弱，而有机溶剂则较强。例如以醇-水进行洗脱时，则随乙醇浓度的递增而洗脱力增加。活性炭对芳香族化合物的吸附力大于脂肪族化合物，对大分子化合物的吸附力大于小分子化合物。利用这些吸附性的差别，可将水溶性芳香族物质与脂肪族物质分开，单糖与多糖分开，氨基酸与多肽分开。吸附原理:吸附剂与被吸附物质之间的吸引力是范德华力，作用可逆吸附层析的应用氨基酸、肽、糖类、脂类、苷（皂苷）类物质的分离、鉴定纯净水、医药用水的制备药液脱色薄层层析一、操作及注意事项：一般层析操作包括薄板制备、点样、展层、显色、Rf值测定和结果分析等步骤。1.薄层板的制备(1)硅胶的分类：硅胶G系含有10%~15%锻石膏和5%淀粉的硅胶，黏性好；硅胶CMC系含有适量羧甲基纤维素的硅胶；硅胶HF254系含有荧光剂的硅胶H；薄层层析(Thinlayerchromatography)一、操作及注意事项：一般层析操作包括薄板制备、点样、展层、显色、Rf值测定和结果分析等步骤。1.薄层板的制备(2)硅胶薄层板的制备①玻板：洗净；20cm20cm；6cm20cm②制板：涂布方法(玻棒涂布法、有机玻璃尺涂布法、半机械涂布法)；注意事项：颗粒均匀细小(>200目)；厚度均一适中(0.25mm-0.5mm-1mm)；2.点样(<2mm)3.展层4.显色聚酰胺薄膜层析1966年之后发展起来的一种层析方法；特别应该指出的是，用此法分析氨基酸衍生物DNP-氨基酸、PTH-氨基酸、DNS-氨基酸时，具有灵敏度高、分辨力强、展层迅速和操作简便等优点。可用于酚类、醌类、硝基化合物、氨基酸及其衍生物、核酸碱基、核苷、核苷酸、杂环化合物、合成染料、磺胺、抗菌素、环酮、维生素B和杀虫剂等16类化合物。GasChromatographyUsedtodeterminethechemicalcompositionofunknownsubstances,suchasthedifferentcompoundsingasolineshownbyeachseparatepeakinthegraphbelow.LiquidChromatographyUsedtoidentifyunknownplantpigments&othercompounds.ExamplesofChromatographyPaperChromatographyCanbeusedtoseparatethecomponentsofinks,dyes,plantcompounds(chlorophyll),make-up,andmanyothersubstancesThin-LayerChromatographyUsesthinplasticorglasstraystoidentifythecompositionofpigments,chemicals,andotherunknownsubstances.聚酰胺薄膜层析基本原理：聚酰胺对极性物质的吸附作用是由于它能和被分离物之间形成氢键。这种氢键的强弱就决定了被分离物与聚酰胺薄膜之间吸附能力的大小。由己二酸与己二胺聚合而成疏水层析(hydrophobicinteractionchromatography，HIC)疏水层析是根据分离成分和固定相之间疏水力差异性大小而得到分离。