T-SPOTTB不含医院名称

结核感染T细胞斑点检测试剂盒（免疫斑点法）上海复星一、背景公司成立于2003年，依托牛津大学科研技术开发新产品基于T细胞检测的技术平台最先获得认可产品：T-SPOT®.TB在欧洲、美国、加拿大和其它地区正式上市OxfordImmunotec公司简介Above:UKheadquartersAbingdon,OxonBelow:USheadquarters,Marlborough,MA结核病——全球关注的问题全球20亿人口感染结核新增活动性结核病人约900万/年每年130万患者死亡中国450万活动性结核病人新增活动性结核病人约145万/年死亡人数约13万/年试剂盒研制临床背景活动性结核与潜伏感染接触活动性结核病患者暴露程度不足，结核杆菌被机体免疫力清除没有症状,结核杆菌仍旧存在而不能被侦测

X-光/CT扫描显示正常没有抗体应答诊断困难传统的结核感染检测只有TST（PPD）机体被感染受机体免疫力抑制没有临床症状终身处于感染状态潜伏感染有临床症状具有传染性结核杆菌可以通过涂片、培养检测出胸部的X-光或CT扫描显示异常

肺外结核难以诊断(特别是儿童)活动性结核5%5%再次激活控制结核的关键早发现早治疗二、方法原理γ-干扰素释放实验（IGRAs，interferon-gammareleaseassays）酶联免疫斑点技术（ELISPOT，Enzyme-LinkedImmunoSpotassay）结核杆菌特异抗原早期抗原靶6（ESAT-6，earlysecretedantigenictarget6）培养滤液蛋白10（CFP10，culturefiltrateprotein10）试剂盒研制技术背景γ-干扰素释放实验（IGRAs）TB抗原多肽T细胞活化T细胞γ干扰素γ干扰素检测阴性γ干扰素检测阳性结核感染者体内存在特异的效应T淋巴细胞，效应T淋巴细胞再次受到结核抗原刺激时会分泌多种细胞因子（IFN-γ）。因此，检测效应T淋巴细胞可用于结核病或结核潜伏感染者的诊断。由于效应T细胞存活时间很短，而且具有特异性，因此可以作为机体是否正处于被感染的指标，无论是否有临床症状。基于IGRAs原理的产品目前已被美国、加拿大、英国、德国、意大利、瑞士、法国、荷兰、日本等国家写入本国的结核诊疗指南中γ-干扰素释放实验（IGRAs）1983年，在南北两个半球地理位置相距遥远的两个研究小组几乎同时、独立地创立了这项技术。一个研究小组位于澳大利亚西部的柏斯Peth，牵头人是当时正在当地Margaret女王医院儿童医学研究所攻读博士学位的JonathonD.Sedgwich（SedgwickJDet.al.,1983）。另一个研究小组位于北欧瑞典城市哥德堡Gothenburg，带头人是哥德堡大学医学微生物系的学者CecilC.Czerkinsky

（CzerkinskyCCet.al.,1983a）。酶联免疫斑点技术（ELISPOT）近二十多年来，随着抗体制备、PVDF膜材料等技术改良，ELISPOT分析技术已经是当世公认的最灵敏的抗原特定T细胞的体外检测技术结合了细胞培养技术与酶联免疫吸附技术，能够在单细胞水平检测细胞因子的分泌情况，灵敏度高。其技术原理，可一句话概括为：用抗体捕获培养中细胞所分泌的细胞因子，并以酶联斑点显色方式将其表现出来（SedgwickJD2005）。酶联免疫斑点技术（ELISPOT）酶联免疫斑点技术（ELISPOT）由结核杆菌基因组RD1区相同的操纵子编码的蛋白所有的卡介苗（BCG）均丢失该基因序列绝大多数的环境分枝杆菌也不存在RD1区结核杆菌特异抗原ESAT-6与CFP10抗原采用γ-干扰素释放实验原理，依靠结核特异抗原保证效应T淋巴细胞的特异性结合酶联免疫斑点技术的特性，提高检测灵敏度三、试剂及检测过程试剂盒主要原材料研究试剂盒主要组成成分结核杆菌特异抗原（ESAT-6、CFP10）植物血凝素（PHA）对照抗原预包被的培养板、标记二抗、底物显色液国外上市情况2004年-英国MHRA认证和欧盟CE认证（EU）2005年-加拿大上市许可2006年-韩国上市许可2008年-美国FDA的PMA认证2010年-中国、新加坡和俄罗斯的产品注册

试剂盒国外上市及应用情况采集样本（外周抗凝全血）密度梯度离心分离外周血单个核细胞（PBMCs）洗涤PBMCs检测过程把PBMCs与结核特异抗原一同加入到预包被抗γ-干扰素抗体的培养孔中37℃二氧化碳孵育16-20小时检测过程洗涤培养孔加标记二抗孵育1小时检测过程洗涤培养孔加显色液用蒸馏水终止反应检测过程1个斑点=1个效应T细胞检测过程阴性结果阳性结果空白对照抗原AESAT-6抗原BCFP10阳性对照（PHA）实际效果图四、比较结核病的常规诊断方法（1）细菌学检查是结核病诊断的金标准，但涂片阳性率低，培养又耗费时日（2）分子生物学检查虽然快速、灵敏，但操作烦琐、技术要求高（3）结核抗体诊断诊断价值有限，但其简便、快速，可以作为结核病的辅助诊断方法之一（4）PPD（TST）实验传统的结核感染检测方法，对于接种过卡介苗(BCG)或环境分枝杆菌感染的受试者会出现一定的假阳性结果，对于使用激素或免疫抑制剂的受试者会出现一定的假阴性结果1、方法学比较——细菌学细菌学检测——涂片、培养结核病诊断的“金标准”涂片：快速，简便，特异性较好，灵敏度差培养：耗时长，特异性高，灵敏度稍高于涂片——美国FDA临床数据——国内临床数据——国内外文献2、结核菌素皮试——PPDPPD的临床意义——阴性结果：1、表示未受结核菌感染2、某些情况下不排除已受结核菌感染,使用免疫抑制剂等;免疫功能低下如重症结核病,慢性消耗性疾病,肿瘤,艾滋病,高龄等。3、阴性也不表示没有结核感染.值得注意的是假阴性情况,在临床上有感染结核的确切依据而患者PPD试验却阴性,这种情况常见于以下疾病：初次感染结核菌4～8周以内,重度营养不良,恶性肿瘤,机体免疫缺陷性疾病（先天性免疫缺陷症,艾滋病）,免疫抑制剂使用者等,个别老年人因机体变态反应功能低下也常呈阴性反应。结核菌素皮试——PPDPPD的临床意义——阳性结果：1.一般阳性和中度阳性：结核病现症患者；已受结核菌感染但并不意味着发病或患病；卡介苗接种所致变态反应；2.强阳性：结核病患者；感染结核菌未发病者.强阳性人群结核病的发病率高,在未找到病变时可作预防性治疗。

T-SPOT.TB

与皮试的比较皮试TST(PPD)的影响因素1、免疫力状况——年龄、药物2、交叉反应——卡介苗、环境分枝杆菌3、检测操作、结果判断方法学比较——TSTVsT-SPOT.TB假阳性—卡介苗接种—环境分枝杆菌假阴性—免疫力状况—年龄（新生儿、老年人）—药物特异性—不受卡介苗接种影响—不受环境分枝杆菌影响灵敏度—基本不受免疫力状况影响—肺外结核检出率高—药物、年龄例：研究数据293例怀疑结核病的非洲儿童平均年龄3岁，约46%HIV抗体阳性，多数合并营养不良57例确诊结核病的儿童中，ELISPOT阳性率81%；TST阳性率35%年龄、HIV感染状态和营养不良的严重程度对ELISPOT结果无影响，但均能导致TST结果的显著差异LiebeschuetzetalLancet.2004方法学比较——TSTVsT-SPOT.TBT-SPOT.TBtestTSTStudiesofIGRASpecificityinSubjectsinLowEndemicitySettingsSubjectsNumberpositivesPositiveRate"Specificity"%SubjectsNumberpositivesPositiveRate"Specificity"%AdamsetalScandJInfectDis.2008;40(3):196-203.1800.0%100.0%

BocchinoetalEurJClinMircroInfectDis(2008)

May10*49510.2%89.8%50816.0%84.0%DetjenetalClinInfectDis2007Aug1;45(3):322-8*4012.5%97.5%401742.5%57.5%BarsegianetalJHospInf(2008)epubaheadofprint9511.1%98.9%953233.7%66.3%ClarketalClin&ExpImmunol2007Nov;150(2):238-444700.0%100.0%

DhedaetalAIDS200519;2038-411800.0%100.0%

MeieretalEJCMID200524;529-5361100.0%100.0%1100.0%100.0%SUBTOTAL(T-SPOTvs.TSThead:headstudiesonly)19573.6%96.4%1965729.1%70.9%五、临床及评价1、将该产品（方法学IGRA）

写入诊疗指南的国家（Guidelines）英国、爱尔兰、德国、法国、意大利、瑞士、荷兰、葡萄牙、丹麦、挪威美国、加拿大日本、韩国、澳大利亚等指南解读（一）建议用IGRA替代TST用于结核筛查德国、英国、瑞士、丹麦、波兰等适用于抗TNF-α

治疗人群指南解读（二）TST和IGRA两者均可美国、法国、澳大利亚、日本等卡介苗(BCG)接种人群首选IGRA（美国）指南解读（三）两步法：先用TST，再用IGRA以提高灵敏度与特异性加拿大、西班牙、荷兰、韩国、澳大利亚等主要适用于接触追踪2、应用方向1）结核病辅助诊断/疗效评价“菌阴”结核病患者的辅助诊断肺外结核的鉴别诊断抗痨治疗的疗效评价2）免疫力低下/受抑制患者的结核诊断/感染筛查使用生物制剂/免疫抑制剂患者的结核感染筛查HIV感染者/肾透析患者/器官移植患者3）儿童结核病的辅助诊断4）结核密切接触者/高危人群的结核感染筛查结核病患者的家属/医务工作者/监狱囚犯5）接触追踪对于“涂阴”结核病患者有很高的检出率（94.2%）对于肺外结核病患者有很高的检出率（90.3%）对于结核潜伏感染的检测，不受卡介苗（BCG）接种影响，比PPD检测更准确不能够提示临床患者的病变部位不能够根据斑点数量的多少来判断受试者是活动性结核病患者或是潜伏感染者对于结核/癌症患者的鉴别诊断，须结合临床症状进行判断科室特点消化科——腹水待查——肠结核的鉴别诊断——发热待查——生物制剂治疗前结核筛查科室特点呼吸/传染/感染科——呼吸系统疾病与结核鉴别诊断——胸水/心包积液鉴别诊断——肺外结核辅助诊断——发热待查科室特点风湿免疫科——生物制剂/免疫抑制/激素等药物的使用——结核筛查——肺结核与肺间质病的鉴别诊断——发热待查科室特点儿科——儿童肺结核的辅助诊断——