基因工程的基本操作程序

基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序主要包括四个基本步骤：1）目的基因的获取2）基因表达载体的构建3）将目的基因导入受体细胞4）目的基因的检测与鉴定基因工程的基本操作流程步骤一：目的基因的获取

目的基因是人们所需要转移或改造的基因,获取目的基因是实施基因工程的第一步。

如苏云金芽孢杆菌的抗虫基因，还有植物的抗病（抗病毒、抗细菌）基因、种子贮藏蛋白的基因，以及人的胰岛素基因、干扰素基因等。补：原核细胞的基因结构非编码区非编码区编码区编码区上游编码区下游与RNA聚合酶结合位点启动子终止子RNA聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。

转录开始后，RNA聚合酶沿DNA分子移动，并以DNA分子的一条链为模板合成RNA。

转录完毕后，RNA链释放出来，紧接着RNA聚合酶也从DNA模板链上脱落下来。①不能转录为信使RNA，不能编码蛋白质。：能转录相应的信使RNA，能编码蛋白质编码区非编码区原核细胞的基因结构②有调控遗传信息表达的核苷酸序列，在该序列中，最重要的是位于编码区上游的RNA聚合酶结合位点。启动子补：真核细胞的基因结构编码区非编码区非编码区与RNA聚合酶结合位点内含子外显子能够编码蛋白质的序列叫做外显子不能够编码蛋白质的序列叫做内含子启动子终止子编码区上游编码区下游内含子：外显子：真核细胞的基因结构编码区非编码区外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列：有调控作用的核苷酸序列，包括位于编码区上游的RNA

聚合酶结合位点。非编码序列：包括非编码区和内含子原核细胞与真核细胞的基因结构比较思考编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？连续不连续编码区非编码一、目的基因的获取1、目的基因主要是指______________________编码蛋白质的结构基因与生物抗逆性、优良品种，生物药物以及工业所需用酶有关的基因，也可以是一些具有调控作用的因子。2、获取目的基因的常用方法有哪些?（1）从基因文库中获取（2）利用PCR技术扩增（3）人工合成（一）从基因文库中获取目的基因（序列未知）1.什么叫基因文库？

基因文库

基因组文库部分基因文库（cDNA文库）基因文库中不是直接保管相应基因，而是保存受体菌，菌中含基因。将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入到受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。基因组文库与部分基因文库的关系基因组文库的构建模式图部分基因文库的构建模式图基因组文库和部分基因文库的比较小大无有无有某种生物的部分基因某种生物的全部基因可以部分基因可以基因组文库与部分基因文库的关系怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因呢?目的基因的提取方法直接分离基因人工合成基因反转录法根据已知的氨基酸序列合成DNA：鸟枪法鸟枪法：供体细胞中的DNA许多DNA片段运载体限制酶与载体连接载入受体细胞产生特定性状导入外源DNA扩增目的基因分离(直接分离法)1、直接分离基因1）反转录法：以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。目的基因的mRNA单链DNA(cDNA)双链DNA(即目的基因)反转录合成2.人工合成基因法2）根据已知的氨基酸序列合成DNA法：

根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的信使RNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测出它的结构基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测目的基因化学合成上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？操作简便广泛使用工作量大，盲目，分离出来的有时并非一个基因专一性强操作过程麻烦，mRNA很不稳定，要求的技术条件较高专一性最强仅限于合成核苷酸对较少的简单基因思考:为什么要构建基因文库?直接从含有目的基因的生物体内提取不行吗?哪些新技术能大大简化基因工程的操作技术？1）DNA序列自动测序仪：2）PCR技术：

对提取出来的基因进行核苷酸序列分析。

使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增。①

概念：PCR全称为_______________，是一项在生物____复制___________的核酸合成技术

③条件：_____________________（模板）__、

_______________、___________(做启动子)、___________.前提条件：②原理：__________④方式：以_____方式扩增，即____（n为扩增循环的次数）⑤结果：选修P83聚合酶链式反应体外特定DNA片段DNA复制已知基因的核苷酸序列四种脱氧核苷酸一对引物DNA聚合酶指数2n使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增(二)利用PCR技术扩增目的基因⑥过程：a、变性（94℃）：双链DNA模板在热作用下，_____断裂，形成___________b、退火（复性55℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部________。c、延伸（72℃）：在TaqDNA酶的作用下，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的________。氢键单链DNA双链DNA链(二)利用PCR技术扩增目的基因1.用一定的_________切割质粒，使其出现一个切口，露出____________。2.用_____________切断目的基因，使其产生_________________。(二)基因表达载体的构建——核心3.将切下的目的基因片段插入质粒的______处，再加入适量___________，形成了一个重组

DNA分子（重组质粒）限制酶黏性末端同一种限制酶的黏性末端切口DNA连接酶相同质粒DNA分子限制酶处理两个黏性末端获得目的基因DNA连接酶重组DNA分子（重组质粒）——核心同一种(二)基因表达载体的构建4.过程:5.基因表达载体的组成：复制原点+目的基因+启动子+终止子+标记基因它们有什么作用？常用的受体细胞：

有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。将目的基因导入受体细胞的原理借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。步骤三：目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞（一）转化：目的基因进入_________内，并且在受体细胞内维持_____和_____的过程受体细胞稳定表达（二）方法将目的基因导入植物细胞将目的基因导入动物细胞将目的基因导入微生物细胞农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法——显微注射法——感受态细胞将目的基因导入植物细胞的方法：1、农杆菌转化法

（适用于双子叶植物和裸子植物）（1）农杆菌介绍（2）原理及适用范围(三)将目的基因导入受体细胞（1）农杆菌转化法①特点：

Ti质粒上的T-DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力。②转化过程:Ti质粒目的基因构建表达载体导入植物细胞插入植物细胞染色DNA表达新性状转入农杆菌基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒（钨粉粒子和金粉粒子）表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。（2）基因枪法常用于单子叶植物（3）花粉通道法植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。我国科学家独创将目的基因导入动物细胞（1）方法：显微注射法（将基因表达载体提纯，用显微仪注射到受精卵中）思考：为什么要用受精卵而不用体细胞？（2）操作程序:提纯含目的基因表达载体取受精卵显微注射移植到输卵管或子宫受精卵发育新性状动物常用法：常用菌：原核生物作受体细胞原因：过程：Ca2+处理大肠杆菌感受态细胞表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA3.将目的基因导入微生物细胞Ca2+处理大肠杆菌繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少受精卵体细胞受精卵细胞/个体农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法显微注射技术用Ca2+处理成感受态细胞四、目的基因的检测与鉴定检测:是否插入目的基因是否转录是否翻译鉴定:分子水平鉴定个体生物学水平鉴定DNA分子杂交示意图

采用一定的技术手段，将两种生物的DNA分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。1、检测转基因生物的DNA上是否插入了目的基因①首先取出转基因生物的基因组DNA；（1）方法:DNA分子杂交（2）过程:②

将含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记,以此做探针；③

使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带,表明染色体已插入染色体DNA中。（一）检测2、检测目的基因是否转录出了mRNA①方法:分子杂交②过程:用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂交带,表明目的基因转录出了mRNA。提取方法——抗原-抗体杂交苏云金杆菌Bt毒素蛋白将Bt毒蛋白注射小鼠体内从小鼠血管抽出血液分离出抗Bt毒素的抗体抗体蛋白质

出现杂交带脱分化组织培养3、检测目的基因是否翻译成蛋白质（二）鉴定（个体生物学水平）抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等目的基因的表达和检测4、目的基因的检测和鉴定大量的受体细胞接受不多的目的基因。处理的受体细胞中真正摄入了目的基因的很少，必须将它从中检测出来。将每个受体细胞单独培养形成