研究生基因组学

表观基因组学GregorMendel(1822-1884）遗传学之父(Thegeneticfactors)，发现了遗传学基本规律（Publishedin1865and1866and“re-discovered”in1900）。遗传简史：遗传简史：ThomasHuntMorgan(1866-1945)发现基因连锁互换定律（Publishedin1915）Discoveredthe3rdbasicgeneticlaw,togetherwithMendel’stwolaws,theyformthebasisofwhatisnowknownasclassicalgenetics.遗传简史：JamesWatson&FrancisCrick发现DNA双螺旋结构（Publishedin1953)，分子遗传学诞生。

中心法则（centraldogma）碱基序列（基因）决定性状，序列改变，引起性状的改变。BUT…“Someauthorsusetheterm“variation”inatechnicalsense,asimplyingmodificationdirectlyduetothephysicalconditionsoflife;and“variations”inthissensearesupposednottobeinherited;butwhocansaythatthedwarfedconditionofshellsinthebrackishwatersoftheBaltic,ordwarfedplantsonAlpinesummits,orthethickerfurofananimalfromfarnorthwards,wouldnotinsomecasesbeinheritedforatleastafewgenerations(Darwin,1859)?”Lamarckwasthefirstmanwhoseconclusionsonthesubjectexcitedmuchattention.Thisjustlycelebratednaturalistfirstpublishedhisviewsin1801...hefirstdidtheeminentserviceofarousingattentiontotheprobabilityofallchangesintheorganic,aswellasintheinorganicworld,beingtheresultoflaw,andnotofmiraculousinterposition.（

Darwin,

1861）从遗传学的角度来看，

同卵双生的孪生子具有完全相同的基因组。如果这两个孪生子在同样的环境下成长，从逻辑上说，俩人的气质和体质应该非常相似。但研究者发现，一些孪生子的情况并不符合预期的理论。往往在长大成人后出现性格、健康方面的很大差异。这种反常现象长期困扰着遗传学家。现在科学家们发现。可以在不影响DNA序列的情况下改变基因组的修饰．这种改变不仅可以影响个体的发育，而且还可以遗传下去。在“基因决定论”的背后．隐藏着一个重要的．长期以来争执不休的问题：环境的作用能否改变个体的遗传特性，并传递给下一代?这种被称为“拉马克学说”(Lamarckism)的观点一直被正统的生物学家拒之门外．但现实的生命世界又一次次地把这个话题送到研究者的视线内。瑞典一个科学家小组曾在2002年11月发表了一项研究，他们的统计结果表明，

对于生于1890-1920年的瑞典男人的孙辈而言，如果其祖父在青少年期间吃得很好，那么孙辈因糖尿病而死亡的概率就很高；如果其祖父是在饥饿中长大的．那么孙辈死于心脏病的机会就很少。也就是说，祖父辈的饮食状态影响到了孙辈的健康状态。从这个例子可以得到这样一种结论：个体在发育和生长过程中获得的环境影响．被遗传给了后代。从这里可以引申出一个更根本的问题：什么决定基因。大自然(环境)如此丰富多彩、如此变化不停，很难想象，对于一个开放的复杂生命系统，不会打上它的烙印。也许这是一个“先有鸡还是先有蛋”的进化论问题，但不论怎样，基因不会代表一切，更不能决定一切Jean-BaptisteLamarck

(1744-1829)获得性遗传（Inheritanceofacquiredcharacteristics）Science

7April2000:Vol.288.no.5463,p.38WasLamarckJustaLittleBitRight?MichaelBalterAlthoughJean-BaptisteLamarckisrememberedmostlyforthediscreditedtheorythatacquiredtraitscanbepasseddowntooffspring,

newfindingsinthefieldofepigenetics,thestudyofchangesingeneticexpressionthatarenotlinkedtoalterationsinDNAsequences,arereturninghisnametothescientificliterature.AlthoughthesenewfindingsdonotsupportLamarck'soverallconcept,theyraisethepossibilitythat"epimutations,"astheyarecalled,couldplayaroleinevolution.1942年，Waddington最早提出表观遗传学（epigentics）一词，认为是遗传学领域中探讨基因型与表现型之间相互关系的一个新的研究方向。近年来，现代分子生物学认为细胞中信息的表达受两种因素控制：一种是遗传调控，另一种是表观遗传调控。2003年10月正式宣布开始投资和实施人类表观基因组计划（HGP）。表观遗传学（Epigenetics）？Epigeneticsreferstoheritablealterationsingeneexpressionthatdonotentailchangesinnucleotidesequence.表观遗传学是指不需要核苷酸序列变异的基因表达的可遗传改变。表观遗传变异是如何实现的？？？

Epigeneticeffectscanbecomplishedbyseveralself-reinforcingandinterrelatedcovalentmodificationsonDNAand/orchromosomalproteins,suchasDNAmethylationandhistonemodifications,andbychromatinremodeling,suchasrepositioningofnucleosomes.Theseheritablemodificationsarecollectivelytermed“epigeneticcodes”(reviewedinRichardsandElgin,2002).表观遗传调控机制DNA甲基化DNAmethylation

组蛋白共价修饰

CovalentmodificationsinHistone染色体重塑Chromatinremodeling非编码RNA调控基因表达重新编程14一、DNA甲基化

DNA甲基化(DNAmethylation)是研究得最清楚、也是最重要的表观遗传修饰形式，主要是基因组DNA上的胞嘧啶第5位碳原子和甲基间的共价结合，胞嘧啶由此被修饰为5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine，5mC)。DNMT1SAM胞嘧啶5-甲基胞嘧啶胞嘧啶甲基化反应

14S-腺苷甲硫氨酸

以基因型为a/a的母鼠及其孕育的基因型为AVY/a的仔鼠作实验对象。孕鼠分为两组，试验组孕鼠除喂以标准饲料外，从受孕前两周起还增加富含甲基的叶酸、乙酰胆碱等补充饲料，而对照组孕鼠只喂饲标准饲料。

结果实验组孕鼠产下的仔鼠大多数在身体的不同部位出现了大小不等的棕色斑块，甚至出现了以棕褐色为主要毛色的小鼠。而对照组孕鼠的仔鼠大多数为黄色。分析表明喂以富甲基饲料的孕鼠所产仔鼠的IAP所含CpG岛的甲基化平均水平远高于对照组，转录调控区的高甲基化使原该呈异位表达的基因趋于沉默，毛色也趋于棕褐色。

这种修饰并非发生在DNA序列所有的C上，而主要是在CG一起出现是的C上（后来发现：在胚胎干细胞，也有很多甲基化发生其他C上）。别小看了这一个小小的修饰，却给DNA增加了额外的信息，使得有限的基因组遗传信息的表现呈现出丰富的多样性和可塑性。哺乳动物基因组中5mC占胞嘧啶总量的2%-7%；在结构基因的5’端调控区域,

CpG二连核苷常常以成簇串联形式排列，富含CpG二连核苷的区域称为CpG岛(CpGislands)，其大小为500-1000bp，约56%的编码基因含该结构。一般而言，DNA甲基化会抑制基因的表达；发生在基因启动子或其附近区域的甲基化将直接阻碍AP-2、c-Myc、E2F和NF-κB等转录因子与启动子结合，使基因不能转录或降低基因的转录水平。基因5'端的调控元件发生甲基化后能结合特定甲基化CpG序列结合蛋白(methylCpGbindingprotein，MBP)，从而间接阻止转录因子与启动子形成转录复合体；此外，甲基化还能改变染色质的构象，使染色质凝缩成非活性的高级结构。启动子是参与特定基因转录及其调控的DNA序列。包含核心启动子区域和调控区域。核心启动子区域产生基础水平的转录，调控区域能够对不同的环境条件作出应答，对基因的表达水平做出相应的调节。

启动子的范围非常大，可以包含转录起始位点上游2000bp，有些特定基因的转录区内部也存在着转录因子的结合位点，因此也属于启动子范围。

把DNA甲基化理解为“一把锁”，凡是被DNA甲基化标记的部分，大都是需要被“尘封”“监禁”的基因。比如基因组的“捣蛋鬼”—转座子，就是被甲基化这把“锁”管制着，失去管制或管制不严，这些“捣蛋鬼”会在基因组里跳来跳去（肿瘤、精神疾病（自闭症等）等，转座子：是基因组中一段可移动的DNA序列，可以通过切割、重新整合等一系列过程从基因组的一个位置“跳跃”到另一个位置。DNA甲基化在体细胞水平是十分稳定、且可遗传的，也就是说，体细胞分裂形成的“女儿”细胞（还可以继续分裂）不仅继承了“母亲”细胞的基因组DNA序列，还十分忠实地拷贝了“母亲”细胞基因组DNA的甲基化模式。

DNA甲基化状态的保持DNA主动去甲基化DNA全新甲基化在生殖细胞形成过程中，还有受精卵向胚胎分化的过程中，基因组DNA的甲基化要经过一个大规模的“重塑”，而且时间窗口很短。

受精卵在分裂前，显然对精子的基因组ＤＮＡ甲基化进行了一次“清洗”，在受精卵分裂后很快又开始快速重建。另外，还有生殖细胞（精子和卵子）的形成过程中，也有这么一个甲基化重塑现象。

DNA甲基化在这么短的时间内如何被“清洗”掉的？回答这个问题的关键：找到能够将DNA的甲基化基团去掉的DNA去甲基化酶（DNAdemethylase）。异常的DNA甲基化则会引发疾病甚至肿瘤的发生，异常CpG的重新甲基化通常被认为是人类癌症发生的一个早期特征。人类的肿瘤细胞株中发现了许多肿瘤相关基因的5‘端启动子区的CpG岛都发生了高甲基化，例如某些抑癌基因(p16)、肿瘤转移抑制基因(Nm23)、DNA修复基因(MLH1)以及血管生成抑制基因等。某些基因在不同的癌症中都被甲基化，如p16；而有的基因只在特定的癌症中被甲基化，如GSTP1基因只在前列腺癌中发生高甲基化；同时，许多血液病也与基因的高甲基化有关。基因组甲基化分析方法甲基化敏感扩增多态性技术(MSAP)优点：(1)不需知道被测DNA的序列信息，在不同生物上具有通用性，可用于DNA序列背景知识未知的生物。(2)操作相对简便，在AFLP技术体系的基础无需改进，即可操作。(3)可在全基因组范围检测CCGG位点的胞嘧啶甲基化变化。MSAP技术的局限性在于不能完成非CCGG位点的胞嘧啶甲基化。

高效液相层析及相关方法

能够定量测定基因组整体甲基化水平。特定DNA片段甲基化检测方法亚硫酸氢盐预处理法联合甲基化敏感的限制性内切酶法探针杂交法

组蛋白修饰3838组蛋白修饰是表观遗传研究的重要内容。组蛋白的N端是不稳定的、无一定组织的亚单位，其延伸至核小体以外，会受到不同的化学修饰，这种修饰往往与基因的表达调控密切相关。被组蛋白覆盖的基因如果要表达，首先要改变组蛋白的修饰状态，使其与DNA的结合由紧变松，这样靶基因才能与转录复合物相互作用。因此，组蛋白是重要的染色体结构维持单元和基因表达的负控制因子。组蛋白的甲基化修饰主要发生在赖氨酸(K)和精氨酸(R)残基上。赖氨酸甲基化修饰通常发生在组蛋白H3赖氨酸4位、9位、27位、36位、79位残基(H3K4、H3K9、H3K27、H3K36、H3K79)，以及组蛋白H4第20位赖氨酸残基(H4K20)上。通常认为H3K4、H3K36、H3K79的甲基化修饰介导基因转录活化，而H3K9、H3K27、H4K20的甲基化修饰介导转录抑制。精氨酸甲基化修饰通常发生在组蛋白H3精氨酸2位、8位、17位、26位残基(H3R2、H3R8、H3R17、H3R26)，及组蛋白H4精氨酸3位残基上(H4R3)。根据残基上甲基化基团数量的不同，又可分为一甲基化(me1)、二甲基化(me2)、三甲基化(me3)修饰。H3K4甲基化通常被认为是基因的活化信号，主要分布在常染色质区转录活化基因的启动子区，在转录起始和延伸过程中都发挥了重要的作用。H3K4甲基化参与的生物学功能主要包括基因转录调控，与组蛋白乙酰化酶、去乙酰化酶相互作用以及改变临近组蛋白甲基化修饰状态。H3K9H3K9甲基化修饰通常与基因转录抑制及异染色质形成有关。可以与甲基化H3K9结合的蛋白主要有HP1和UHRF1(Ubiquitin—like，containingPHD，RINGfingerdomains1）组蛋白乙酰化是由组蛋白乙酰基转移酶(HAT)和组蛋白去乙酰基酶(HDAC)协调催化完成，修饰的部位一般位于N一末端保守的赖氨酸残基上，如组蛋白H3上的9号和l4号赖氨酸残基以及H4上的5号、8号、l2号和l6号赖氨酸残基。组蛋白乙酰化是一个可逆的动力学过程，可以调节基因的转录：HATs催化组蛋白尾部的赖氨酸残基乙酰化，结果导致局部DNA与组蛋白八聚体的紧密缠绕被解开，使各种转录因子能够与DNA特异调控元件相结合，促使基因发生转录。HDACs则降低了组蛋白的乙酰化水平，使染色质紧缩，DNA与组蛋白八聚体的缠绕更加紧密，限制了转录因子与调控元件的结合，抑制转录的发生。尚永丰院士实验室发表多篇论文揭示乳腺癌发生发展的表观遗传机制

发现了一个新的位于高尔基体的B型组蛋白乙酰转移酶：组蛋白乙酰转移酶（HAT）在细胞染色质重塑、染色体装配过程中起着非常重要的作用。根据其作用特点和作用底物的不同，组蛋白乙酰转移酶被分为A、B两型。A-HAT主要存在于细胞核，能够乙酰化核小体组蛋白，在染色质重塑、基因转录调控中发挥重要作用；B-HAT则主要位于细胞浆，催化细胞内游离的新生组蛋白的乙酰化，在染色质装配过程中起重要作用。尚永丰院士实验室发现了一个新的位于高尔基体的B型组蛋白乙酰转移酶（MolecularCell,2011,44:39-50.IF14.194）。该研究克隆出一个新的含有GCN5乙酰转移酶结构域的蛋白－HAT4，该基因编码的蛋白主要定位于高尔基体，并且在体内外具有组蛋白乙酰转移酶的活性。进一步的研究显示HAT4通过乙酰化新生组蛋白H4K20、K79、K91，参与了细胞复制期核小体形成及染色质装配，从而促进乳腺癌细胞周期的进程和细胞增殖；这些结果揭示了一个新的B型组蛋白乙酰转移酶HAT4在细胞中的生物学活性，同时探讨了其发挥作用的可能的细胞生物学和分子生物学机制。揭示了组蛋白甲基化酶SET8促进乳腺癌细胞上皮－间质转换及其双重基因调控模式的新机制：上皮－间质转换（Epithelial-MesenchymalTransition,EMT）是乳腺癌转移的起始阶段，其调控机理仍不清楚。近期《TheEMBOJournal》发表关于乳腺癌转移时表观遗传学因子SET8调控EMT的研究成果，揭示了组蛋白甲基化酶SET8促进乳腺癌细胞上皮－间质转换及其双重基因调控模式的新机制。上皮-间质转化（EMT）是指上皮细胞在形态学上发生向成纤维细胞或间充质细胞表型的转变并获得迁移的能力。EMT是胚胎发育中的一个基本过程，它使在特殊部位产生的上皮细胞从上皮组织分离并迁移到其他位置，是正常发育、伤口愈合以及恶性上皮肿瘤发生的基础。

TGF-β诱导的上皮间质转化对乳腺癌生成的促进经典的TGF-β信号需要TGF-β与II型TGF-β受体结合，I型受体的转磷酸作用，以及随后Smad2和Smad3的磷酸化。磷酸化的Smad2/3与Smad4形成三聚体，然后易位至细胞核，与转录因子、共激活因子、共抑制因子相互作用，以抑制上皮基因，促进间质蛋白表达。此外，通过激活ERKMAPK激酶，RhoGTP酶和PI3激酶/Akt激活的非Smad信号通路也参与了TGF-β诱导的上皮间质转化。

zili对TGF-信号通路拮抗效应的示意图。Zili阻止Smad4去结合Smad2/3和Smad1/5/9。组蛋白泛素化由E1、E2、E3级联酶催化修饰，也是一个可逆的动力学过程，泛素化修饰的主要部位是组蛋白H2A、H2B、H3及连接蛋白H1的C末端赖氨酸。细胞内蛋白的降解主要通过两个途径，即自噬和泛素蛋白酶体系统。自噬，它的字面上的意思是“自己吃自己”，它在降解细胞内细胞器和较稳定蛋白上起着重要的功能；UPS则负责特异性地降解大多数细胞内蛋白，它是一种高效蛋白降解途径，其生物学作用非常广泛。泛素是一个由76个氨基酸组成的高度保守的多肽链,因其广泛分布于各类细胞而得名。泛素共价地结合于底物蛋白质的赖氨酸残基，被泛素标记的蛋白质将被特异性地识别并迅速降解。靶蛋白的泛素化降解涉及以下3个连续的过程：（1）泛素的活化，这个过程需要以ATP作为能量，泛素C端的羧基连接到泛素活化酶E1的巯基，最终形成一个泛素和泛素活化酶E1之间的硫酯键；（2）泛素活化酶E1将活化后的泛素通过交酯化过程传递给泛素结合酶E2；（3）泛素连接酶E3将结合E2的泛素连接到靶蛋白上。靶蛋白在泛素激活酶E1、泛素结合酶E2和蛋白泛素连接酶E3的作用下共价连接上几个泛素分子，然后被26S蛋白酶体所降解。组蛋白修饰能够引起核小体结构的变化，导致染色质重塑，影响各类转录因子与DNA的结合，进而影响基因的转录。组蛋白乙酰化对于维持组蛋白的功能和DNA转录是必需的，组蛋白乙酰化的失衡将引起相应的染色体结构和基因转录水平的改变，染色质重塑染色质重塑(remodeling)是指染色质位置、结构的变化，主要包括紧缩的染色质丝在核小体连接处发生松动造成染色质的解压缩，从而暴露了基因转录启动子区中的顺式作用元件，为反式作用因子与之的结合提供了可能。染色体重塑的过程由两类结构所介导：ATP依赖型的核小体重塑复合体和组蛋白共价修饰复合体。前者是利用水解ATP获得的能量，改变组蛋白与DNA之间的相互作用；后者对组蛋白的尾部进行共价修饰，包括赖氨酸的乙酰化，赖氨酸和精氨酸的甲基化，丝氨酸和苏氨酸的磷酸化，赖氨酸的泛素化，谷氨酸的多聚ADP核糖基化和赖氨酸的苏素化等。非编码RNA调控非编码RNA按照大小可分为两类：长链非编码RNA和短链非编码RNA。长链非编码RNA在基因簇以至于整个染色体水平发挥顺式调节作用；短链RNA在基因组水平对基因表达进行调控，它们能介导mRNA的降解，诱导染色质结构的改变，决定着细胞的分化命运，还对外源的核酸序列有降解作用以保护本身的基因组。miRNAs是一类进化上高度保守的单链RNA，通常长度在22nt左右。它们由基因组DNA编码，在RNA聚合酶II的作用下转录成为pri-pre-microRNA，通过一系列酶切之后形成成熟的microRNA，与RNA诱导的沉默复合体（RNA-inducedsilencingcomplex,RICS）结合于靶mRNA的3'-UTR区域，阻遏翻译甚至直接降解mRNA，抑制基因表达。真核生物mRNA编码区同源的外源双链RNA(doublestrandRNA，dsRNA)能特异地诱导其同源mRNA的降解，导致相应基因的沉默，这一现象被称为RNA干扰。

miRNA与肿瘤形成、癌症发生密切相关有研究显示，淋巴瘤中miRNA的一类miR17-92可能是潜在的致癌基因，并且转录因子c-Myc能够调节miRNA。通过对来自肺部、胸部、胃部、前列腺、结肠和胰腺等处的540份癌细胞样品进行分析，人们发现了由过量表达的部分miRNAs组成的实体癌症miRNA信号，其中包括miR一17-5p、miR-20a、miR-21、miR-92、miR一106a和miR-155。概念：或称亲本印迹（parentimprinting）是指基因组在传递遗传信息的过程中，通过基因组的化学修饰（DNA的甲基化；组蛋白的甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化等）而使基因或DNA片段被标识的过程。遗传印迹特点：基因组印迹依靠单亲传递某种性状的遗传信息，被印迹的基因会随着其来自父源或母源而表现不同，即源自双亲的两个等位基因中一个不表达或表达很弱。不遵循孟德尔定律，是一种典型的非孟德尔遗传，正反交结果不同。正交Igf-2Igf-2Igf-2mIgf-2mIgf-2Igf-2Igf-2mIgf-2m反交♂♀正常小鼠矮小型小鼠矮小型小鼠矮小型小鼠正常小鼠正常小鼠Ig