《仪器》课件 第一节 概述-1

第三章

色谱分析法2023/2/2第一节色谱法概述一、色谱法的由来、分类和作用1.由来2.分类

3.特点二、气相色谱分离过程

1.气相色谱分离过程

2.分配系数K2023/2/2一、色谱法的由来、分类和作用

1.由来俄国植物学家茨维特在1906年使用的装置：色谱原型装置，如图。

色谱法是一种分离技术，试样混合物的分离过程也就是试样中各组分在分离柱中的两相间不断进行着的分配过程。其中的一相固定不动，称为固定相；另一相是携带试样混合物流过此固定相的流体（气体或液体），称为流动相。色谱分析法定义2023/2/2色谱法

当流动相携带混合物流经固定相时，其与固定相发生相互作用。由于混合物中各组分在性质和结构上的差异，与固定相之间产生的作用力的大小、强弱不同，随着流动相的移动，混合物在两相间经过反复多次的分配平衡，使得各组分被固定相保留的时间不同，从而按一定次序从固定相中流出；再与适当的柱后检测方法结合，实现混合物中各组分的分离与检测。两相及两相的相对运动构成了色谱法的基础2023/2/22.色谱法分类

按流动相可分为：气相色谱：流动相为气体（载气）；液相色谱：流动相为液体。按固定相可分为：气固色谱和气液色谱；液固色谱和液液色谱按分离柱不同可分为：填充柱色谱和毛细管柱色谱；2023/2/23.气相色谱法的特点（1）分离效率高：复杂混合物，有机同系物、异构体，手性异构体。（2）灵敏度高：可以检测出μg.g-1(10-6)级甚至ng.g-1(10-9)级的物质量.（3）分析速度快：一般在几分钟或几十分钟内可以完成一个试样的分析。（4）应用范围广：适用于沸点低于400℃的各种有机或无机试样的分析。不足之处：不适用于高沸点、难挥发、热不稳定物质的分析。被分离组分的定性较为困难。2023/2/25、液相色谱法的特点

特点：高压、高效、高速高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。2023/2/2二、气相色谱分离过程填充柱色谱:气固色谱和气液色谱，两者的分离机理不同。气固色谱的固定相:多孔性的固体吸附剂颗粒。

固体吸附剂对试样中各组分的吸附能力的不同。气液色谱的固定相:由担体和固定液所组成。

固定液对试样中各组分的溶解能力的不同。气固色谱的分离机理:吸附与脱附的不断重复过程；气液色谱的分离机理：气液两相间的反复多次分配过程。2023/2/2气相色谱分离过程当试样由载气携带进入色谱柱与固定相接触时，被固定相溶解或吸附。随着载气的不断通入，被溶解或吸附的组分又从固定相中挥发或脱附，挥发或脱附下的组分随着载气向前移动时又再次被固定相溶解或吸附。随着载气的流动，溶解、挥发，或吸附、脱附的过程反复地进行。2023/2/2分配系数K

组分在固定相和流动相间发生的吸附、脱附，或溶解、挥发的过程叫做分配过程。在一定温度下，组分在两相间分配达到平衡时的浓度（单位：g/mL）比，称为分配系数，用K表示，即：2023/2/2分配系数K的讨论

一定温度下，组分的分配系数K越大，出峰越慢；试样一定时，K主要取决于固定相性质；每个组份在各种固定相上的分配系数K不同；选择适宜的固定相可改善分离效果；试样中的各组分具有不同的K值是分离的基础；某组分的K=0时，即不被固定相保留，最先流出。2023/2/2第三章

色谱分析法一、气相色谱流出曲线二、容量因子与分配系数三、塔板理论四、速率理论五、分离度第二节

色谱理论基础2023/2/2一、气相色谱流出曲线1.基线

无试样通过检测器时，检测到的信号即为基线

2.保留值

（1）时间表示的保留值死时间（tM）：不与固定相作用的惰性物质的保留时间。保留时间（tR）：组分从进样到柱后出现浓度极大值时所需的时间。

调整保留时间（tR＇

)：tR＇=tR－tM

2023/2/2(2)用体积表示的保留值死体积（VM）：VM=tM×F0保留体积（VR）：VR=tR×F0(F0为色谱柱出口处的载气流量，单位：mL/min)

调整保留体积（VR＇）：V

R＇=VR－VM

2023/2/23.相对保留值r21组分2与组分1调整保留值之比：

r21=t’R2

/t’R1=V’R2/V’

R1相对保留值只与柱温和固定相性质有关，与其他色谱操作条件无关，它表示了固定相对这两种组分的选择性。2023/2/2

4.区域宽度用来衡量色谱峰宽度的参数，有三种表示方法：（1）标准偏差()：即0.607倍峰高处色谱峰宽度的一半。（2）半峰宽(Y1/2)：

色谱峰高一半处的宽度Y1/2=2.354（3）峰底宽(Wb)：

Wb=42023/2/2二、容量因子与分配系数

分配系数K：组分在两相间的浓度比；容量因子k：平衡时，组分在各相中的质量比；

k=MS/MmMS为组分在固定相中的质量，Mm为组分在流动相中的质量。容量因子k与分配系数K的关系为：式中β为相比。填充柱相比：6～35；毛细管柱的相比：50～1500容量因子越大，保留时间越长。可由保留时间计算出容量因子，两者有以下关系：2023/2/2塔板理论基本假设：将色谱柱视为精馏塔1）塔板之间不连续；2）塔板之间无分子扩散；3）组分在各塔板内两相间的分配瞬间达至平衡，达一次平衡所需柱长为理论塔板高度H；4）某组分在所有塔板上的分配系数相同；5）流动相以不连续方式加入，即以一个一个的塔板体积加入。三、塔板理论-柱分离效能指标2023/2/2色谱柱长：L，虚拟的塔板间距离：H，色谱柱的理论塔板数：n，则三者的关系为：

n=L/H理论塔板数与色谱参数之间的关系为：2023/2/2有效塔板数和有效塔板高度单位柱长的塔板数越多，表明柱效越高。用不同物质计算可得到不同的理论塔板数。组分在tM时间内不参与柱内分配。需引入有效塔板数和有效塔板高度：2023/2/2塔板理论的特点和不足：

(1)当色谱柱长度一定时，塔板数n

越大(塔板高度H越小)，被测组分在柱内被分配的次数越多，柱效能则越高，所得色谱峰越窄。

(2)不同物质在同一色谱柱上的分配系数不同，用有效塔板数和有效塔板高度作为衡量柱效能的指标时，应指明测定物质。

(3)柱效不能表示被分离组分的实际分离效果，当两组分的分配系数K相同时，无论该色谱柱的塔板数多大，都无法分离。

(4)(不足)该理论是在理想情况下导出的，未考虑分子扩散因素、其它动力学因素对柱内传质的影响。因此它不能解释：a.峰形为什么会扩张？b.影响柱效的动力学因素是什么？2023/2/2四、速率理论-影响柱效的因素

速率方程（也称范·弟姆特方程式）:

H=A+B/u+C·u

H：理论塔板高度，u：载气的线速度(cm/s)减小A、B、C三项可提高柱效；存在着最佳流速；

A、B、C三项各与哪些因素有关？2023/2/21.涡流扩散项－A

A=2λdp

dp：固定相的平均颗粒直径λ：固定相的填充不均匀因子

固定相颗粒越小dp↓，填充得越均匀，A↓，H↓，柱效n↑。表现在涡流扩散所引起的色谱峰变宽现象减轻，色谱峰较窄。2023/2/22.

分子扩散项—BB=2νDgν

：弯曲因子，填充柱色谱，ν<1。Dg：试样组分分子在气相中的扩散系数（cm2·s-1）。由于柱中存在着浓度差，产生纵向扩散：a.扩散导致色谱峰变宽，H↑(n↓)，分离变差。b.分子扩散项与流速有关，流速↓，滞留时间↑，扩散↑c.扩散系数：Dg∝（M载气）-1/2；M载气↑，B值↓2023/2/23.传质阻力项—C

组分在气相和液相两相间进行反复分配时，遇到阻力。传质阻力包括气相传质阻力Cg和液相传质阻力CL，液相传质阻力大于气相传质阻力。即：C=（Cg+CL）2023/2/24.载气流速与柱效-最佳流速

载气流速高时：

传质阻力项是影响柱效的主要因素，流速，柱效,右图曲线的右边。

载气流速低时：

H-u曲线与最佳流速：

由于流速对这两项完全相反的作用，流速对柱效的总影响使得存在着一个最佳流速值，即速率方程式中塔板高度对流速的一阶导数有一极小值。

以塔板高度H对应载气流速u作图，曲线最低点的流速即为最佳流速。

分子扩散项成为影响柱效的主要因素，流速，柱效

，右图曲线的坐边。2023/2/25.速率理论的要点(1)组分分子在柱内运行的多路径与涡流扩散、浓度梯度所造成的分子扩散及传质阻力使气液两相间的分配平衡不能瞬间达到等因素是造成色谱峰扩展柱效下降的主要原因。(2)通过选择适当的固定相粒度、载气种类、液膜厚度及载气流速可提高柱效。(3)速率理论为色谱分离和操作条件选择提供了理论指导。阐明了流速和柱温对柱效及分离的影响(选择柱温的根据是混合物的沸点范围，固定液的配比和检测器的灵敏度。提高柱温可缩短分析时间；降低柱温可使色谱柱选择性增大，有利于组分的分离和色谱柱稳定性提高，柱寿命延长。一般采用等于或高于数十度于样品的平均沸点的柱温为较合适，对易挥发样用低柱温，不易挥发的样品采用高柱温)。(4)各种因素相互制约，如载气流速增大，分子扩散项的影响减小，使柱效提高，但同时传质阻力项的影响增大，又使柱效下降；柱温升高，有利于传质，但又加剧了分子扩散的影响，选择最佳条件，才能使柱效达到最高。2023/2/2五、分离度

塔板理论和速率理论都难以描述难分离物质对的实际分离程度。即柱效为多大时，相邻两组份能够被完全分离。难分离物质对的分离度大小受色谱过程中两种因素的综合影响：保留值之差──色谱过程的热力学因素(组分与固定液的结构和性质)；区域宽度──色谱过程的动力学因素(两项中的运动阻力和扩散)。

色谱分离中的四种情况如图所示：①柱效较高，△K(分配系数)较大,完全分离；②△K不是很大，柱效较高，峰较窄，基本上完全分离；③柱效较低，△K较大,但分离的不好；④△K小，柱效低，分离效果更差。2023/2/2分离度的表达式：R=0.8：两峰的分离程度可达89%；R=1.0：分离程度98%；R=1.5：达99.7%（相邻两峰完全分离的标准）。2023/2/2令Wb(2)=Wb(1)=Wb（相邻两峰的峰底宽近似相等），引入相对保留值和塔板数，可导出下式：2023/2/2分离度与柱效的关系

虽说用较长的柱可以提高分离度，但延长了分析时间。因此提高分离度的好方法是制备出一根性能优良的柱子，通过降低板高，以提高分离度。2023/2/2分离度与相对保留值r21的关系

由基本色谱方程式判断，当r21=1时，R=0，这时，无论怎样提高柱效也无法使两组分分离。显然，r21大，选择性好。研究证明，r21的微小变化，就能引起分离度的显著变化。措施：一般通过改变固定相和流动相的性质和组成或降低柱温，可有效增大r21值。2023/2/2例1：在一定条件下，两个组分的调整保留时间分别为85秒和100秒，要达到完全分离，即R=1.5。计算需要多少块有效塔板。若填充柱的塔板高度为0.1cm，柱长是多少？解：分离度应用示例2023/2/2例1：在一定条件下，两个组分的调整保留时间分别为85秒和100秒，要达到完全分离，即R=1.5。计算需要多少块有效塔板。若填充柱的塔板高度为0.1cm，柱长是多少？解：γ2,1

=100/85=1.18

n有效=16R2[γ2,1/(γ2,1

—1)]2=16×1.52×(1.18/0.18)2

=1548（块）

L有效=n有效·H有效=1548×0.1=155cm即柱长为1.55米时，两组分可以得到完全分离。2023/2/2[例2]已知一色谱柱在某温度下的速率方程的A=0.08cm;B=0.65cm2/s;C=0.003s,求最佳线速度u和最小塔板高H.2023/2/2[例2]已知一色谱柱在某温度下的速率方程的A=0.08cm;B=0.65cm2/s;C=0.003s,求最佳线速度u和最小塔板高H.

解:欲求u最佳和H最小,要对速率方程微分,即dH/du＝d(A+B/u+Cu)/du＝-B/u2+C＝0而,最佳线速:u最佳＝(B/C)1/2最小板高:H最小＝A+2(BC)1/2可得u最佳＝(0.65/0.003)1/2＝14.7cm/sH最小＝0.08+2(0.65×0.003)1/2＝0.17cm2023/2/2[例3]已知物质A和B在一个30.0cm柱上的保留时间分别为16.40和17.63min.不被保留组分通过该柱的时间为1.30min.峰宽为1.11和1.21min,计算:

(1)柱的分离度;

(2)柱的平均有效塔板数目;

(3)平均有效塔板高度;

2023/2/2

解:(1)R=2(17.63-16.40)/(1.11+1.21)=1.06(2)nA=16[(16.40-1.30)/1.11]2=2961nB=16[(17.63-1.30)/1.21]2=2915nav=(2961+2914)/2=2938(3)H=L/n=30.0/2938=1.02×10-2cm

[例3]已知物质A和B在一个30.0cm柱上的保留时间分别为16.40和17.63min.不被保留组分通过该柱的时间为1.30min.峰宽为1.11和1.21min,计算:

(1)柱的分离度;

(2)柱的平均有效塔板数目;

(3)平均有效高度;2023/2/2例2：在根长为1米的填充柱上，空气的保留时间为5s，苯和环己烷的保留时间分别为45s和49s，环己烷色谱峰峰底宽为5s。欲得到R＝1.2的分离度，有效理论塔板数应为多少？需要的柱长应为多少？解：2023/2/2例4：在根长为1米的填充柱上，空气的保留时间为5s，苯和环己烷的保留时间分别为45s和49s，环己烷色谱峰峰底宽为5s。欲得到R＝1.2的分离度，有效塔板数应为多少？需要的柱长应为多少？解：根据公式n有效=16R2[γ2,1/(γ2,1—1)]2r21=t’R2/t’R1neff=16×R2×[γ2,1/(γ2,1—1)]2=16×1.22×(1.1/0.1)2=2788块L＝2.25m2023/2/2一、气相色谱仪及其流程二、载气种类和流速的选择三、进样操作的选择四、气相色谱固定相五、气相色谱检测装置

1．检测器特性

2．热导检测器

3．氢火焰离子化检测器

4.电子捕获检测器

5.具有定性功能的检测器（联用技术）第三节

气相色谱装置及操作条件的选择2023/2/2一、气相色谱流程1.载气系统：包括气源、净化干燥管和载气流速控制;2.进样系统：进样器及气化室；3.色谱柱：填充柱（填充固定相）或毛细管柱（内壁涂有固定液）；4.检测器：可连接各种检测器，以热导检测器或氢火焰检测器最为常见；5.记录系统：放大器、记录仪或数据处理仪；6.温度控制系统：柱室、气化室和检测器的温度控制。2023/2/2二、载气种类和流速的选择1.载气种类的选择

载气种类的选择应考虑三个方面：载气对柱效的影响、检测器要求及载气性质。

(1)载气摩尔质量大，可抑制试样的纵向扩散，提高柱效。

(2)载气流速较大时，传质阻力项起主要作用，采用较小摩尔质量的载气（如H2，He），可减小传质阻力，提高柱效。

(3)热导检测器需要使用热导系数较大的氢气有利于提高检测灵敏度。在氢焰检测器中，氮气仍是首选目标。(4)在载气选择时，还应综合考虑载气的安全性、经济性及来源是否广泛等因素。2023/2/22.载气流速的选择

作图求最佳流速。实际流速稍大于最佳流速，缩短时间。2023/2/2

三、进样操作的选择1.进样方式和进样量的选择

液体试样采用色谱微量进样器进样，规格有1μL，5μL，10μL等。进样量应控制在柱容量允许范围及检测器线性检测范围之内。进样要求动作快、时间短。气体试样应采气体进样阀进样。2023/2/22.气化温度的选择色谱仪进样口下端有一气化器，液体试样进样后，在此瞬间气化;气化温度一般较柱温高30~70℃防止气化温度太高造成试样分解。2023/2/2四、气相色谱固定相1．气固色谱固定相

种类：

活性炭：有较大的比表面积，吸附性较强。

活性氧化铝：有较大的极性。适用于常温下O2、N2、CO、CH4、C2H6、C2H4等气体的相互分离。CO2能被活性氧化铝强烈吸附而不能用这种固定相进行分析。

硅胶：与活性氧化铝大致相同的分离性能，除能分析上述物质外，还能分析CO2、N2O、NO、NO2等，且能够分离臭氧。2023/2/2分子筛：碱及碱土金属的硅铝酸盐(沸石),多孔性。如3A、4A、5A分子筛等(孔径：埃)。常用5A(常温下分离O2与N2)。除了广泛用于H2、O2、N2、CH4、CO等的分离外，还能够测定He、Ne、Ar、NO、N2O等。高分子多孔微球（GDX系列）：新型有机合成固定相（苯乙烯与二乙烯苯共聚）。型号：GDX-01、-02、-03，适用于水、气体及低级醇的分析。2023/2/2（1）性能和制备与活化条件有很大关系；（2）同一种固定相，不同厂家或不同活化条件，分离效果差异较大；（3）种类有限，能分离的对象不多；（4）使用方便。2.气固色谱固定相的特点2023/2/23.固定相的选择

气－液色谱，应根据“相似相溶”的原则①分离非极性组分时，通常选用非极性固定相。各组分按沸点顺序出峰，低沸点组分先出峰。②分离极性组分时，一般选用极性固定液。各组分按极性大小顺序流出色谱柱，极性小的先出峰。③分离非极性和极性的（或易被极化的）混合物，一般选用极性固定液。此时，非极性组分先出峰，极性的（或易被极化的）组分后出峰。2023/2/2

④醇、胺、水等强极性和能形成氢键的化合物的分离，通常选择极性或氢键性的固定液。

⑤组成复杂、较难分离的试样，通常使用特殊固定液，或混合固定相。2023/2/24.固定液配比（涂渍量）的选择

配比：固定液在担体上的涂渍量，一般指的是固定液与担体的百分比，配比通常在5%～25%之间。

配比越低，担体上形成的液膜越薄，传质阻力越小，柱效越高，分析速度也越快。配比较低时，固定相的负载量低，允许的进样量较小。分析工作中通常倾向于使用较低的配比。2023/2/2

5.柱长和柱内径的选择

增加柱长对提高分离度有利（分离度R正比于柱长L2），但组分的保留时间tR↑，且柱阻力↑，不便操作。柱长的选用原则是在能满足分离目的的前提下，尽可能选用较短的柱，有利于缩短分析时间。填充色谱柱的柱长通常为1~3米，内径3~4mm。2023/2/26.柱温的确定

(1)首先应使柱温控制在固定液的最高使用温度（超过该温度固定液易流失）和最低使用温度（低于此温度固定液以固体形式存在）范围之内。(2)柱温↑，被测组分的挥发度↑，即被测组分在气相中的浓度↑，K↓，tR↓，低沸点组份峰易产生重叠。(3)柱温↓，分离度↑，分析时间↑。对于难分离物质对，降低柱温虽然可在一定程度内使分离得到改善，但是不可能使之完全分离，这是由于两组分的相对保留值增大的同时，两组分的峰宽也在增加，当后者的增加速度大于前者时，两峰的交叠更为严重。2023/2/2(4)柱温一般选择在接近或略低于组分平均沸点时的温度。(5)组分复杂，沸程宽的试样，采用程序升温。程

序

升

温2023/2/2五、气相色谱检测装置

色谱仪的关键部件之一，种类较多，原理和结构各异。有的具有广泛性，如热导检测器；有的具有高选择性，仅对某类物质有高响应。1．检测器特性

浓度型检测器：测量的是载气中通过检测器组分浓度瞬间的变化，检测信号值与组分的浓度成正比。

质量型检测器：测量的是载气中某组分进入检测器的速度变化，即检测信号值与单位时间内进入检测器组分的质量成正比。2023/2/2检测器性能评价指标灵敏度S

在一定范围内，信号E与进入检测器的物质质量m呈线性关系：E=SmS=E/m

单位：mV/（mg/cm-3）；（浓度型检测器）

mV/（mg/s）；（质量型检测器）

S表示单位质量的物质通过检测器时，产生的响应信号的大小。S值越大，检测器（也即色谱仪）的灵敏度也就越高。检测信号通常显示为色谱峰，则响应值也可以由色谱峰面积（A）除以试样质量求得：S=A/m2023/2/2最低检测限（最小检测量）噪声水平决定着能被检测到的浓度（或质量）。

从图中可以看出：如果要把信号从本底噪声中识别出来，则组分的响应值就一定要高于N。检测器响应值为2倍噪声水平时的试样浓度（或质量），被定义为最低检测限（或该物质的最小检测量）。线性范围：

色谱定量分析要求检测器的响应信号与进样量之间成线性关系。检测器的线性范围定义为在检测器呈线性时，最大和最小进样量之比，这个比值越大，线性范围越宽，越有利于对大量组分或微量组分的准确定量。2023/2/22023/2/22.热导检测器（1）热导检测器的结构如图所示池体：一般用不锈钢制成。热敏元件：电阻率高、电阻温度系数大、且价廉易加工的钨丝制成。参考臂：仅允许纯载气通过，通常连接在进样装置之前。测量臂：需要携带被分离组分的载气流过，则连接在紧靠近分离柱出口处。2023/2/22023/2/2（2）检测原理

平衡电桥，右图。

不同的气体有不同的热导系数。

钨丝通电，加热与散热达到平衡后，两臂电阻值：

R参=R测;R1=R2

则：R参·R2=R测·R1

无电压信号输出；记录仪走直线（基线）。

进样后，载气携带试样组分流过测量臂而这时参考臂流过的仍是纯载气，使测量臂的温度改变，引起电阻的变化，测量臂和参考臂的电阻值不等，产生电阻差,R参≠R测

则：R参·R2≠R测·R1

这时电桥失去平衡，a、b两端存在着电位差，有电压信号输出。信号与组分浓度相关。记录仪记录下组分浓度随时间变化的峰状图形。2023/2/2（3）影响热导检测器灵敏度的因素①桥路电流I：

I，钨丝的温度，钨丝与池体之间的温差，有利于热传导，检测器灵敏度提高。检测器的响应值S∝I3，但稳定性下降，基线不稳。桥路电流太高时，还可能造成钨丝烧坏。②池体温度：池体温度与钨丝温度相差越大，越有利于热传导，检测器的灵敏度也就越高，但池体温度不能低于分离柱温度，以防止试样组分在检测器中冷凝。2023/2/2表1-3某些气体与蒸气的热导系数(λ)，单位：J/cm·℃·s③载气种类：载气与试样的热导系数相差越大，在检测器两臂中产生的温差和电阻差也就越大，检测灵敏度越高。载气的热导系数大，传热好，通过的桥路电流也可适当加大，则检测灵敏度进一步提高。氦气也具有较大的热导系数，但价格较高。2023/2/2

3.氢火焰离子化检测器（1）特点a.典型的质量型检测器，b.对有机化合物具有很高的灵敏度，c.无机气体、水、四氯化碳等含氢少或不含氢的物质灵敏度低或不响应。d.氢焰检测器结构简单、稳定性好、灵敏度高,响应迅速等特点。e.比热导检测器的灵敏度高出近3个数量级,检测下限可达10-12g/mL

。2023/2/2(2)氢火焰检测器的结构a.在发射极和收集极之间加有一定的直流电压（100～300V）构成一个外加电场。b.氢焰检测器需要用到三种气体：

N2：载气携带试样组分；H2：为燃气；空气：助燃气。使用时需要调整三者的比例关系，检测器灵敏度达到最佳。2023/2/2(3)氢火焰检测器的原理

a.当含有机物CnHm的载气由喷嘴喷出进入火焰时，在C层发生裂解反应产生自由基：CnHm──→·CHb.产生的自由基在D层火焰中与外面扩散进来的激发态原子氧或分子氧发生如下反应：·CH+O──→CHO++ec.生成的正离子CHO+与火焰中大量水分子碰撞而发生分子离子反应：CHO++H2O──→H3O++COA区：预热区B层：点燃火焰C层：热裂解区：温度最高D层：反应区2023/2/2氢焰检测器的原理

d.化学电离产生的正离子和电子在外加恒定直流电场的作用下分别向两极定向运动而产生微电流（约10-6～10-14A）；e.在一定范围内，微电流的大小与进入离子室的被测组分质量成正比，所以氢焰检测器是质量型检测器；f.组分在氢焰中的电离效率很低，大约五十万分之一的碳原子被电离；g.离子电流信号输出到记录仪，得到峰面积与组分质量成正比的色谱流出曲线。A区：预热区B层：点燃火焰C层：热裂解区：温度最高D层：反应区2023/2/2（4）影响氢火焰检测器灵敏度的因素

①各种气体流速和配比的选择：N2流速的选择主要考虑分离效能，N2H2=11～11.5氢气空气=110。②极化电压正常极化电压选择在100～300V范围内。2023/2/24.电子捕获检测器

高选择性检测器，仅对含有卤素、磷、硫、氧等元素的化合物有很高的灵敏度，检测下限10-14g/mL，

对大多数烃类没有响应。较多应用于农副产品、食品及环境中农药残留量的测定。2023/2/25.具有定性功能的检测器（联用技术）色谱-质谱；色谱-红外等。

质谱作为色谱的检测器使用需要解决四个问题:(1)色谱柱出口压力与质谱仪高真空之间的匹配；(2)试样组分与载气的分离；(3)质谱对色谱流出峰的快速测定(电子计算机解决)；(4)质谱仪的小型化（小型化的质量分析器）。2023/2/2第四章

色谱分析法第四节

色谱定性、定量分析方法一、色谱定性鉴定方法二、色谱定量分析方法2023/2/2一、色谱定性定量方法

色谱分析分为三个阶段：(1)仪器调试(2)操作条件选择(3)定性---保留值，定量---峰高,峰面积色谱法分离好,定性难色谱定性方法色谱定量分析2023/2/21.色谱定性方法

1.用已知物对照定性

保留时间和保留体积定性、比保留体积定性、相对保留值定性、加入已知物增加峰高定性，双柱定性2.利用文献的保留值数据定性3.利用保留值的经验规律定性

碳数规律、沸点规律2023/2/2利用保留时间和保留体积定性

在色谱固定相和操作条件一定时，试样的每种组分均有确定的色谱保留值，因而保留值是色谱定性的基本参数。即各组分的tR或vR可作为定性的指标。tR随载气流速的变化而变化，使用时要注意控制载气流速，而vR不受流速变化的影响。测定时只要在相同的操作条件下，分别测出已知物和未知样的保留值，比较二者的保留值是否相同，如相同，则两者为同一种物质。优点：简单缺点：要有纯样，适用于已知物，操作条件要稳定

示例2023/2/22023/2/2利用比保留体积定性

利用比保留体积定性，可不受柱长、柱内径、固定液含量和流速的影响。实验时，利用Vg进行比较定性,Tc为临界温度,VN为在绝对温度时测量的保留体积。

2023/2/2利用相对保留值定性

利用保留值定性，需要严格控制操作条件，否则重复性差。而用相对保留值定性，则可消除某些操作条件的影响。令某一组分为s，其它各组分以i表示，分别计算已知物各组分的ris和混合物各色谱峰的ris值后，通过比较对应的ris值，其值相同者为同一物质。优点：比绝对法重现性好缺点：也需要纯样，比绝对法麻烦2023/2/2利用加入已知物增加峰高定性

如果相邻两组分的峰间距太小，或操作条件不易控制稳定，因而不易测准保留值时,可采用增加峰高的方法定性。此法是将已知物加入试样中,如果由混合后得色谱图上的某组分峰高有所增加,则可以认为试样中含有所加入的这一物质。2023/2/2利用双柱定性

有时不同组分在同一根色谱柱上具有相同的保留值，例如１－丁烯与异丁烯在阿皮松硅油等非极性柱上具有相同的保留值，此时可采用双柱法定性，该法对于同系物的定性更有利。在一根柱子上保留值相同的化合物，在另一根柱上保留值不同，分别是当两根柱子极性差大时，保留值差别更大。因此，选择分离的两根柱子极性差应尽量大。如果用纯样品校对，也需在两根柱上观察标样峰与未知峰是否始终重合。2023/2/22.利用文献的保留值数据定性

在某些情况下，可利用文献发表的保留值来定性。通常用的有相对保留值和保留指数，只要能重现其要求的操作条件，这些定性数据还是可靠的。利用相对保留值定性的方法前面已介绍。保留指数Ix在许多文献上都可查到，它至今仍是柱保留值最有价值的表达形式。保留指数是把物质的保留行为用两个紧靠近它的标准物（一般是两个正构烷烃）来标定。并以均一标度来表示。在任何情况下，正构烷烃的保留指数，规定为其碳数乘以100。例如正己烷和正庚烷的保留指数分别为600和700，而其它物质的保留指数则需在色谱条件下以相邻的正构烷烃为参比物进行测定。2023/2/2某物质的保留指数按下式计算：

式中：t’R

为调整保留时间；x为被测物；z为具有z个碳原子的正构烷烃；z+1为具有z+1个碳原子的正构烷烃。利用上式求出未知物的保留指数，然后与文献数据对照，即可对未知物进行定性。确定方法：将碳原子数为Z和Z+1的正构烷烃加入样品X中进行分析，测得它们的调整保留时间，并要求：t´R（Z）<t´R（X）<t´R（Z+1），2023/2/2优点：测得Ix值与文献值对照就可定性。缺点：1.要有正构烷烃纯样。

2.可供查阅的文献值太少。

3．柱子与柱温要与文献规定相同2023/2/2例题：在某色谱条件下，文献报道，甲基乙基酮的IX为616，环己烷的IX为585，现有两种物质，为对其进行定性，按文献报道的色谱条件，测量了该组分以及几种正构烷烃的保留值，结果为：n-丁烷t´R=2.21min，n-戊烷t´R=4.10minn-己烷t´R=7.61min，n-庚烷t´R=14.08mint´R(A)=9.83mint´R(B)=8.4min试判断A、B是否为甲基乙基酮或环己烷。2023/2/2解：可见：B物质是甲基乙基酮A物质既不是甲基乙基酮，也不是环己烷2023/2/2碳数规律

当一个混合物中某几个组分缺乏纯物质，而且又无已知的保留数据时，可利用下面两个经验规律，通过作图求得保留值，从而对未知物进行定性。碳数规律是在一定的温度下，同系物的调整保留时间的对数与分子中的碳原子数n成正比（n=1、2时可能有偏差）：

式中：A1、c1是与固定液和被分析物质结构有关的经验常数。利用此经验规律定性时，先测出同系物中几个已知组分的调整保留时间，用这些调整保留时间与相应的碳原子数作图，根据该图求出同系物中其它组分的调整保留时间，再与相同条件下测得的未知峰的调整保留时间对照定性。碳数规律只适用于同系物，而不适用于同族化合物。

2023/2/2沸点规律

与碳数规律一样，同系物中比保留体积的对数与其沸点Tb成比例。同碳数的碳链异构物的比保留体积的对数与其沸点也有这种关系：式中A2、c2为经验常数。利用沸点规律时，先用几个能得到的同系物组分作出lgVg-Tb图，根据未知物的沸点，找出相应的lgVg值，与待测组分的峰对照定性。

2023/2/22.色谱定量分析

在一定的操作条件下，检测器的响应信号（色谱图上的峰面积或峰高）与进入检测器的组分i的重量或浓度成正比。即：或上式即为气相色谱定量分析的依据。显然要准确进行定量分析，必须要：（1）准确的测量峰面积Ai（2）求出定量校正因子fi（3）正确地选用定量计算方法2023/2/2一、峰面积的测量方法

峰面积测量的准确度直接影响定量结果。对于不同峰形的色谱峰必须采用不同的测量方法，才能取得较好的结果，常见的峰形主要有对称峰和不对称峰两类。峰面积的测量方法有

峰高乘半峰宽法近似测量法:

峰高乘平均峰宽法

峰高乘保留时间法

自动积分仪法真实测量法：

求积仪（或叫面积仪）2023/2/21.峰高乘半峰宽法该法是把对称色谱峰看作一个等腰三角形，根据等腰三角形面积的计算方法，可近似认为峰面积（A）等于峰高（h）与半峰宽（Y1/2）的乘积。这样测得的峰面积只有真实面积的0.94倍，实际峰面积应为：在作相对计算时，1.065可以略去，不影响测定结果。但在作绝对测量时，如测灵敏度，比表面积时，1.065就不能省略。此法简便，是一种最常用的近似方法。它主要用于对称峰。不对称峰不能应用，很窄和很小的峰的半峰宽测量误差很大。2023/2/22.峰高乘平均峰宽法对于不对称的色谱峰，可采用此法。所谓平均峰宽是指在峰高0.15和0.85处分别测峰宽，然后取其平均值，由此测得的峰面积为：

此法虽有测量上的麻烦，但结果还是比较准确。2023/2/23.峰高乘保留时间法

在一定的操作条件下，同系物的半峰宽与保留时间成正比，即：将Y1/2值代入前面式子中得：式中b为常数，在作相对测量时，1.065和b均可约去。此法简便、快速而准确，特别适用于窄峰和分离不到一半峰的峰面积测量。对含量相差悬殊的峰、非同系物的峰不适用。2023/2/24.自动积分仪法

自动积分仪可自动测出某一曲线所围成的面积，是最方便的一种测量工具。此法对不对称峰和对称峰都能快速和准确测量，其精密度可达0.2~2%。但测量较小峰时，误差较大。

5.求积仪（或叫面积仪）法求积仪法是用平动的方法测量峰面积，可准确到0.1cm2。方法的精密度随峰面积减小而降低，此时可以加大纸速，以增大峰面积，并重复多测几次，以降低测量相对误差。此法多用于不对称色谱峰。2023/2/2二、定量校正因子

色谱分析的定量依据是，在一定的操作条件下，进样量与峰面积成正比。但由于同一种检测器对不同物质有不同的灵敏度，故等量的不同物质通过检测器时，所产生的峰面积就不相等，因而不能直接用峰面积来计算物质的含量。为了使峰面积能真实地反映出物质的含量，就需用定量因子对峰面积进行校正。校正因子的表示法

校正因子的测量2023/2/21.校正因子的表示法

由式得

式中：fi为绝对校正因子，即单位峰面积所代表的物质量。fi主要由仪器的灵敏度来决定，既不容易测准也无法应用，但物质的相对响应值相同，所以在定量分析中都是用相对校正因子f/i，即为某物质与一标准物质s的绝对校正因子之比值。热导池检测器用苯作为标准物，氢火焰检测器用正庚烷作为标准物，由于被测物质使用的计量单位不同，校正因子又可分为：“重量校正因子”、“摩尔校正因子”、“体积校正因子”。（通常把相对二字略去）。相对响应值2023/2/2重量校正因子（）这是一种最重要的定量校正因子。式中：Ai、As、mi、ms分别为待测物和标准物的峰面积和重量。

2023/2/2摩尔校正因子（）即

式中：Mi、Ms分别为被测物和标准物的分子量。

2023/2/2体积校正因子（）

如果样品为气体也可以用体积校正因子，则体积校正因子就是摩尔校正因子，因为一摩尔任何物质在条件相同时的体积相同，比如一摩尔任何物质在标准状态下都是22.4升。

对于气体样品，用摩尔校正因子，可得体积百分数

2023/2/2相对响应值（）

相对响应值也叫相对应答值，是被测物质i和标准物质s的绝对响应值之比：

相对响应值与相对校正因子的关系是，当计量单位相同时就互为倒数，即：2023/2/22.校正因子的测量校正因子的测量方法是准确称量被测组分和标准物质，混均后在实验条件下进行分析，注意进样量应在检测器的线性范围之内。测量各峰面积，由和

计算重量校正因子、摩尔校正因子。如果几次测量数值接近，可取其平均值。校正因子除自己测定外，也可以引用文献上所发表的数据。2023/2/2三、定量方法

目前常用的定量方法主要有归一化法，内标法和外标法三种。这些定量方法各有其优缺点和适用范围，应根据实际情况，正确选用。归一化法内标法外标法2023/2/2归一化法当试样中所有组分都能流出色谱柱，且在检测器上都能产生信号时，可用此法计算组分含量。当测量参数为峰面积时，归一化的计算公式为：

式中f/i为几个组分中i组分的峰面积校正因子。如试样中各组分的校正因子很接近，则上式可简化为：2023/2/2当测量参数为峰高时，归一化法的计算公式为：

式中：fih为几个组分中i组分的峰高校正因子，须自行测定。测定方法与峰面积校正因子相同。

特点及要求：

归一化法简便、准确；进样量的准确性和操作条件的变动对测定结果影响不大；仅适用于试样中所有组分全出峰的情况。2023/2/2内标法

当混合物中所有组分不能全部流出色谱柱，或检测器不能对各组分都产生信号，或只需测定混合物中某几个组分时，可采用此法定量。内标法就是准确称取样品量，加入一定量的某种物质作内标物，根据被测物和内标物的重量及其色谱图上响应的峰面积比求出被测物组分的含量。(以固定的浓度加入标准溶液和样品溶液中的作用：以抵消实验条件和进样量变化带来的误差)

一般常以内标物作为基准，则f，s=1。2023/2/2对内标法的讨论内标法的要求是，当选择一个适宜的内标（样品中不存在的）和分离条件，使内标和其它组分完全分离；内标峰和被测峰要靠近；加入内标的量要接近被测组分含量，称样时要准确称取。内标法的优点：定量准确，限制条件少。内标法的缺点：每次分析都要准确称量，不适于快速控制分析。2023/2/2外标法外标法又称已知样校正法或标准曲线法。其方法是先用纯物质配成不同含量的标样，然后在一定的操作条件下，分别取一定体积的标样，注入色谱仪，得到色谱图，测出峰面积（或峰高），作出峰面积（或峰高）对含量的标准曲线。当试样中被测组分浓度变化不大时，例如工厂里控制分析的试样，对这样的试样可不必做标准曲线，而用单点校正法来分析。外标法的优点：操作简单，计算方便，不必用校正因子，不必加内标物。缺点是进样量的重复性要好，操作条件要稳定，否则对结果的准确性影响较大。2023/2/2标准曲线

分析时，注入同样体积的分析试样，根据所得峰面积，由标准曲线上查出其百分含量。2023/2/2举例1.用气相色谱法分析二甲苯氧化母液中间二甲苯含量，称取样品0.1250g，加入正壬烷内标0.06258g，间二甲苯的校正因子为0.96，正壬烷校正因子为1.02，间二甲苯的峰面积为3.5cm2，正壬烷峰面积为12cm2。求样品中间二甲苯的百分含量。解：根据内标法计算公式，间二甲苯的百分含量χi为

χi(%)=msAifi，/Asfs，m×100%=(0.0625×3.5×0.96)/(0.1250×12×1.02)×100%=13.73%2023/2/22.分析试样中邻二甲苯、对二甲苯和间二甲苯三个组分，对其他组分不进行定量分析，若选用甲苯为内标物，称取试样质量为0.4385g，甲苯质量为0.0530g，相对校正因子及各组分色谱峰面积如下：计算邻二甲苯、对二甲苯和间二甲苯三个组分的质量分数解：

Pi%=mi/m×100%=Aifi，ms/ASfs，m×100%计算得到m邻二甲苯％=39.6％；m对二甲苯％=24.8％；m间二甲苯％=10.2％组分邻二甲苯对二甲苯间二甲苯甲苯f，A0.873.581.411.381.170.6831.000.952023/2/2第四章

高效液相色谱法一、高效液相色谱法的特点二、流程及主要部件三、流动相的选择四、高效液相色谱法的应用2023/2/2液相色谱是以液体为流动相的色谱分析方法。英文缩写：LC。按其固定相的不同，又可分为液固色谱（LSC）和液液色谱（LLC）液相色谱简介2023/2/2气相色谱只适合分析较易挥发、且化学性质稳定的有机化合物，而HPLC则适合于分析那些用气相色谱难以分析的物质，如挥发性差、极性强、具有生物活性、热稳定性差的物质。现在，HPLC的应用范围已经远远超过气相色谱，位居色谱法之首。在所有色谱技术中，液相色谱法是最早（1903年）发明的，但其初期发展较慢，在液相色谱普及之前，纸色谱法、气相色谱法和薄层色谱法是色谱分析法的主流。到了20世纪60年代后期，将已经发展得比较成熟的气相色谱的理论与技术应用到液相色谱上来，使液相色谱得到了迅速的发展。特别是填料制备技术、检测技术和高压输液泵性能的不断改进，使液相色谱分析实现了高效化和高速化。具有这些优良性能的液相色谱仪于1969年商品化。从此，这种分离效率高、分析速度快的液相色谱就被称为高效液相色谱法（highperformanceliquidchromatography，HPLC），也称高压液相色谱法或高速液相色谱法。

液相色谱的发展2023/2/2液相色谱的分类

广义地讲，固定相为平面状的纸色谱法和薄层色谱法也是以液体为流动相，也应归于液相色谱法。不过通常所说的液相色谱法仅指所用固定相为柱型的柱液相色谱法。

通常将液相色谱法按分离机理分成吸附色谱法、分配色谱法、离子色谱法和凝胶色谱法四大类。2023/2/2

类型主要分离机理主要分析对象或应用领域吸附色谱吸附能，氢键异构体分离、族分离，制备分配色谱疏水分配作用各种有机化合物的分离、分析与制备凝胶色谱溶质分子大小高分子分离，分子量及其分布的测定离子交换色谱库仑力无机离子、有机离子分析离子排斥色谱Donnan膜平衡有机酸、氨基酸、醇、醛分析离子对色谱疏水分配作用离子性物质分析疏水作用色谱疏水分配作用蛋白质分离与纯化手性色谱立体效应手性异构体分离，药物纯化亲和色谱生化特异亲和力蛋白、酶、抗体分离，生物和医药分析表5－1液相色谱分类返回2023/2/2一、高效液相色谱法的特点

特点：高压、高效、高速高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。2023/2/2二、流程及主要部件1.流程2023/2/22.主要部件(1)高压输液泵主要部件之一，压力：15～35×106Pa。为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱的特点之一。应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性2023/2/2选择流动相时应注意的几个问题（1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。（2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。（3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。（4）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。返回2023/2/2

应用领域分析对象举例环境常见无机阴阳离子、多环芳烃、多氯联苯、硝基化合物、有害重金属及其形态、除草剂、农药、酸沉降成分。农业土壤矿物成分、肥料、饲料添加剂、茶叶等农产品中无机和有机成分。化工无机化工产品、合成高分子化合物、表面活性剂、洗涤剂成分、化妆品、染料。食品无机阴阳离子、有机酸、氨基酸、糖、维生素、脂肪酸、香料、甜味剂、防腐剂、人工色素、病原微生物、霉菌毒素、多核芳烃。生物氨基酸、多肽、蛋白质、核糖核酸、生物胺、多糖、酶、天然高分子化合物。医药人体化学成分、各类合成药物成分、各种天然植物和动物药物化学成分。返回液相色谱的应用2023/2/2§五高效液相色谱分析高效液相色谱法的出现、仪器及特点

高效液相色谱仪器结构

高效液相色谱基本原理

高效液相色谱固定相和流动相

高效液相色谱梯度洗脱技术

高效液相色谱类型简介

2023/2/2高效液相色谱法的出现由于气相色谱只能分析M<1000、低沸点、易挥发、热稳定性好的组分；对于M>1000、高沸点、难挥发、热稳定差的样品就无能为力了，随着工业生产的需要，高效液相色谱的研究成为一个迫切课题。液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相，称为经典液相色谱法，此方法柱效低、时间长（常有几个小时）。在经典液相色谱法的基础上，于60年代后期，气相色谱理论迅速发展以及高压泵的研制成功，为高效液相色谱的发展奠定了基础，高效液相色谱又称高压液相色谱法(HPLC)，也称现代液相色谱。Stein和Moore获得了1972年的诺贝尔化学奖（研制出氨基酸分析仪）返回2023/2/2高效液相色谱法的特点与经典液相色谱比较（四高）

：高压：压力可达150~300Kg/cm2。高速：流速为0.1~10.0mL/min。高效：可达5000块塔板/米。在一根柱中同时分离成份可达100种。高灵敏度：紫外检测器灵敏度可达0.01ng(1ng=109g)。同时消耗样品少。如用Lichrosorb－ODS色谱柱，采用梯度洗脱，可在不到0.5h内分离出尿中104个组分.2023/2/2与气相色谱相比

高沸点、热不稳定有机化合物及生化试样的高效分离分析方法。（l)气相色谱法分析对象只限于分析气体和沸点较低的化合物，它们仅占有机物总数的20％。对于占有机物总数近80％的那些高沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质，目前主要采用高效液相色谱法进行分离和分析。

(2)气相色谱采用流动相是惰性气体，它对组分没有亲和力，即不产生相互作用力，仅起运载作用。而高效液相色谱法中流动相可选用不同极性的液体，选择余地大，它对组分可产生一定亲和力，并参与固定相对组分作用的剧烈竞争。因此，流动相对分离起很大作用，相当于增加了一个控制和改进分离条件的参数，这为选择最佳分离条件提供了极大方便。

（3）气相色谱一般都在较高温度下进行的，而高效液相色谱法则经常可在室温条件下工作。2023/2/2§5-2高效液相色谱仪器结构

色谱仪器的流程由液体流动相的输液系统、进样系统、分离系统、检测系统、信号放大记录系统组成，其中高压泵、色谱柱和检测系统是高效液相色谱的主要部件。

返回2023/2/2输液系统包括流动相储液瓶、过滤器、脱气装置、高压泵、压力脉动阻尼器、梯度洗脱装置等部件组成

返回2023/2/2脱气装置

脱气就是驱除溶解在溶剂中的气体。(1)脱气是为了防止流动相从高压柱内流出时，释放出气泡。这些气泡进入检测器后会使噪声剧增，甚至不能正常检测。(2)溶解氧会与某些流动相与固定相作用，破坏它们的正常功能。对水及极性溶剂的脱气尤为重要，因为氧在其中的溶解度较大。

常用的脱气方法有：低压脱气法：电磁搅拌、水泵抽空，可同时加温或向溶剂吹氮。由于抽空或加热过程中可能引起流动相中低沸点溶剂的挥发而影响其组成，此法不适于二元以上溶剂组成的流动相脱气。吹氦脱气法：氦气经由一圆筒过滤器通入冲洗剂中，在0.5公斤／厘米压力下保持10~15分钟，氦气的小气泡可将溶于流动相中的空气带出，此法简单方便，适用于所有冲洗剂脱气，但由于氦气价格昂贵，在国内尚难于普及。超声波脱气法：将溶剂储液瓶置于超声波清洗槽中，以水为介质超声脱气。一般500ml溶剂约需超声20~30min即可达到驱气目的。此法方便，不影响溶剂组成，并适用于各种溶剂，目前国内使用较为普遍。返回2023/2/2高压泵

目前高效液相色谱使用的高压泵分为恒压和恒流泵，恒流泵使输出的液体流量稳定，而恒压泵则使输出的液体压力稳定。恒流泵中有往复泵、累积型往复泵、注射泵，恒压泵有气动放大泵。各种高压泵均具有以下性能：(1)泵体材料能耐化学腐蚀。通常使用普通耐酸不锈钢或优质耐酸不锈钢。(2)能在高压下连续上作。通常要求耐压40~50MPa·cm-2，能在8~24h连续上作，压力平稳。(3)输出流量范围宽。一般在0.01~10mL/min。(4)输出流量稳定可调。高效液相色谱使用的检测器，大多数对流量变化敏感，高压输液泵应提供无脉冲流量。这样可以降低基线噪声并获较好的检测下限，流量控制的精密度应小于1％，最好为0.5％，重复性最好为0.5％。返回2023/2/2往复泵往复泵有两类，一种是活塞式，另一种是隔膜式

形成脉冲式供液

返回2023/2/2累积型往复泵

累积型往复泵有两个泵头，以串联方式连接在一起，这样可以提供平稳的液流。所以如此是因为两级泵腔排液体积不同，第一级泵腔是第二级泵控的一倍1-高压流动相出口；2-二级活塞；3-一级活塞；4-流动相

返回2023/2/2注射泵

注射泵类似于注射器，用一台步进电机驱动注射泵的活塞把液流从泵腔中挤出．泵腔体积较大(250~500mL)，密封性好的活塞把泵腔中的液体等速流出.

1-电机；2-涡轮；3-螺旋；4-螺杆；5-活塞；6-至色谱柱返回2023/2/2气动放大泵

气动放大泵是利用气体为动力源。适合于液相色谱柱的装填，近代的液相色谱仪不用这种泵。

1-接色谱柱；2-流动相入口；3-高压气入口；4-气体放空

返回2023/2/2梯度洗脱装置外梯度:将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入混合室，用高压输液泵混合液输入色谱柱。2023/2/2内梯度:一台高压泵,通过比例调节阀，将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。2023/2/2进样系统通常使用耐高压的六通阀进样装置和自动进样系统。分部分进样和整体进样。返回2023/2/2分离系统-色谱柱柱材料及规格柱连接方式柱温控制柱填充技术返回2023/2/2柱材料及规格

柱体为直型不锈钢管，内径1～6mm，柱长10～50cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径提高柱效。采用直形柱管，标准填充柱柱管内径为4.6mm或3.9mm，长10~50cm，填料粒度5~10μm时，柱效达5000~10000块/m理论塔板数。返回2023/2/2柱连接方式

柱接头通过过滤片与色谱柱管连接。在色谱柱管的上下两端要安装过滤片，过滤片一般用多孔不锈钢烧结材料，此烧结片上的孔径小于填料颗粒直径，却可让流动相顺利通过，并可阻挡流动相中的极小的机械杂质以保护色谱柱。

返回2023/2/2柱温控制以下几种情况需精确控制柱温：（1）在一些法定标准分析方法中，要求保留时间具有再现性。（2）必须通过改变柱温来提高分离效率。（3）对高分子化合物或粘度大的样品，柱温必须高于室温。（4）具有生物活性的生物分子，要求分析时柱温应低于室温。（5）对某些组成复杂的样品，在单一色谱柱不能实现完全分离，需要使用二维色谱技术，利用柱切换，使两根色谱柱在不同柱温下操作，以实现多组分的完全分离。返回2023/2/2柱填充技术

填充色谱柱的方法，根据固定相微粒的大小有干法和湿法两种。微粒大于20μm的可用干法填充，要边填充边敲打和震动，要填得均匀扎实。直径10μm以下的微粒，不能用干法填充，必须采用湿法。干法装柱与气相色谱法相似。湿法装柱又称等密度匀桨装填法。

返回2023/2/2湿法装柱常用对二氧六环和四氯化碳，或叫氯乙烯和四溴乙烷等溶剂，根据固定相的密度不同，采用不同的溶剂比例，配成密度与固定相相似的混合液为匀浆剂。

1-顶替液槽；2-高压泵；3-压力表；4-三通阀；5-匀浆罐；6-色谱柱；7-废液槽返回2023/2/2检测系统

高效液相色谱检测器按适用性分为选择性检测器和通用型检测器。

紫外和紫外-可见分光光度检测器示差折光检测器荧光检测器

电化学检测器

返回2023/2/2紫外和紫外-可见分光光度检测器

检测原理：紫外及紫外—可见光吸收光度检测器相当于一台吸收光度计，在高效液相色谱仪的流通池内样品的浓度与吸光度的关系遵循Beer定律：A=log(I0/I)=εbc式中：A为吸光度，I0为入射光强度，I为透射光强度，ε是样品的摩尔吸光度，b为流通池的光程长度，c为样品浓度。

2023/2/2示差折光检测器

检测器原理：示差折光检测器是通过连续监测流动相的折光指数变化来测定样品的浓度。各种物质都具有不同的折射率,溶液的折射率是溶剂(洗脱剂)和溶质(待测组分)各自的折射率乘以各自的摩尔浓度之和。设溶液的折射率为n，则:式中c1和c2为溶剂和溶质的摩尔分数，c1+c2=1；n1和n2为溶剂和溶质的折光指数。2023/2/2

荧光检测器

检测原理：当某些溶液受紫外光照射后，能吸收紫外光线而处于不稳定的激发状态，紧接着辐射出比紫外光波更长的光线，即荧光。在被测溶质浓度较低时，溶质受激发而发生的荧光强度与被测溶质的浓度成正比关系。2023/2/2仪器结构

高灵敏度、高选择性；对多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应；返回2023/2/2电化学检测器

电化学检测器是根据电化学分析方法而设计的检测器。主要有两种类型：一种是根据溶液的导电性质，通过测定流经检测器的离子溶液电导率的大小来测量离子浓度，此类检测器是高效离子色谱采用的主要检测器；另一类是根据化合物在电解池中工作电极上发生的氧化-还原反应，通过测量电位、电流和电量来确定化合物在溶液中的浓度。

返回2023/2/2§5-3高效液相色谱基本原理表征液相色谱柱填充性能的重要参数

总孔率、柱压力降和柱渗透率高效液相色谱塔板理论高效液相色谱的速率理论返回2023/2/2总孔率式中：F—流动相的体积流速，cm3／s；

u—流动相的平均线速，cm/s;r一柱内径的半径，cm;tM—柱的死时间；

L—柱长，cm；

V—色谱柱的空体积，cm3。

εT表达了色谱柱填料的多孔性能，当使用全多孔硅胶固定相时，εT约为0.85，使用非多孔的玻璃微珠(或硅胶)固定相时，εT约为0.40，可认为是柱中颗粒之间的孔率，用ε表示。返回2023/2/2柱压力降式中η一流动相的粘度，MPa·s;k0—色谱柱的比渗透系数；

dp—固定相颗较直径，µm；

φ—色谱柱的阻抗因子；

P1、P0—色谱柱的入口压力和出口压力，MPa。

返回2023/2/2柱渗透率柱渗透率KF

：表示流动相通过柱子的难易程度。在高效液相色谱法中，由于使用液体流动相，其粘度大于气体流动相，且固定相粒度又小，为保证柱子在较低压力下正常操作，总希望柱渗透率要大。

返回2023/2/2高效液相色谱的速率理论其中：Cd为填充系数，为一常数；Cm是容量因子k的函数，为一常数，其值取决于柱直径、形状和填充状况，当柱填充均匀紧密时，其值下降；Csm是与固定相颗粒微孔中被流动相所占据部分的分数以及容量因子k有关，为一常数；Cs是与容量因子k有关的常数；Dm为组分在流动相中的扩散系数，比气相扩散系数小4~5个数量级；Ds为组分分子在固定液内的扩散系数；返回2023/2/2§5-4高效液相色谱流动相

一、液相色谱的流动相流动相特性流动相类别流动相选