免疫胶体金银技术

第六章免疫金银及铁标记技术免疫金技术发展简史1971年胶体金应用于免疫组化1978年免疫金技术检测B淋巴细胞表面抗原1981年免疫金银法1986年彩色免疫金银法免疫胶体金银技术

一、免疫金技术二、免疫金银法三、彩色免疫金银法四、免疫金和免疫金银法的优点五、免疫金银法染色中常见的问题及对策六、免疫胶体铁技术一、免疫金技术胶体金：金的水溶液，具有一般溶胶特性。胶体金制备：化学还原法；在一定浓度的金溶液中加入一定量的还原剂使金离子变成金原子（氯金酸在还原剂作用下，聚合成一定大小的金颗粒，形成带负电的疏水胶溶液。由于静电作用而成为稳定的胶体状态）。胶体金颜色：用还原法可以方便地从氯金酸制备各种不同粒径、也就是不同颜色的胶体金颗粒。5-20nm葡萄酒红20-40nm深红色60nm橙黄色还原剂：白磷、乙醇、过氧化氢、枸橼酸钠、鞣酸等胶体金标记：实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。胶体金颗粒与蛋白质因静电吸附而形成牢固结合。此外，还可与葡萄球菌Ａ蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血清白蛋白多肽缀合物等非共价结合。

(2)试剂

容器:酸处理洗净配制试剂:双蒸馏水或三蒸馏水氯化金水溶液的配制：1g的氯化金溶解于双蒸水中配成l％的水溶液；4℃冰箱内保存。白磷配制：在双蒸水中切块，吸干水分；放入乙醚至溶解，棕色瓶密闭保存

不需硅化处理可直接制备胶体金。为了减少了金颗粒的吸附作用，也可用已制备的同等大小颗粒的胶体金溶液包被玻璃器皿表面，弃去，再用双蒸水洗净。流水冲洗；清洁液浸泡24h；自来水洗净清洁液；洗洁剂洗3～4次；自来水冲洗；蒸馏水洗3～4次；双蒸水把每个器皿洗3～4次；烤箱干燥后备用。1制备胶体金的准备（1）玻璃器皿的清洁2胶体金的制备白磷还原法、抗坏血酸还原法、柠檬酸三钠还原法、柠檬酸钠—鞣酸还原法、乙醇超声波还原法、硼氢化钠还原法、放射性胶体金制备法常用的方法:2种(1)柠檬酸三钠还原法制备程序很简单，胶体金的颗粒大小较一致，广为采用。制备胶体金时金颗粒的大小与柠檬酸三钠用量成反比。操作步骤：1）1mll％氯化金加入100ml蒸馏水中，煮沸。2）迅速加入4mll％柠檬酸钠，保持沸腾状态，搅动至出现透明的橙红色。3）自来水冲洗烧瓶，冷却。(2)柠檬酸钠—鞣酸还原法特点：通过改变鞣酸的用量制备出多种颗粒直径的胶体金，且颗粒的直径均匀一致，适合于双标及多标研究。

操作步骤：1）根据所需的胶体金颗粒分别配制A液和B液。2）将配制好的A、B两液在水浴内加热到60℃，保持温度稳定。3）在电磁搅拌器上搅拌A液迅速加入B液，加热7～10min至胶体金变成葡萄酒色。4)用自来水冲洗烧瓶，使之迅速冷却。原理：柠檬酸三钠——主要为还原剂。鞣酸——还原、保护作用，决定胶体金颗粒大小形成。

制备胶体金时都应注意以下各点：①所有溶液均应用双蒸水配制②柠檬酸钠与鞣酸溶液应现用现配③用于制备胶体金的烧瓶硅化需处理④在清洁干燥的烧瓶中加入少许1％硅油，轻轻转动烧瓶，使硅油均匀铺展于烧瓶内壁，倾出多余硅油。烧瓶置烤箱内烘干。

上述步骤可重复2～3次3蛋白质的胶体金标记

原理：

PH值等于或稍偏碱性的蛋白质等电点时，蛋白质呈中性，此时蛋白质分子与胶体金颗粒相互间的静电作用较小，但蛋白质表面张力最大，处于微弱的水化状态，能牢固吸附于金颗粒表面，形成蛋白层，阻止胶体金颗粒相互接触，而使胶体金处于稳定状态；PH值高于蛋白质等电点时，蛋白质带负电荷，与胶体金颗粒负电荷相互排斥不能结合。稳定剂：牛血清白蛋白、卵白蛋白、聚乙二醇、明胶（1）待标记蛋白质准备透析除盐除去蛋白质内多余电解质，过高的盐类物质会降低胶体金颗粒的电位，影响蛋白质吸附。方法:蛋白质置于透析袋直接放入双蒸水或极低浓度盐水透析去除蛋白沉淀低温保存的蛋白质或抗体易形成聚合物，聚合物对标记过程及免疫金探针的稳定性有影响，标记前离心除去聚合物。待标记蛋白质最适稳定量的测定光电比色法、目测法（2）胶体金PH值调整标记前将胶体金溶液的PH值调至待标记蛋白质的等电点略偏碱（3）蛋白质的胶体金标记

（1）根据标记胶体金的总量计算所需待标记蛋白质的总量。（2）在电磁搅拌下，将蛋白质溶液加入胶体金溶液中（pH已调至PI超过0.5pH），逐滴加入蛋白质，1mg的蛋白质大约5min加完。（3）加入5%的牛血清白蛋白使其终浓度为1%，或加入3%聚乙二醇使其终浓度为0.05%,前者稳定胶体金的效果好于后者。（4）将标记好的胶体金装入透析袋，扎紧，放入蔗糖或硅胶中浓缩到原体积的1/10量，后纯化。离心法纯化时，不要浓缩。（4）胶体金标记蛋白质的纯化目的：除去未标记蛋白、未标价胶体金、聚合物。方法：高速与超速离心法、凝胶过滤法

1）高速与超速离心法1）将标记的大于10nm的胶体金溶液高速离心机离心15min，吸上清，弃沉淀，去除大的聚合物。2）小于10nm颗粒的胶体金用超速离心机离心，在4℃离心1h左右，弃上清，将沉淀以TBS溶解，重复离心2～3次，沉淀溶于TBS中。4℃保存备用。

为了得到颗粒均匀一致的免疫金试剂，上述粗提制剂可用10-30%蔗糖或甘油溶液作密度梯度离心，分带收集。

2)凝胶过滤法

特点：简便，颗粒比较均匀，不易凝集，克服了离心方法胶体金颗粒易凝集的弱点。必须用牛血清白蛋白作稳定剂。操作过程：1）浓缩的胶体金离心取上清2）加样体积为柱状体积的1/103)丙烯葡萄糖S-400装柱，TBS平衡层析柱4）TBS洗脱，注意颜色变化。（5）免疫金染色法1978年，首次应用免疫金探针检测B淋巴细胞表面抗原，建立了用于光镜水平的免疫金法（IGS）。特点：染色程序简便，不要显色;能检测细胞表面和细胞内抗原。要求:金颗粒的直径大于20nm，且浓度较高。一般都采用间接法。（1）石蜡切片→脱蜡至水。（2）胰蛋白酶消化或尿素消化。（3）用双蒸水振洗5＇×2。（4）用0.02mol/lTBSpH8.2振洗10＇×2。（5）1%卵蛋白（EA）封闭10min。（6）稀释鼠抗HBsAg单克隆抗体（TBS），4℃过夜。（7）0.02mol/lTBSpH8.2振洗10＇×2。（8）1%EA封闭10min。

IGS的步骤（人肝组织HBsAg的定位为例)：（9）TBS稀释兔抗鼠金标抗体。（10）TBS振洗.（11）双蒸水振洗5＇×2。（12）1%戊二醛，10min。（13）双蒸水5min。（14）用苏木素衬染核，甘油封片。结果：光镜下部分肝细胞浆内有金颗粒聚集呈红色，表明有HBsAg定位在细胞浆内。(6)蛋白A-金（PAG）放大法在IGS方法定位细胞抗原时可用搭桥法，使IGS得到放大.

抗A蛋白抗体作桥的PAG放大法(以5-羟色胺定位为例):（1）石蜡切片→脱蜡至水。（2）胰蛋白酶消化或尿素消化。（3）TBS洗5＇×2。（4）1%EA封闭组织。（5）用TBS稀释兔抗5-羟色胺抗体,4℃过夜，或者37℃1h。（6）TBS振洗5＇×2。（7）1%EA封闭10min。（8）用0.05mol/lpH7.4TBS稀释PAG.（9）0.05mol/lpH7.4TBS振洗10＇×2。（10）1%EA封闭10min。（11）抗A蛋白抗体（1：100）37℃45min。（12）0.05mol/lpH7.4tbs振洗10‘×2。（13）加0.05mol/lpH7.4TBS稀释PAG（1：40）。（14）0.05mol/lpH7.4TBS振洗10＇×2。（15）双蒸水振洗5min。（16）1%戊二醛10min。（17）双蒸水振洗5min。（18）0.01%伊文思蓝2min，甘油封片。结果：光镜下观察，小肠粘膜内含有嗜银颗粒的细胞胞浆呈红色，阳性颗粒位于细胞核底部，比单纯用PAG染色深度得到加深，阳性结果得到放大。原理：抗A蛋白抗体Fab段、Fc段均可与PAG上的A蛋白结合，因此，聚集更多的胶体金颗粒。PAG放大法的优点：①使用试剂单一；②敏感性高；③背景干净。

二、免疫金银法（IGSS）原理:将1GS与银显影方法相结合,沉积在抗原位置的胶体金颗粒起着催化剂的作用，使显影液中的银离子在还原剂(对苯二酚)存在的情况下被还原为银原子，在金颗粒周围形成一个“银壳”，由于金颗粒的液化作用，使更多的银离子被还原，“银壳”增大，最后使抗原位置得以放大。1硝酸银显影液的配制

(1)10％明胶液+枸橼酸缓冲液+对苯二酚+蒸馏水，混合，磁力搅拌均匀(注意避光)，用前加入硝酸银水溶液(2)Ph3.5枸橼酸缓冲液：枸橼酸+枸橼酸三钠+双蒸水2操作步骤(1)组织固定后，5％、10％和20％系列浓度的蔗糖处理，制作冰冻切片，厚10～30gm；(2)含l％正常羊血清或1％BSA的PBS室温孵育20分钟，封闭抗体非特异性结合部位；(3)含1％氢硼化钠的PBS孵育20分钟；(4)第一抗体孵育，可先置4度，12～18小时，然后室温1小时，使抗体充分渗透并结合；

(5)PBS漂洗3次，每次5分钟；

(6)0.1％BSA／PBS液(pH8．2)漂洗5分钟，为胶体金结合提供碱性环境；

(7)胶体金标记的第二抗体(pH8.2)室温孵育30～45分钟，摸索最佳稀释(8)硝酸银液避光处理2—10分钟，显影时间最好根据实验结果确定；

(9)解剖显微镜下选取免疫反应阳性部位。1％Os04后固定30分钟，双蒸水漂洗；

(10)组织标本的脱水、树脂包埋、超薄切片制作及电镜观察等方法同前述。结果：光镜下见阳性黑色状颗粒，背景干净。5nmSPA胶体金电镜观察

SPA胶体金标记I型单纯疱疹病毒(HSV-1)抗原免疫电镜

人胚肺细胞细胞膜结构完整，细胞浆中病毒囊膜及其邻近的内质网膜上的病毒抗原结合，在未成熟的病毒囊膜上也有大量的金颗粒，他们的外周区域可见大量的金颗粒聚集

三、彩色免疫金银法（CIGSS）

基本原理：是在IGSS基础上发展起来的新方法，与彩色显影相似。IGSS方法染色在抗原位点处生成银颗粒被氧化成溴化银，后者被彩色显影剂还原成金属银，而彩色显影剂本身则被氧化，其产物变成有色的染料沉积在银颗粒的部位。由于染料只能通过彩色显影剂沉积在有银的部位，所以不与组织发生非特异性吸附。

1操作步骤

(1)石蜡切片常规脱蜡至水后，依次用胰蛋白酶，Lugol’s碘液，硫代硫酸钠处理，TBS漂洗。(2)1％卵蛋白10min。(3)适当稀释的特异性抗体，37℃孵育或4℃过夜。(4)TBS漂洗后，与1％卵蛋白作用10min。(5)适当稀释的金标二抗，37℃lh。(6)TBS漂洗5min；双蒸水漂洗5min。(7)物理显影。(8)自来水冲洗后，双蒸水漂洗5min。(9)2％铁氰化钾和1％溴化钾作用Imin，双蒸水漂洗。(10)彩色显影液显影，双蒸水漂洗。(11)依次加入2％铁氰化钾和1％溴化钾溶液作用lmin。(12)2％硫代硫酸钠和1％弧硫酸钠溶液作用5min。(13)自来水冲洗后，缓冲甘油封片。阳性物质呈蓝色(α-萘酚为成色剂)或绿色(菲尼酮为成色剂)四、免疫金法和免疫金银法的优点：①制备简单；②标记简单：抗体、凝集素、酶、SPA、激素等易通过物理吸附作用与胶体金颗粒相结合形成稳定的金标复合物。标记过程不需要任何化学方法交联，抗体的生物活性可保持不变，标记过程容易；③适用范围：光镜、荧光显微镜、透射电镜、扫描电镜、X线能谱分析;④特异性强：免疫金探针的非特异性吸附作用小，较少受生物组织背景因素影响；⑤敏感性高：金颗粒电子密度大—适合电镜，检测率远远超过酶反应物，提高分辨率金颗粒经过银显影后得到放的，检测抗原的敏感性比PAP高200倍适合检测石蜡切片标本中的微弱抗原五、免疫金银法染色中常见的问题及对策（一）背景染色产生的原因1一抗或金标抗体浓度过高，降低其浓度2使用正常血清封闭和在抗体稀释液中加入BSA，可减少非特异吸附；3显色器皿必须彻底清洗，化学试剂须用三蒸水配置；4乳酸银和硝酸银的显色在避光环境，醋酸银则在有光的环境中显色；5显色时切片应垂直放置在银显影液中；6控制反应时间，显影液中加入适量的阿拉伯胶或明胶可延缓反应速度，避免过度的还原银非特异吸附在切片上。25℃10-15分，《20℃20-30分7洗涤：使用TBS时最好加入TritonX或Tween80，可洗脱非特异吸附的污染蛋白质（二）背景染色已发生如何消除12%硫代硫酸钠、1%铁氰化钾对半混合，加在切片上至背景无色为止；22%铁氰化钾、1%溴化钾混合作用1min水冲洗，然后加2%硫代硫酸钠和1%亚硫酸钠脱色，至背景干净为止；30.1%重铬酸钾加入0.25%浓硫酸，在显微镜下控制脱色时间，至阳性结果清楚，无背景止。然后用5%硫代硫酸钠漂白。4用0.3-1%的H2O2处理切片可消除背景的银颗粒。（三）彩色显影背景过的处理方法1纯酒精滴到切片上3-5s，立即冲掉，水洗彻底，否则造成阳性结果脱色；275%酒精滴到切片上1min,立即冲掉；

六、免疫胶体铁技术

胶体铁阳离子胶体，普鲁士蓝反应成色，颗粒有一定大小及电子密度；1946-1986年：光镜及电镜定位组织中的阴离子部位1989年：抗体分子上标记胶体铁（日本），将胶体铁引入免疫细胞化学技术中国杨守京对胶体铁的制备及标记物纯化等方面进行改进，用于流行性出血热病毒检测

免疫胶体铁技术的优点：该方法具有较高的特异性与敏感性，背景染色干净。

（一）胶体铁的制备通过FeCl3的煮沸完成1946年--FeCl3直接煮沸法1951年--FeCl3溶于甘氨酸和氨水的混合液中1983年--FeCl3倒入煮沸的二甲砷酸钠溶液或FeCl3与二甲砷酸钠溶液一起煮沸1986年--水合联胺-二甲砷酸-FeCl3煮沸法也可用二甲砷酸代替二甲砷酸钠具体步骤：

二甲砷酸钠溶液+浓盐酸+水合联胺+FeCl3将混合物加热煮沸至变成深棕色的胶体砷酸铁，室温冷却再以二倍体积的二甲砷酸钠缓冲液稀释即可标记该法制备的铁胶体呈深棕红色，颗粒1nm左右，pH4-8稳定，4℃贮存备用。

（二）抗体的标记和纯化胶体铁在pH7.4时通过离子键与抗体IgG（PI6.8-7.3）结合而不影