核磁共振氢谱测定羟丙基-倍他-环糊精的平均取代度

核磁共振氢谱测定羟丙基-倍他-环糊精的平均取代度摘要】目的建立测定无对照品或者指示剂的羟丙基-倍他-环糊精的平均取代度的快速、专属、简单的核磁共振氢谱方法。方法BrukerAVANCEIII600MHz核磁共振谱仪，在25°C、以重水为溶剂、观测频率600.137MHz、谱宽：4200Hz、90度脉冲宽度10.06“、脉冲延迟时间1s、采样时间3s、高斯增宽因子0、线增宽因子0.2和采样次数64次的条件下采集试样的氢谱。结果分别对5.3-4.85ppm（葡萄糖环上的氢）和1.2-1.0ppm（羟丙基上的甲基氢）的积分面积比，测定的重复性实验的RSD为0.08%（n=6）。结论分析结果表明，在没有对照品或者指示剂的情况下，核磁共振氢谱法，可以用于羟丙基-倍他-环糊精的平均取代度的测定和质量控制。【关键词】核磁共振羟丙基-倍他-环糊精取代度【中图分类号】R965【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2013）31-0087-021引言环糊精（cyclodextrin,CD）是由数个D-吡喃葡萄糖构成的环状低聚糖，环糊精的最显著的特征是具有一个腔外亲水、腔内疏水并且具有一定尺寸的立体手性空腔。B-环糊精（B-CD）是由七个D-吡喃葡萄糖构成的环状低聚糖。目前，B-环糊精在医药领域有着广泛的应用，例如：提高药物分子的水溶性、稳定性等［1,2］。通过安全性试验证明环糊精毒性低，口服环糊精是安全有效的。但B-环糊精胃肠外给药有一定毒性，经肌肉给药后能形成溃疡，静脉给药可导致肾脏毒性和溶血作用［3］。为了解决静脉给药安全性、提高溶解性，需要对B-环糊精进行修饰，羟丙基-倍他-环糊精是B-环糊精的醚化衍生物［4,5］。HP-B-CD的结构式如图1所示，因为，每个B-CD分子中有七个D-吡喃葡萄糖残基，每个葡萄糖残基上有三个可被取代的羟基，所以，这样计算HP-B-CD的平均取代度为0-21。HP-B-CD平均取代度的不同，其各种性能参数也稍有不同。目前国际上使用HP-B-CD的平均取代度一般为4.0-6.0。目前中国药典和欧洲药典中，用于测定HP-B-CD平均取代度的方法有气相色谱法、容量法及核磁法［6,7］。目前国内采用核磁共振方法测定HP-B-CD平均取代度还没有文献报道，本研究采用核磁共振氢谱（1H-NMR）方法，建立了一种快速、专属、简单，用于无对照品或者指示剂的HP-B-CD平均取代度测定的分析方法。2实验部分仪器与试剂AVANCEIII600MHz全数字化超导核磁共振谱仪（瑞士Bruker公司）。D2O（（D，99.9%），美国CIL）；三批羟丙基-B-环糊精（批号：130101、130102、130103；由石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司提供）。实验方法测定温度：25C；环境湿度：15RH%；观测频率：600.137MHz；谱宽：4200Hz；90度脉冲宽度：10.06“；脉冲延迟时间：1s；采样时间：3s；采样次数:64次；高斯增宽因子：0；线增宽因子：0.2。分别准确称量不同批次羟丙基-倍他-环糊精10mg置于5mm的核磁共振样品管中，加入0.6毫升D2O振荡溶解，制成待测试样溶液。在上述的实验条件下，调整仪器参数，调谐、控温、匀场、采样，得到1H-NMR谱。在进行相位和基线调整，以水峰为内标，标记为4.75ppm分别对5.3-4.85ppm（葡萄糖环上氢的化学位移）和1.2-1.0ppm（羟丙基上甲基的化学位移）分别进行积分，将得到积分值进行平均取代度的计算[7]。A1：羟丙基上甲基氢的积分面积；A2:葡萄糖环上氢的积分面积；3结果与讨论3.11H-NMR测定羟丙基-倍他-环糊精（HP-B-CD）平均取代度方法的建立溶剂及内标峰选定固体样品须配成溶液测试，合适的溶剂粘度小，对样品溶解性能好，不与样品发生化学反应或者缔合，其谱峰不与样品峰发生重叠。因为羟丙基-倍他-环糊精的水溶解性好，所以采用水作为溶剂，羟丙基-倍他-环糊精的1H-NMR谱见图2。内标物质应该具有较高的纯度和准确的含量，不与样品和溶剂发生化学反应或缔合，能溶于NMR溶剂，含有多个质子，具有易于识别的谱峰，最好有尖锐单峰[8]；本实验选取水峰作为内标峰，其化学位移定为4.75ppm，避免外加入的内标物质对实验结果的影响。采集时间的选择足够的采样时间可以保证只有感应衰减信号能衰减完全，得到基底没有振荡的相应谱峰，从而提高分辨率[9]。以不同的采集时间采集图谱，实验结果发现采样时间大于2.4秒自由感应衰减完全。因此，实验可选取采样时间等于3秒。脉冲延迟时间的选择弛豫过程是核磁共振现象发生后得以保持的必要条件。因此，实验中应选取合适的脉冲延迟时间，保证谱峰强度不会被饱和，这样有利于对谱峰进行正确的积分，得到准确的结果，在实验中，按照脉冲从短（0.03秒）到长（3秒）分别采样，然后对定量峰进行积分，其峰面积比A1/A2随脉冲延迟时间的变化如表2所示：结果发现，在0.5秒之前，随着脉冲延迟时间的增大，A1/A2增大；在脉冲延迟时间大于0.5秒后，A1/A2没有明显的变化，因此实验选取脉冲延迟时间是1秒。3.1.4重复性实验按2.2节的实验方法，以20130101批次羟丙基-倍他-环糊精（HP-B-CD）样品，在同一实验条件下，连续做6个1H-NMR，并以A1/A2峰面积比计算考察实验的重复性，结果见表2。计算得到其相对标准偏差RSD=0.08%（n=6），表明实验的重复性较好。3.2羟丙基-倍他-环糊精（HP-B-CD）平均取代度结果取羟丙基-倍他-环糊精（HP-B-CD）（批号：20130101,、20130102、20130103），按照2.2节的实验方法，在同一条件下做1H-NMR图谱，通过公式计算得到20130101、2013010220130103批次的平均取代度分别为：4.84,4.81,4.87。实验结果表明，利用核磁共振方法测定羟丙基-倍他-环糊精的平均取代度专属性较好，重复性较好，能够快速测定，对操作人员无人身危害等优点。参考文献:DucheneD[M].Newtrendsincyclodextrinsandderivatives,EditionsdeSante,1991:11〜18.UekamaK.PharmaceuticalapplicationsofmethylatedcyclodextrinsJ.Pharm.Int.,1985,6:61〜65.高申[M]•现代药物-新剂型新技术•北京：人民军医出版社,2002:35〜40.BrewsterME,HoraMS,SimpkinsJW,etal.Useof2-hydroxypropyW-cyclodextrinasasolubilizingandstabilizingexcipientforproteindrugsJ.Pharm.Res,1991,8:792〜795.袁超,金征宇.羟丙基环糊精性质.应用及前景展望[J].粮食与油脂,2009,1:4〜6.ChinesePharmacopoeia,2005,VII-F-48.EP7.301/2009:1804.胡敏,胡昌勤，刘文英.核磁共振氢谱内标法测定茚地普隆的含量[J].分析化学,2004,32（4）:451〜455.KeelerJ[M].UnderstandingNMRspectros