微生物的选择培养和计数(第2课时)【高效课堂+备课精研】 高二生物 精讲课件（人教版2019选择性必修3）

第2节

微生物的培养技术及应用二微生物的选择培养和计数（第2课时）1.间接计数法——稀释涂布平板法（1）原理

当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。稀释103倍稀释104倍稀释105倍空白对照三、微生物的数量测定（2）计数原则①

一般选择菌落数为30～300的平板计数。②

在同一稀释度下，应至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值。③

适当的稀释度、涂布是否均匀是成功统计菌落数目的关键。分析实验结果时，要考虑重复组结果是否接近，如果相差太大，意味着操作有误，需重新实验。1.间接计数法——稀释涂布平板法（3）结果分析①统计的菌落数往往比活菌的实际数目少；②统计结果一般用菌落数而不是用活菌数来表示。原因：当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。三、微生物的数量测定（4）计算公式每克样品中的菌落数＝(C÷V)×MC代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数；M代表稀释倍数。V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)；（5）使用范围

可以用来测定土壤、水、食品等样品中的细菌、酵母菌、芽孢和孢子等的数量，但不适于测定样品中的放线菌、丝状真菌等丝状体微生物的数量。例1.某同学在稀释倍数为106的培养基中测得平板上菌落数的平均数为234，那么每g样品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1mL)()A.2.34×108

B.2.34×109

C.234

D.23.4B学以致用某两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。从对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果：甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230；乙同学在该浓度下涂布了A、B、C三个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。请评价这两位同学的实验结果的有效性：1.甲同学________________________________；2.乙同学_____________________________________________；实验操作不合理，未设置重复实验组结果计算不合理，21与另外两组数值相差太大，应舍去学以致用2.直接计数法——显微镜直接计数（1）原理

利用特定的__________或____________在______下观察、计数，然后再计算________的样品中微生物的数量；

*血细胞计数板常用对相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等；

细菌计数板可对细菌等较小的细胞进行观察和计数。（2）优点________（3）缺点①统计结果一般是_________________，不能区分死菌与活菌。②个体小的细菌在显微镜下难以观察。

③不适于对运动细菌的计数。细菌计数板血细胞计数板显微镜一定体积快速、直观活菌数和死菌数的总和三、微生物的数量测定计数区放大后的计数室(4)计数方法：每毫升原液所含细菌数＝每小格平均细菌数×400×10000×稀释倍数注意：统计结果一般是活菌数和死菌数的总和。（“染色排除法”）三、微生物的数量测定2.直接计数法——显微镜直接计数内容直接计数法间接计数法主要用具计数依据优点缺点计算公式显微镜、细菌计数板或血细胞计数板涂布器细菌个数培养基上菌落数计数方便、操作简单计数的是活菌不能区分死菌与活菌操作较复杂且有一定误差每毫升原液含菌株数＝400×10000×每小格平均菌株数×稀释倍数每毫升原液含菌株数＝平均菌落数/所用涂布液体积×稀释倍数三、微生物的数量测定（1）从土壤中分离出能够分解尿素的细菌（2）统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成_____的微生物才能分解尿素，利用

的_____培养基，可以从土壤中分离出

的细菌。脲酶以尿素作为唯一氮源选择分解尿素CO(NH2)2+H2O2NH3+CO2

脲酶土壤中分解尿素的细菌的分离和计数1.实验目的2.实验原理

常见的分解尿素的微生物：芽孢杆菌、小球菌、棒状杆菌等细菌，某些真菌和放线菌也能分解尿素。实验流程：样品稀释涂布平板微生物的培养与观察

菌落计数土壤取样制备培养基土壤中分解尿素的细菌的分离和计数①取样地点要求：酸碱度接近中性的潮湿土壤。

（细菌适宜在该环境中生长）②取样过程：铲去表层土（一般3cm左右）。

（细菌绝大部分分布在距地表3～8cm的土壤层。）

土壤中分解尿素的细菌的分离和计数3.实验步骤（1）土壤取样注意事项：取土样时用的铁铲和取样袋在使用前都需要灭菌。操作完成后，一定要洗手。葡萄糖10.0g尿素1.0gKH2PO41.4gNa2HPO42.1gMgSO4·7H2O0.2g琼脂15.0g蒸馏水1000ml（2）制备培养基①选择培养基：以尿素为唯一氮源②牛肉膏蛋白胨培养基：作为对照组，来判断选择培养基是否具有选择作用土壤中分解尿素的细菌的分离和计数3.实验步骤怎样证明此培养基具有选择性呢？以尿素为唯一氮源的培养基牛肉膏蛋白胨培养基

是分离尿素细菌判断该培养基有无选择性实验组对照组培养基类型是否接种

目的

结果只生长尿素细菌生长多种微生物是土壤中分解尿素的细菌的分离和计数①

测细菌数：一般用104、105、106稀释液。②

测放线菌数：一般用103、104、105稀释液。③

测真菌数：一般用102、103、104稀释液。（3）样品的稀释与涂布平板

不同微生物在土壤中含量不同，分离不同的微生物采用不同的稀释度，以保证获得菌落数在30～300之间适于计数的平板。土壤中分解尿素的细菌的分离和计数在初次实验中，对于稀释的范围没有把握，怎样做才能保证从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数？思考

选择一个比较宽的范围，将1×103～1×107倍稀释的稀释液分别涂布到平板上培养，以保证能从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数。3.实验步骤组别具体组别具体操作作用实验组实验组1涂布接种的选择培养基三次重复排除偶然因素对实验结果的影响，用以分离并计数能分解尿素的细菌。实验组2涂布接种的选择培养基实验组3涂布接种的选择培养基实验组4涂布接种的牛肉膏蛋白胨培养基实验组4与实验组1、2、3组对比用以验证选择培养基是否具有选择作用。对照组对照组1不涂布接种的选择培养基对照组1与实验组1、2、3组对比用以验证选择培养基中是否含有杂菌。对照组2不涂布接种的牛肉膏蛋白胨培养基对照组2与实验组4对比用以验证牛肉膏蛋白胨培养基中是否含有杂菌。实验结果实验组1、2、3分离得到尿素分解菌的单菌落；第4组得到多种菌落；第5、6组正常情况下无菌落。本实验实验组和对照组设计如下：土壤中分解尿素的细菌的分离和计数①本实验使用的平板和试管较多，为了避免混淆，最好在使用前做好标记。例如，在标记培养皿时应该注明组别、培养日期和平板上培养样品的稀释度等。土壤中分解尿素的细菌的分离和计数（3）样品的稀释与涂布平板注意事项：②建立“有菌观念”。实验室、实验器材(取土样的小铁铲、盛土样的纸袋等)、操作者、空气中都存在微生物，都有污染的可能，必须进行严格的消毒、灭菌，整个实验过程(称取土样、稀释土壤溶液等)要在酒精灯火焰旁进行。3.实验步骤③本实验耗时较长，需要事先规划时间，以便提高实验效率，在操作时有条不紊。①

培养条件：不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。细菌一般在30～37℃的温度下培养1～2d。②

观察：每隔24h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。③

一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征，如形状、大小和颜色等。（4）微生物的培养与观察3.实验步骤土壤中分解尿素的细菌的分离和计数

（1）结合对照组，分析培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出一些菌落。

如果没有接种的培养基上没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。如果接种后的完全培养基上的菌落数明显多于选择培养基上的菌落数，说明选择培养基筛选出了一些尿素分解菌。土壤中分解尿素的细菌的分离和计数4.结果分析与评价

（2）你是否获得了某一稀释度下菌落数为30~300的平板？在这一稀释度下，是否至少有2个平板的菌落数接近？

如果得到了两个或多个菌落数为30～300的平板，说明稀释度合适，操作比较成功，能够进行菌落的计数。土壤中分解尿素的细菌的分离和计数4.结果分析与评价（3）你统计的每克土样中能分解尿素的细菌的菌落数是多少？与其他同学统计的结果接近吗？如果差异很大,可能是什么原因引起的？

如果是用同一土样进行的操作，数据应该比较接近。如果差异很大，就需要从操作是否规范、培养基配制是否合理等方面查找原因。内容现象结论有无杂菌污染的判断对照的培养皿中无菌落生长培养基中菌落数偏高菌落形态多样，菌落数偏高选择培养基的筛选作用牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目大于选择培养基上的数目样品的稀释操作得到3个或3个以上菌落数目在30~300的平板重复组的结果若选取同一土样，统计结果应接近土壤中分解尿素的细菌的分离和计数4.结果分析与评价未被杂菌污染被杂菌污染培养基中混入其他杂菌选择培养基具有筛选作用操作成功

本活动只是初步筛选了能分解尿素的细菌,对分离的菌种进行鉴定还需要借助生物化学的方法。你可以查阅相关资料,进一步设计实验来鉴定自己分离的菌种。

细菌合成的脲酶将尿素分解为氨，氨会使培养基的碱性增强，pH升高，因此可以通过检测培养基pH的变化来判断是否发生了该化学反应，进而判断该菌是否为尿素分解细菌。原理土壤中分解尿素的细菌的分离和计数5.进一步探究脲酶的检测土壤中分解尿素的细菌的分离和计数5.进一步探究方法

在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将变红。这样，我们就可以初步鉴定该种细菌能够分解尿素。液体培养基：可以直接看液体的变色情况。固体培养基：可以观察菌落周围是否出现红色环带，红色环带直径与菌落直径比值越大，说明分解能力越强。课堂小结1.研究人员用无机盐、琼脂和石油配制的培养基从被石油污染的土壤中筛选出了一种石油降解菌。判断下列相关表述是否正确。（1）这种培养基是一种选择培养基。（

）（2）利用这种石油降解菌可以降解石油。修复土壤。（

）（3）相对于未被污染的土壤,从被石油污染的土壤中更容易分离到石油降解菌。（

）√√√练习与应用一、概念检测2.用稀释涂布平板法来统计样品中的活菌数时，通过统计平板上的菌落数就能推测出样品中的活菌数,原因是（

）A.菌落中的细菌数目是固定的B.平板上的一个菌落就是一个细菌C.通过此方法统计的菌落数与活菌的实际数目相同D.平板上的一个菌落一般来源于样品稀释液中的一个活菌D练习与应用一、概念检测1.反刍（chú）动物，如牛和羊具有特殊的器官一瘤胃。在瘤胃中生活着多种微生物，其中许多微生物能分解尿素。请你设计一个实验从瘤胃中分离出能够分解尿素的微生物。

反刍动物的瘤胃中有大量的微生物，其中就有分解尿素的微生物。由于瘤胃中的微生物多为厌氧菌，接触空