Chapter20高效液相色谱法

Chapter20HighPerformanceLiquidChromatography(HPLC)化学化工学院杨睿第一部分概述第二部分高效液相色谱仪第三部分HPLC的主要类型及色谱分离方法的选择高效液相色谱法(HighPerformanceLiquidChromatography,HPLC)：用高压力输送流动相，采用高效固定相及在线检测等手段的液相色谱法。§20－1概述柱前压：50～500105Pa；

填充粒径：5～10mm；1～3mmn：5～6104

；1～3105

一、HPLC的特点：1.与经典液相色谱法比较固定相、输液设备、检测手段2.与气相色谱法比较分析对象、流动相、操作条件GC：：气体、20%的有机物（低级烃、石油化工）HPLC：80%的有机物；

蛋白质、核酸、氨基酸、多糖类、植物色素、药物、药用植物有效成分、高聚物、染料。。。

固定相粒径理论塔板数LC：100~200mm

<3000HPLC：<10mm5~30万3.HPLC的特点：分离效能高（n=104m-1，柱效»

一般LC）选择性高

检测灵敏度高分析速度快

重现性好应用范围广（可分析80%有机化合物）局限性：缺乏通用检测器；设备费用昂贵；操作严格二、HPLC的分类：（按分离机制）体积排阻色谱吸附色谱分配色谱离子交换色谱msmsms-+ms三、正、反相色谱体系流动相是非极性,固定相是极性的流动相极性<

固定相极性正相色谱：流动相是极性,固定相是非极性的流动相极性>固定相极性反相色谱：正己烷<乙醚<乙酸乙酯<

异丙醇水>甲醇>乙腈>四氢呋喃正相色谱反相色谱固定相硅胶(表面修饰)、氧化铝非极性烷基健合固定相流动相极性比固定相弱极性比固定相强保留值随试样极性↑而随流动相极性↑而随试样极性↑而随流动相极性↑而适用对象异构体（对映异构、空间异构）；中等极性或极性化合物；同系物；非极性或低极性化合物操作温度室温最高50~800C(以降低黏度)

↑↓↓

↑相对分子质量102103104105106吸附色谱正相分配色谱体积排阻色谱离子交换色谱分配色谱反相分配色谱凝胶渗透色谱凝胶过滤色谱极性增加§20－2高效液相色谱仪高效液相色谱仪流程图贮液瓶高压输液泵进样器色谱柱检测器记录装置预柱梯度洗脱装置恒流泵恒压泵溶质型检测器总体检测器防止不溶性颗粒堵塞避免强保留组分污染光电二极管阵列2011SpringSemester1、HPLC的固定相按承受高压能力分类:刚性固体：以SiO2为基质（可承受7.0×108～1.0×109Pa的高压）在SiO2表面键合各种官能团，可扩大应用范围，是目前最广泛使用的一种固定相硬胶：由聚苯乙烯与二乙烯苯基交联而成（3.5×108Pa）主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中§20－3HPLC的固定相和流动相按孔隙深度分类:表面多孔型：基体为实心玻璃珠，在玻璃球外面覆盖一层多孔活性材料（如硅胶、氧化铝、离子交换剂、分子筛、聚酸胺等），常用做保护柱填料全多孔型：由直径为10nm的硅胶微粒，或氧化铝微粒凝聚而。颗粒很细（5～10μm），传质速率快，易实现高效、高速。特别适合复杂混合物分离及痕量分析。2、HPLC的流动相(1).HPLC对流动相的基本要求：(2).与分离有关的溶剂性质：溶剂强度°：溶剂对固定相的亲和力溶解度参数d：衡量溶剂对化合物的洗脱能力极性参数P’

：衡量溶剂极性大小流动相溶剂强度°(SiO2)极性指数P’环己烷0.030.04n-正己烷0.010.1四氯化碳0.111.6甲苯0.222.4乙醚0.382.8二氯甲烷0.343.1四氢呋喃0.354.0氯仿0.264.1乙醇0.684.3乙酸乙酯0.384.4二氧六环0.494.8甲醇0.735.1乙腈0.505.8水强10.2HPLC常用流动相的性质P’越大，溶剂极性越大（极性洗脱）正相色谱：反相色谱：°越大，溶剂与固定相亲和力越强，越容易将样品从固定相上洗脱（强度洗脱）纯溶剂的极性和保留值的关系：实验表明，当流动相的P’

改变2个单位时，k’值大约变化10倍：正相色谱反相色谱混合溶剂的极性：§20－4液固（吸附）色谱法(LSC)

Liquid–SolidAdsorptionChromatography分离原理固定相流动相应用实例§20－5液液（分配）色谱法(LLC)

Liquid–LiquidPartitioningChromatography分离原理固定相流动相应用实例由于固定相易流失，已逐渐为化学键合相色谱法和不要载体的逆流色谱法代替§20－6化学键合相色谱法(CBSPC)

BondedStationaryPhasesChromatography化学键合固定相法反相键合相色谱法正相键合相色谱法离子性键合相色谱法手性色谱法采用化学键合固定相进行分离的液相色谱§20－7排阻色谱法大分子物质的分离测定聚合物分子量及其分布主要用途：（自学）其他的HPLC法§20－8色谱分离方法的选择选择色谱分离方法的主要根据是试样的相对分子质量的大小、在水中和有机溶剂中的溶解度、极性和稳定程度以及化学结构等物理性质和化学性质色谱体系的选择普通样品的定性定量分析任务排阻色谱高分子量样品水溶性反相排阻油溶性正相排阻特异性生物物质亲和色谱水溶性样品反相色谱油溶性样品正相色谱保证样品在流动相中有良好溶解度不离解分子型键合色谱离子型离子交换色谱离子对色谱可离解或可形成离子液相色谱中等分子量非挥发性样品气相色谱低分子量气体(在液体中溶解度小、k’太小)低分子量气固色谱气液色谱300℃以下挥发性样品色谱体系的选择对样品进行快速、高分辨的分析任务定量分析为主优先采用液相色谱定性分析为主优先采用毛细管电泳离子型化合物区带电泳DNA/核苷酸等大蛋白质凝胶色谱与凝胶电泳含强疏水基团电色谱非离子、倾向疏水化合物离子胶束电动色谱低浓度生物质浓缩等速电泳两性生物质等电聚焦电泳手性异构体拆分手性毛细管电泳HPLC的应用

1.环境中有机氯农药残留量分析固定相：薄壳型硅胶(37～50m)

流动相：正己烷流速：1.5mL/min

色谱柱：50cm2.5mm(内径)

检测器：差示折光检测器

可对水果、蔬菜中的农药残留量进行分析。2.稠环芳烃的分析

稠环芳烃多为致癌物质。

固定相：十八烷基硅烷化键合相流动相：20%甲醇-水～100%甲醇线性梯度淋洗，2%/min

流速：1mL/min

柱温：50ºC

柱压：70104Pa

检测器：紫外检测器化学键合固定相法优势：键合相非常稳定，适用于梯度洗脱由于键合到载体表面的官能团可以是不同极性的，因此适用于种类繁多样品的分离表面吸附和催化作用小，少数几种键合相可以满足大部分化合物的分离分析要求，目前约80%的分离分析是用键合相色谱完成的键合固定相类型：用来制备键合固定相的载体，主要是硅胶，利用硅胶表面的硅醇基(Si一OH)与有机分子反应成键,得到各种性能的固定相。一般可分三类：疏水基团：如不同链长的烷烃(C2,4,8,18等)、苯基等非极性键合相——反相键合相色谱极性基团：如氨基、氰基、二醇基等极性键合相——正相键合相色谱离子交换基团：如作为阴离子交换基团的胺基，季铵盐；作为阳离子交换基团的磺酸等离子交换键合相——离子交换色谱有机基团与基体硅胶表面的键型有四类：1.Si-O-C型(硅酸酯型)，酯化反应得到，易水解和醇解，只在正相色谱中使用由于这类键合固定相的有机表面是一些单体，具有良好的传质特性，这些酯化过的硅胶填料易水解且受热不稳定，因此仅适用于不含水或醇的低极性流动相，分离极性化合物2.Si-N型（共价键键合型），氯化硅胶与胺进行胺化反应制备，未商品化共价键健合固定相不易水解，并且热稳定较硅酸酯好。缺点是当使用水溶液时，必须限制pH在4～8范围内3.Si-O-C型（共价键健合型），氯化硅胶与格氏试剂反应得到，稳定性好共价键健合固定相不易水解，热稳定性好。缺点是格氏反应不方便，制备复杂、成本高例：4.Si-O-Si-C型（硅烷化键合固定相），通过硅醇基与硅烷化试剂反应制备，制备简单这类键会固定相具有热稳定性和化学稳定性好，不易吸水，耐有机溶剂的优点，在70℃以下，pH=2～9范围内正常工作，应用最为广泛流动相：强极性溶剂（甲醇，乙腈，四氢呋喃等）用水调节洗脱强度极性大的组分保留时间短极性小的组分保留时间长反相键合相色谱：流动相极性>

固定相极性流动相：弱极性溶剂（乙醚，二氯甲烷，氯仿等）用正己烷调节洗脱强度极性小的组分保留时间短极性大的组分保留时间长正相键合相色谱：流动相极性<

固定相极性离子性键合相色谱：40手性固定相（CSP）色谱：常见的CSP：

给体-受体CSP；

多糖类CSP；

环糊精CSP；

蛋白质CSP；

其它的CSP分离原理分离前提：K

或k‘

差异根据各组分在固定相表面上吸附能力的差异实现分离固体固定相溶剂°越大，洗脱能力越强，越容易将样品从固定相上洗脱，保留时间越短极性固定相LSC固定相（粒径5~10mm）非极性固定相酸性吸附剂：硅胶、硅酸镁用于分离碱性物质碱性吸附剂：氧化铝、氧化镁、聚酰胺用于分离酸性物质活性炭、炭黑、高分子多孔小球用于分离弱极性化合物LSC流动相极性（硅胶，氧化铝等）流动相选择的依据是待测样品极性的大小固定相流动相以非极性流动相为主体，加入中－强极性溶剂为改性剂，以调节洗脱强度待测样品极性非极性（高分子聚合物，活性炭等）以极性流动相为主体，加入中－弱极性溶剂为改性剂，以调节洗脱强度非极性梯度洗脱一般地，含弱吸附与部分中等吸附官能团组分的分离，可以用烃类作洗脱液含羰基化合物，用二氯甲烷作洗脱液其余组分的分离，则在洗脱液中添加乙腈或甲醇液固吸附色谱优势：分离难溶于水的非极性化合物、位置异构体、立体异构体等液固吸附色谱中的保留时间通常为：饱和烃<烯烃<芳香烃<卤代物和硫化物<醚<硝基化合物<酯≈醇≈胺<砜<亚砜<酰胺<羧酸表面多孔型颗粒ALLC固定相30mm实心球1～2mm5mm全多孔型粒子B全多孔型颗粒C深孔载体固定液几种不同极性的固定液物理作用LLC流动相流动相极性<固定相极性正相色谱：液-液色谱：要求流动相对固定相的溶解度尽可能小，使用前要彼此饱和流动相极性>固定相极性反相色谱：固定液易流失，不适用于梯度洗脱化学键合固定相法优势：键合相非常稳定，适用于梯度洗脱由于键合到载体表面的官能团可以是不同极性的，因此适用于种类繁多样品的分离表面吸附和催化作用小，少数几种键合相可以满足大部分化合物的分离分析要求，目前约80%的分离分析是用键合相色谱完成的键合固定相类型：用来制备键合固定相的载体，主要是硅胶，利用硅胶表面的硅醇基(Si一OH)与有机分子反应成键,得到各种性能的固定相。一般可分三类：疏水基团：如不同链长的烷烃（C8和C18）、苯基等非极性键合相——反相键合相色谱极性基团：如氨丙基、氰基、醇等极性键合相——正相键合相色谱离子交换基团：如作为阴离子交换基团的胺基，季铵盐；作为阳离子交换基团的磺酸等离子交换键合相——离子交换色谱有机基团与基体硅胶表面的键型有四类：1.Si-O-C型(硅酸酯型)，酯化反应得到，易水解和醇解，只在正相色谱中使用由于这类键合固定相的有机表面是一些单体，具有良好的传质特性，这些酯化过的硅胶填料易水解且受热不稳定，因此仅适用于不含水或醇的低极性流动相，分离极性化合物2.Si-N型（共价键键合型），氯化硅胶与胺进行胺化反应制备，未商品化共价键健合固定相不易水解，并且热稳定较硅酸酯好。缺点是当使用水溶液时，必须限制pH在4～8范围内3.Si-C型（共价键健合型），氯化硅胶与格氏试剂反应得到，稳定性好共价键健合固定相不易水解，热稳定性好。缺点是格氏反应不方便，制备复杂、成本高例：4.Si-O-Si-C型（硅烷化键合固定相），通过硅醇基与硅烷化试剂反应制备，制备简单这类键会固定相具有热稳定性和化学稳定性好，不易吸水，耐有机溶剂的优点，在70℃以下，pH=2～9范围内正常工作，应用最为广泛实验室自装柱：细粒度的填料（＜20mm）一般采用匀浆填充法装柱商品柱梯度淋洗装置溶剂A

混合室高压泵1高压泵2

程序控制器色谱柱计量泵(低压)溶剂A溶剂B混合室高压泵色谱柱溶剂B等梯度洗脱装置

两种典型的光化学流动池流动相入口流动相入口流动相出口