分子生物学复习

第一章绪论分子生物学的研究对象是核酸和蛋白质大分子的结构与功能以核酸为中心，研究蛋白质与DNA相互作用的规律、蛋白质与蛋白质相互作用的现象等，从分子水平了解生命活动的本质主要研究内容：核酸、蛋白质大分子物质的结构与功能及细胞信号传到与通讯等艾滋病研究艾滋病：获得性免疫缺陷综合征(acquiredimmunodeficiencysyndrome,AIDS),是有艾滋病毒(humanimmunodeficiencyvirus,HIV)引起的一种传染性疾病。HIV是由包膜蛋白gp120与CD4T淋巴细胞表面的CD4受体结合后，在gp41透膜蛋白的协助下，伸入CD4+细胞膜，将病毒基因注入细胞内。HIV是单链逆转录病毒，其基因组含有9747bp的核酸含有两个亚型：HIV1、HIV2由20面体构成，表面的糖蛋白呈刺突样分部，直径约为100nm鸡尾酒疗法(combinationtherapy)：美籍华裔何大一提出的综合治疗的方法，即联合使用逆转录酶抑制剂和蛋白酶抑制剂进行治疗目前已经上市的逆转录酶抑制剂的核甘类药物：齐多夫定、去羟肌昔等；非核昔类药物：奈韦拉平、地拉韦啶、Efavirenz等第二章核酸核酸(nucleicacid)是以核甘酸为基本组成单位的生物大分子，携带和传递遗传信息。脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid,DNA)：主要以双链结构形式存在，90%以上分布于细胞核，其余分布于核外如线粒体，叶绿体，质粒等。携带遗传信息，决定细胞和个体的基因型(genotype)。核糖核酸(ribonucleicacid,RNA)：常以单链形式存在分布于胞核、胞液。参与细胞内DNA遗传信息的表达。某些病毒RNA也可作为遗传信息的载体。DNA的复制1953年，Watson和Crick提出了遗传物质复制的详细假说：半保留复制(semiconservativereplication)1958年，Meselson和Stahl利用同位素标记技术在大肠杆菌中首次证实了DNA的半保留复制。DNA的复制体系DNA复制是一个十分复杂的生物合成过程，需要30多种酶和蛋白质参与。每个DNA复制的独立单元被称为复制子(replicon)，主要包括复制起始位点(originofreplication^^终止位点(terminus)。整个DNA复制“机器”被称为DNA复制体系(DNAreplicasesystem或DNAreplisome)。DNA聚合酶DNA聚合酶的定义：以DNA为复制模板，将DNA由5’端点开始复制到3’端的酶。DNA聚合酶以4种脱氧核甘磷酸为底物，还需要模板DNA、引物和Mg2+。DNA聚合酶催化合成反应的机制：在生长的DNA链(或引物链)末端的3,-OH对另一新加入的脱氧核甘三磷酸a-位的磷酸进攻，形成磷脂键，并放出一个焦磷酸。每放出一个焦磷酸，即形成一个磷酸二酯键，就延长一个核甘酸单位的DNA链。原核生物中的DNA聚合酶有五种，分别命名为DNA聚合酶I〜V(polI〜V)。前三种酶具有多种酶活性的多功能酶，参与原核生物DNA复制的酶主要是polIII和polIopolI是1956年由A.Kornberg等在大肠杆菌中发现的，也是研究最为深入的一种DNA聚合酶。poll为单一肽链的大分子蛋白质，相对分子量为109000,是一个多功能酶，具有5'-3'聚合酶、3'-5'外切酶和5'f3'外切酶活性。可被特异的蛋白酶水解为两个片段，其中的大片段称为Klenowfragment,具有5'-3'聚合酶活性和3'-5'外切酶的活性polll为多亚基酶，它有5'-3'聚合酶和3'-5'外切酶活性，但没有5'-3'外切酶活性，且酶活性很低，目前认为其主要参与DNA的修复。polin由十种亚基组成，其中a亚基具有5/-3/聚合DNA的酶活性，因而具有复制DNA的功能；而&亚基具有3,-5’外切酶的活性，因而与DNA复制的校正功能有关。polW和V是1999年被发现，涉及DNA的错误倾向修复(error-pronerepair)。当DNA受到较严重损伤时，即可诱导产生这两个酶，使修复缺乏准确性(accuracy),因而出现高突变率。高突变率虽会杀死许多细胞，但至少可以克服复制障碍，使少数突变的细胞得以存活。DNA解旋酶(gyrase)天然DNA的负超螺旋虽然有利于DNA的解旋，但随着复制的进行，复制叉前方亲代DNA中仍积累巨大的张力，因此复制中需要DNA解旋酶去除接连产生的扭曲张力。大肠杆菌中的DNA解旋酶又称拓扑异构酶II(topoisomeraseII,TopII),有四个亚基组成四聚体a282。真核生物拓扑异构酶I呈a8二聚体结构。在消耗ATP时，DNA解旋酶每作用一次产生2个负超螺旋，可以消除复制叉向前移动所产生的正超螺旋；在无ATP时，可同时切开超螺旋的两条链，使DNA变成松弛状态，然后将切口接好，使复制的进行不会因螺旋的缠结而被妨碍。DNA旋转酶对真核细胞有丝分裂也是非常重要，如果不解开缠绕，在任何细胞周期中姐妹染色体都将无法分离。此外，DNA旋转酶在转录、同源重组及可移动元件的转座中都起重要作用。DNA解链酶(DNAhelicase)和单链结合蛋白(single-strandbindingprotein,SSB)DNA解链酶和单链DNA结合蛋白的功能：DNA在被复制前都必须解开双链，复制过程中，复制叉在不断前进，复制叉前方的亲代DNA就需不断解链，为使复制能够顺利进行，就必须防止DNA单链的链间或链内局部“退火”并保证其完整性与伸展性，使单链DNA处于稳定状态。DNA解链酶和单链DNA结合蛋白承担了这一任务。DNA解链酶是利用ATP水解获得的能量来打断氢键，解开双链DNA并在DNA分子上沿一定方向移动的一类酶的总称(又称解螺旋酶)。原核生物大肠杆菌有4种解链酶，即I、n、n和Rep蛋白，其中Rep蛋白是最主要的，结合于前导链模板沿3’5’方向移动，解链酶I、n、n结合于滞后链模板沿5’3’方向前进，每解开一对碱基需水解2分子ATP。单链结合蛋白(SSB)：能使双螺旋解开后的DNA单恋稳定存在，便于以其为模板复制子链，保护单链DNA,避免核酸酶的降解。大肠杆菌中的SSB为四聚体，对单链DNA有很好的亲和性，但对双链DNA和RNA没有亲和力。它们与DNA结合时有正协同作用，即有一个SSB与DNA结合后，促进了更多的SSB与DNA单链结合，直至迅速扩展分布整个DNA单链。真核生物的SSB没有正协同作用，可能作用方式有所不同。SSB有某些碱基组成的倾向性，但很少有顺序专一性结合，可以周而复始地循环使用，在DNA的修复和重组中都有SSB的参与。随着解旋酶的移动和双链的打开，DNA链中的张力变小了。在将实验结论与两种理论预言进行比较后，科学家确定，解旋酶在这一过程中是主动起作用的。引发酶(primerase,或称引物酶)已经证明，DNA的半不连续复制中，DNA聚合酶不能从头起始新的DNA链合成，只能在已有引物的3，端向前延伸。RNA引物的大小，通常为1—10个核甘酸。RNA引物的碱基顺序，与其模板DNA的碱基顺序相配对。引物长度和序列随着基因组的种类而表现出不同催化RNA引物(RNAprimer)合成的酶叫引发酶(primerase,或称引物酶)。引发酶识别DNA单链模板特意顺序，以核糖核甘三磷酸(NTP)为底物合成寡聚核甘酸产生3，-OH,为DNA聚合酶起始生成磷酸二酯键提供条件。引物与典型的RNA(如mRNA)不同，它们在合成以后并不与模板分离，而是以氢键与模板结合。E•coli的引发酶是一条肽链，相对分子量为60000,每个细胞中有50〜100个分子，由大肠杆菌DnaG基因编码。DNA连接酶(DNAligase)DNA连接酶(DNAligase)可催化两段DNA片段之间磷酸二酯键的形成，而使两段DNA连接起来。DNA连接酶催化的条件是：①需一段DNA片段具有3'-OH,而另一段DNA片段具有5--Pi基；②未封闭的缺口位于双链DNA中，即其中有一条链是完整的；③需要消耗能量，在原核生物中由NAD+供能，在真核生物中由ATP供能。总结：DNA复制体系：DNA聚合酶、DNA解旋酶、DNA解链酶、单链结合蛋白、引发酶、DNA连接酶原核生物DNA复制的过程以大肠杆菌为例，说明原核生物DNA复制的过程。大肠杆菌DNA复制是一个十分复杂的生物合成过程，需要有20多种酶和蛋白质因子参与，根据反应阶段和所需的不同酶类，DNA的复制可被分为三个阶段，即复制起始、延伸和终止。复制起始阶段(1)复制起始点定义：DNA在复制时，需在特定的位点起始，这是一些具有特定核甘酸排列顺序的片段，即复制起始点(复制子)(originofreplication,ori)。大肠杆菌的复制起始位点是oriC,全长245bp，所有细菌复制起始位点序列都是保守的，并富含AT。起始位点中有两个关键序列在复制起始之中起作用：4个9bp的重复序列和3个13bp重复序列。细胞中的DNA复制一经开始就会连续复制下去，直至完成细胞中全部基因组DNA的复制。DNA复制从起始点开始直到终点为止，每个这样的DNA单位成为复制子或复制单元(replicon)。在原核细胞中只有一个复制起始点，即只有一个复制子。(2)复制方向DNA的两条链在起始点分开形成叉子形状，成为复制叉(replicationfork)。大多数复制方向是双向的，少数是单向的三种形式定点开始双向复制，这是原核生物和真核生物DNA复制最主要的形式，从一个定点位点解链，沿着两个相反的方向个生长出两条链，形成一个复制泡。定点开始单向复制，质粒ColE1是个典型的例子，复制从一个起始点开始，以同一方向生长出两条链，形成一个复制叉。两点开始单向复制，腺病毒DNA的复制是从两个起点开始的，形成两个复制叉，各以一个单一方向复制出一条新链。⑶DNA复制起始的识别和双链的解开复制起始点具有的特定结构(4个9bp的重复序列)能被DnaA蛋白辨认结合，DnaB蛋白具有解螺旋作用，DnaC蛋白是DnaB蛋白结合于起始点，DNA双链局部被打开，引物酶和其他蛋白加入形成引发体。(4)引物的合成引发体的移动方向与复制叉移动的方向一致，移动到能够到一定位置即可引发RNA引物的合成，移动和引发均需ATP提供能量。引发体中的引发酶催化合成一个低聚RNA引物，由引物提供3'-OH,使复制开始进行。前导链和滞后链均由引物酶合成引物，滞后链在复制中需要多次合成引物。引物的第一个核甘酸通常是pppA,个别为pppG,其长度约为10个核甘酸。整个DNA复制过程中，只有复制起始受细胞周期的严格调控。DNA甲基化与DNA复制起始密切相关。复制起始可能还受ATP水解过程调控，因为DnaA只有与ATP相结合时才能与oriC区DNA结合。DNA复制发生在细胞有丝分裂的间期和减数第一次分裂前的间期。DNA复制的不同方式1、DNA复制时大多是双向进行，形成两个复制叉或生长点。也有单向的，只形成一个复制叉或生长点。2、对称复制：两条链同时进行复制。不对称复制：一条链复制后再进行另一链的复制。环形DNA复制时在显微镜下可以看到形如眼形的。型结构。3、P25图2-9显示了DNA不同复制方式。人：。型单向8：。型双向C：直线双向 D：多起点双向E：滚动环F：D环G：2D-环。4、细菌DNA复制叉移动速度大约为5万bp/分，E.coli完成复制40分钟，在丰富培养基中20分钟即可分裂一次。DNA链的延伸大肠杆菌中DNA复制的主要过程靠DNAPolIII起作用，按照与模板碱基互补配对的原则，在polIII的作用下，逐个加入脱氧核糖核酸，使DNA链延长。DNApolI的即时校读、polIII的碱基选择功能，使复制具有保真性，而DNAPolII在DNA修复中起作用。DNA双链是方向平行的，在复制叉解开的DNA模板链是5’f3,方向，另一条是3‘一5,方向，而所有已知DNA聚合酶的合成方向都是5‘f3,。为了解释DNA的两条链能够同时复制，日本学者冈崎(Okazaki)等提出了DNA的半不连续复制(semidiscontinuousreplication膜型。定义：在DNA复制过程中，以3'f5'链为模板时，新生的DNA链以57-3,方向连续合成，链合成方向与解链方向一致，成为前导链；而以57一37链为模板合成方向互补的新链时，只能先合成小片段DNA(岗崎片段)，然后再由连接酶将多个冈崎片段连成完整的新链，这一新链的合成方向与解链方向相反，且合成是不连续进行的，故称为滞后链。这种复制方式称之为半不连续复制。由于亲代DNA双链在复制时是逐步解开的，因此，滞后链的合成也是一段一段的。DNA在复制时，由滞后链所形成的一些子代DNA短链称为冈崎片段(Okazakifragment)。冈崎片段的大小，在原核生物中约为1000〜2000个核甘酸，而在真核生物中约为100个核甘酸。DNA链的终止大肠杆菌为环状双链DNA,双向复制，它的两个复制叉的汇合点就是复制的终止位点(terminusregion,ter)。当子链延伸达到ter时，DNA复制就终止了。由RNA酶切去前导链和滞后链的引物，引物留下的空隙由DNApolI催化填补，最后，DNA连接酶有ATP功能，将两个片段连接成为连续的子链，复制完成。大肠杆菌的ter含有7个约23bp共有序列(终止子，terminator)，分别称为terA-terG。此处可以结合一种特异的蛋白质分子叫做Tus(terminusutilizationsubstance)，这个蛋白质可能是通过阻止解链酶(helicase)的解链活性而终止复制。当复制叉前移，遇到Ter位点时，Ter-Tus复合物能阻止复制叉的继续前移，等到相反方向的复制叉到达后，在DNA拓扑异构酶W的作用下，使复制叉解体，释放子链DNA。真核生物DNA复制的特点(1)复制起始点及复制速度：真核生物DNA复制有许多起始点，原核生物只有一个；真核生物在完成全部复制之前，各个起始点上DNA的复制不能在开始，原核生物起始点上可以连续开始新的DNA复制；真核生物复制速度是原核生物的1/20,但复制起始点多，且真核生物中复制是从许多起始点同时开始的，即有许多个复制子，可以进行分段复制，所以真核生物复制的总速度可能比原核生物的快DNA聚合酶：真核生物的复制需要DNA聚合酶及多种蛋白质因子的参加，真核生物DNA聚合酶主要有a、B、y、8和£五种其中pola、pol3在核内其主要作用，polY为线粒体复制酶，pole是一种修复酶。另外，真核生物的pol3需要与一种称为增殖细胞核抗原(proliferationcellnuclearantigen,PCNA)的复制因子结合。PCNA相当于大肠杆菌polIII的B亚基，能形成一个环状夹子，以增加聚合酶的持续合成能力。在真核生物的复制中，还有两个蛋白质因子参与：复制蛋白A(replicationproteinA,RP-A)是真核生物的单链结合蛋白，相当于大肠杆菌的复制因子C(replicationfactorC,RF-C)是夹子装置器，相当于大肠杆菌的Y复合物，可促使PCNA安装到DNA双链上以及拆下来，还可促使复制体的装配。RNA引物和冈崎片段：真核生物复制中的RNA引物和冈崎片段均小于原核的，引物为10个核甘酸，和成片段为100~200个核甘酸；而原核的引物为十几至几十个核昔酸，合成片段1000~2000个核昔酸(4)端粒(telomere)和端粒酶(telomerase)：端粒是指真核生物染色体线性DNA分子末端的结构部分，通常膨大成粒状。端粒结构是一段DNA序列和蛋白质形成的一种复合体，一般由多个短的富含鸟嘌吟(G)的重复序列串联而成，可长达10kb以上。人的端粒重复序列为TTAGGG,长达15kb。主要功能：保证线性DNA的完整复制；保护染色体末端不受核酸酶水解和不发生染色体的异常重组；决定细胞的寿命。端粒酶是真核生物体内存在的一种特殊的逆转录酶，由蛋白质和RNA两部分组成。功能：以自身的RNA为模板，逆转录端粒，从而填补DNA复制中5'末端由于引物RNA的水解而可能出现的空缺。线粒体DNA的复制真核生物除了细胞和染色体外，还有一类存在于细胞之内的非基因组DNA,即线粒体DNA(mitochondrialDNA)和叶绿体DNA。二者均为环状DNA,其转录和翻译的特点与原核细菌也非常相似。线粒体DNA的复制机制是一类称为置换型环状结构或D-环(D-loop)复制的特殊复制方式，复制过程也遵循半保留复制的原理，由真核DNA聚合酶Y负责。RNA种类及其特点细胞RNA通常是线性单链分子，但病毒RNA有双链、单链、环状、线形等多种形式。单链RNA分子可自身回折形成局部双螺旋(二级结构)，进一步折叠(三级结构)。除tRNA外，几乎所有RNA都与蛋白质形成核蛋白复合物(四级结构)。参与蛋白质合成的RNA有tRNA、rRNA和mRNA三类。此外，RNA还有多种功能，几乎涉及细胞功能的所有方面。tRNA的结构及功能tRNA在蛋白质合成中处于关键地位，被称为第二遗传密码。它不但为每个三联体密码翻译成氨基酸提供了接合体，还为准确无误地将所需氨基酸送到核糖体上提供了载体。tRNA的分子质量一般在25~30kDa范围，有73~93个核昔酸组成，其中含有大量稀有碱基，如假尿嘧啶核昔（2）、二氢尿嘧啶（D）和胸腺嘧啶（T）核昔等。tRNA的三叶草型二级结构tRNA的二级结构十分稳定，都呈三叶草型，具有以下特点：1）氨基酸接受臂：由7对碱基组成，3'含有CCA-OH序列，接受活化的氨基酸2）T2C环：由7个不配对的碱基组成，环中含5'GT2C3'序列，可与核糖体表面结合，通过5对碱基组成的T2C臂与tRNA的其余部分相连。3）额外环或可变环：碱基种类和数量高度可变，在3~18个不等，富含稀有碱基。4）反密码环：由7个不配对的碱基组成，处于中间位的3个碱基为反密码子，可识别mRNA的密码子，由5对碱基组成的反密码臂相连。5）二氢尿嗑咤环（D环）：由8~12个不配对的碱基组成，具有2个二氢尿嘧啶。通过3-4对碱基组成的二氢尿嘧啶臂（DHU臂）与分子的其余部分相连。tRNA的三级结构一一倒L形tRNA的功能：活化、搬运氨基酸到核糖体，参与蛋白质的翻译。tRNA的种类及功能.起始tRNA和延伸tRNA：起始tRNA指能特异性地识别mRNA模板上起始密码子的tRNA,其他统称为延伸tRNA。原核生物起始tRNA携带甲酰甲硫氨酸（fMet）,真核生物起始tRNA携带甲硫氨酸（Met）.同工tRNA：由于一种氨基酸可能有多个密码子，为了识别也就有多个tRNA,即多个tRNA转运一种氨基酸，这些tRNA就称为同工tRNA。同工tRNA既要有不同的反密码子以识别该氨基酸的各种同义密码，又要有某种结构上的共同性，能被氨基酸-tRNA合成酶识别。.校正tRNA：分为无义变和错义突变校正1）无义突变：在蛋白质的结构基因中，一个核甘酸的改变可能使代表某个氨基酸的密码子变成终止密码子（UAG、UGA、UAA）,使蛋白质合成提前终止，合成物功能的和无意义的多肽，这种突变称为无意义突变（无义突变）。tRNA可通过改变反密码子区校正无义突变。2）错义突变：于结构基因中一个核甘酸的变化，导致一种氨基酸的密码变成另一种氨基酸的密码，合成无功能的多肽，叫错义突变。tRNA可通过反密码子区的改变把正确的氨基酸加到肽链上，合成正确的蛋白质。最常见的tRNA分子有76个碱基，相对分子量约2.5X104。不同的tRNA分子可有74〜95个核甘酸不等，tRNA分子长度的不同主要尤其中的可变环引起的。tRNA的稀有碱基含量非常丰富，约有70余种。每个tRNA分子至少含有2个稀有碱基，最多19个，多数分布在非配对区，特别是在反密码子3'端临近部位出现的频率最高，且大多为嘌吟核苷酸。这对于维持反密码环的稳定性及密码子、反密码子之间的配对是很重要的。rRNA的结构及功能rRNA占细胞内总RNA量的80%,rRNA的功能是组成核蛋白体（核糖体），为蛋白质的合成提供场所。原核生物和真核生物核糖体均由易于解聚的大、小亚基组成，每个亚基分别由几种rRNA和数十种蛋白质组成。核糖体包括至少5个活性部位，即mRNA结合部位、氨基酸-tRNA结合或接受部位(A位)、肽基-tRNA结合或接受部位(P位)、形成肽键部位(转肽酶)，此外还有负责肽链延伸的各种延伸因子的结合位点小亚基上：mRNA结合位点，负责对序列特异的识别过程大亚基上：A位、P位、转肽酶，负责氨基酸及tRNA携带的功能mRNA的结构及功能mRNA在细胞内只占总RNA的1%〜2%，mRNA代谢很快，细菌mRNA平均半衰期只有2min，真核mRNA半衰期较长，平均为5h。mRNA的种类很多，每一种mRNA的相对分子量及碱基序列都不同。功能：通过三联体密码翻译成蛋白质原核和真核生物的mRNA在结构上的区别1、生物mRNA与相应的基因是共线的，并且是多顺反子；真核是单顺反子，转录产物是hnRNA(核不均一RNA，heterogeneousnuclearRNA)。2、mRNA的5'末端加上一个m7pGpppNm4g子结构，可使mRNA免遭核酸酶的降解，起到保护和稳定性的作用；可使mRNA能与核糖体小亚基结合并开始合成蛋白质；可被蛋白质合成的起始因子所识别，从而促进蛋白质合成。3、mRNA的3'末端具有多聚腺甘酸(polyA)尾巴，可能与增加转录活性及稳定mRNA有关。其他RNA细胞核RNA(nuclearRNA,nRNA)：核不均一RNA(hnRNA),是真核mRNA的前体。与mRNA之间的主要差别：①nRNA的多核甘酸链中的一些片段将不出现于相应的mRNA中，这些片段称为内含子(intron),而那些保留于mRNA中的片段称为外显子(exon)。②RNA具有5'端帽子和3'端尾巴的结构和功能小核RNA(smallnuclearRNA,snRNA)核仁小RNA(sonRNA)DNA的损伤与修复DNA损伤：一切使DNA结构和功能发生改变的DNA变化，如碱基脱落、碱基修饰、交联、链的断裂和重组、突变等。维护DNA遗传信息的稳定性对生物细胞来说是极其重要的。生物体对DNA损伤的修复系统主要有以下6种：1、聚合酶的“校正”修复DNA复制具有非常高的精确度，平均每复制109个核甘酸，才出现一个核甘酸的差错。虽然复制是以碱基的精确互补配对为基础，但碱基配对有时仍然会出错。DNA聚合酶的“校对”机制可不断地纠正复制过程中可能出现的差错。DNA聚合酶在复制DNA时，首先对新参与合成的核甘酸要进行筛选；其次对错误参入的核甘酸则利用其3'5'外切酶活性进行切除，使得DNA复制中出现错配的概率大大减少。另外，DNA聚合酶5'3'合成方向也是确保SNAT复制准确的机制之一。2、光复活修复光复活修复(PhotoreactivationRepair)作用是一种高度专一的DNA直接修复①irectRepair)过程，它只作用于紫外线引起的DNA嘧啶二聚体(主要是TT也有少量CT和CC)。光复活酶在生物界分布很广，从低等单细胞生物一直到鸟类都有，而高等的哺乳类却没有。A嘧啶二聚体B.合酶结合于损伤部位C见光激活D.复后释放酶3、切除修复切除修复(excisionrepair):在一系列酶的作用下，将DNA分子中受损伤部分切除，并以完整的那一条链为模板，合成出切去部分，DNA恢复正常结构。1)碱基切除修复(baseexcisionrepair)：小段DNA损伤的修复。DNA聚合酶、DNA糖甘酶、内切酶和连接酶等参与2)核苷酸切除修复(nucleotide-excisionrepair)：大段DNA损伤的修复。核酸酶、DNA聚合酶I、DNA聚合酶3或e等参与4、重组修复光复活修复和切除修复是先修复，后复制，又称为复制前修复，而重组修复(recombinationrepairing)是复制后修复，是用DNA重组的方法修复DNA损伤。重组修复至少需要4种酶组分。重组基因recA编码一种分子量为40000的蛋白质，它具有交换DNA链的活力。RecA蛋白被认为在DNA重组和重组修复中均起关键作用。recB、recC基因分别编码核酸外切酶V的两个亚基。此外，修复合成还需要DNA聚合酶和连接酶。复制，损伤的DNA仍可复制，但复制到损伤部位时，子链就出现了缺口；重组，从完整的母链将相应的片段移到缺口，而母链上形成缺口；填补和连接，母链上的缺口由DNA聚合酶进行填补合成，最后由DNA连接酶连接。5、错配修复错配修复(mismatchrepair)是一种特殊的核甘酸切除修复，用来切除复制中新合成DNA链上的错配基因。通过错配碱基的修复将使复制的精确性提高102〜103倍。复制错配中的错配碱基存在于新合成的子代链中，错配修复是按模板的遗传信息来修复错配碱基的，因此，该修复系统必须有一种能在复制叉通过之后识别模板链与新合成DNA链的机制，以保证只从新合成的DNA链中去除错配碱基。利用腺嘌吟甲基化酶(Dam甲基化酶)和胞嘧啶甲基化酶甲基化腺喋吟和胞喀咤。在复制完成后的暂短时间内(几秒或几分钟)，只有模板是甲基化的，而新合成的链是非甲基化的。暂时甲基化的DNA链可以作为识别标志，使存在于GATC等序列附近的复制错配将按亲代链为模板进行那个修复。一旦两条链豆被甲基化，错配修复过程几乎不再发生。错配修复是一个非常耗能的修复过程，错配的碱基离5'-GATC等序列越远，配切除的核昔酸就越多，重新合成新链消耗的dNTP就越多。碱基错配修复对DNA复制忠实性的贡献极大，DNA子链中的错配几乎完全都被修正。6、SOS修复SOS修复(SOSrepair)又称差错倾向修复(errorpronerepair),是细胞DNA受到严重损伤或DNA复制系统受到抑制的紧急情况下，为求得生存而出现的一系列诱导性修复。SOS反应是由RecA蛋白和LexA阻遏物相互作用引起的。当DNA受损伤时生成足够量的RecA蛋白，然后RecA蛋白水解LexA蛋白而是许多与修复有关的基因激活。SOS反应广泛存在于原核生物和真核生物，它是生物在极为不利的环境中求得生存的一种基本功能。原核生物与真核生物复制的不同.原核生物的复制是单起点，而真核生物的DNA复制是多起点的。.原核生物的复制速度比较快，而真核生物的复制比较慢。.原核生物的DNA在未完成一条双链的复制之前可以开始下一轮的复制，但真核生物不可以。4..原核生物和真核生物完成复制需要的酶不同。5.原核生物完成复制的区域在类核区，真核生物的复制在细胞核内。第三章基因转录与调控基因(gene)是核酸分子中贮存遗传信息的遗传单位，是指贮存有功能的蛋白质多肽链或RNA序列信息及表达这些信息所必须的全部核甘酸序列。按照这个定义，一个基因不仅包括编码蛋白质肽链或RNA的核酸序列，还包括保证转录所必需的调控序列。一个细胞所携带的全部遗传信息或整套基因，称为基因组。原核生物基因组原核生物的基因组比较小，通常仅由一条环状双链DNA分子组成。原核生物的基因组虽然与蛋白结合，但并不形成染色体结构，只是习惯上仍将之称为染色体。细菌染色体DNA在细胞内形成一个致密区域，即类核(nucleoid)，类核无核膜。有些细菌还含有存在于细胞质中的小型环状双链DNA，染色体外的DNA也可能含有遗传信息，可以进行自我复制，并将遗传信息传递给子代细胞。操纵子结构是原核基因组的一个突出的结构特点操纵子(operon)：是转录的功能单位，指多个功能上相关的结构基因串联在一起，由一个共同的控制区进行转录的控制，包括结构基因以及调节基因的整个DNA序列。操纵子结构提供了另一个简洁的方法，保证当其中一个基因被转录时，其他具有相关功能的基因也被转录。在原核细胞中，通常是几种不同的mRNA连在一起，相互之问由一段短的不编码蛋白质的间隔序列所隔开，这种mRNA叫做多顺反子mRNA。这样的一条mRNA链含有指导合成几种蛋白质的信息。单顺反子(monocistron)：真核基因转录产物为单顺反子，即一种基因编码一种多肽链或RNA链，每个基因转录有各自的调节元件。一个典型的例子是乳糖操纵子，它由细菌细胞中3个涉及乳糖代谢的基因组成(B半乳糖甘酶、半乳糖背透酶、转乙酰基酶)。操纵子的转录合成了一个长的多顺反子mRNA分子，其中包含了翻译3种酶蛋白所需要的编码信息。真核生物基因组真核生物基因组的规模远大于原核生物基因组，组织复杂，信息含量高。在整个DNA序列中蛋白质编码区域仅占小部分，而非编码序列则占了很大一部分。1、结构基因大多数真核生物基因都是由蛋白质编码序列和非蛋白质编码序列两部分组成的。基因中的编码序列称为外显子(exon),而基因中的非编码序列称为内含子(intron)。在一个结构基因中，编码某一蛋白质不同区域的各个外显子并不是连续地排在一起的，而是经常被长度不同的内含子所隔离，形成镶嵌排列的断裂方式，所以真核基因有时被称为断裂基因。外显子和内含子构成结构基因，在转录时一起转录下来，内含子随后被切除。外显子-内含子链接区是具有高度保守性和特异性的碱基序列。这一保守序列与剪切机制密切相关，它是RNA剪切的信号序列。几乎每个内含子5'端起始的两个碱基都是GU,3'端最后的两个碱基总是AG。由于这个碱基序列的高度保守性和广泛性，有人将它称为GU-AG法则。但是，在线粒体基因中不存在这类保守序列。2、顺式作用元件顺式作用元件或称顺式调控元件，是指那些与结构基因表达调控相关、能够被基因调控蛋白特异性识别和结合的DNA序列。包括启动子、增强子、沉默子、终止子和一些反应元件等。一些蛋白质因子可通过结合顺式作用元件而调节基因转录活性。1)启动子(promoter)是指RNA聚合酶结合并启动转录的DNA序列2)增强子(enhancer)是一类能促进基因转录活性的顺式调控元件，但它本身不具备启动子的活性。增强子一般能使转录频率增加10〜200倍，具有以下几个显著的特征：①增强子的位置不固定，可以是在某个基因的5'-端上游，也可以是在3'-端下游，甚至可以在基因的内含子内。②增强子的序列较长，可达数百个碱基对，有时是重复序列，其内部常含有一个核心序列“(G)TGGA/TA/TA/T(G)'。③增强子的作用距离比较远，可以远离它所作用的基因达数千个碱基之远。④增强子的作用与其序列的正反方向无关，将增强子方向倒置依然能起作用。⑤增强子要有启动子才能发挥作用，没有启动子存在，增强子不能表现活性。3)沉默子(silencer)是一类与特异蛋白因子结合时对基因转录起阻遏作用的负调控元件沉默子：最早在酵母中发现，以后在T淋巴细胞的T抗原受体基因的转录和重排中证实这种负调控顺式元件的存在，当其结合特异蛋白因子时，对基因转录起阻遏作用。沉默子的作用可不受序列方向的影响，也能远距离发挥作用，并可对异源基因的表达起作用。3、DNA重复序列在真核细胞基因组中，某些序列有相同的拷贝，称为重复序列。1)单拷贝序列:在整个基因组中只有一个或几个拷贝的序列称单拷贝序列。约占基因组的60〜65%。2)中度重复序列:中度重复序列的长度300〜400bp，在基因组中的重复次数在102〜105之间。如人类Alu重复序列，占人类基因组的3〜6%,长300bp,重复达30〜50万次3)高度重复序列①卫星DNA(satelliteDNA)重复序列的长度较长，可达200b②小卫星DNA(minisatelliteDNA)重复序列的长度从5个bp③微卫星DNA(microsatellitDNA)重复序列的长度在2〜6bp4、多基因家族多基因家族是真核细胞基因组中来源相同、结构相似、功能相关的一组基因，是由一个祖先基因经重复和变异形成的，是真核生物基因结构中最显著的特征之一。如rRNA、免疫球蛋白基因等。真核细胞的转录转录(transcription)是以DNA为模板，以4种NTP为原料，依碱基配对规律，由DNA指导的RNA聚合酶催化下合成RNA的过程。转录过程真核生物的一个转录单位就是一个基因，由一个结构基因和相应的顺式调控元件组成。转录过程包括：①转录的起始；②RNA链的延伸；③转录的终止。真核生物RNA聚合酶的三种类型，各自催化合成不同的RNA,所催化的转录起始和终止阶段又各有特点，目前对转录起始阶段了解较多，而对终止阶段却知之甚少。一、转录的起始真核生物转录起始时，必须有一些蛋白质因子参与，称为转录因子(transcriptionfactors,TF)。三种类型的RNA聚合酶分别负责三种RNA转录的起始：RNA聚合酶I的转录产物是rRNA,RNA聚合酶H的转录产物是mRNA前体，RNA聚合酶O的转录产物是tRNA和5sRNA.在一条具有TATA启动子的基因上游，先由TAF和TBP结合上去，依次结合上去TFIIA、TFIIB、TFIIF及未磷酸化的CTD的RNApolll,TFIIE、H、J最后结合在这个复合物上。CTD被TFIIH磷酸化。二、RNA链的延伸当转录起始复合物形成后，在位的RNA聚合酶即开始依碱基配对关系，按模板链的碱基序列，从5,f3’方向逐个加入核糖核甘酸。三、转录的终止RNA聚合酶I转录出rRNA前体3,末端后，继续向下游转录超过1000个碱基，此处有一个18bp的终止序列，在辅助因子的作用下转录终止。RNA聚合酶HI转录模板的下游存在一个终止子，该终止子是位于GC丰富序列之中的TTTT。RNA聚合酶H有内源性的转录终止功能，能识别终止子，使转录终止。RNA聚合酶H转录出AAUAAA,聚腺甘酸特异因子（CPSF）能识别它并与之结合。在CPSF以及切割活化因子（CstF）等因子的作用下，特异的核酸内切酶在AAUAAA下游11〜30核甘酸处切断RNA链，mRNA前体的转录即告终止。转录产物的加工真核细胞基因转录要比原核细胞复杂得多，真核细胞中转录形成的RNA前体分子通常需要经过复杂的加工修饰过程才能成为成熟的功能形式。一、mRNA转录后加工mRNA是三种RNA中唯一具有编码蛋白质功能的RNA分子，其前体是结构基因在RNA聚合酶H催化下转录形成的。由于前体分子的大小各不相同，被称为核不均一 RNA（heterogeneousnuclearRNA,hnRNA）,hnRNA需要经过剪切修饰成为成熟的mRNA,才能进入细胞质进行蛋白质合成。真核生物mRNA的加工过程主要包括5,端戴帽、3,端加尾、剪接、编辑、化学修饰等。二、rRNA转录后加工真核细胞中rRNA的加工途径切除5,端的前导序列；从41S的中间产物中先切下18S的片段。Hela细胞的切点在18S和5.8S之间的ITS（内部转录间隔序列）；L细胞的切点在18S序列和ITS的交界处，称为先成熟。部分退火，形成发夹结构；最后修正。三、tRNA转录后的加工修饰真核生物tRNA前体的加工也颇为复杂，包括剪接去除内含子、剪切5,端先导序列、添加或修复3,端CCA以及碱基的化学修饰等。.tRNA前体的剪接.添加或修复3/端CCA序列.化学修饰（甲基化反应使某些嘌吟生成甲基嘌呤；通过还原反应使某些尿嘧啶还原为双氢尿嘧啶（DHU）；通过核昔内的转位反应使尿嘧啶转变为假尿嘧啶核甘（中）等）真核细胞表达调控基因表达是指生物基因组中结构基因所携带的遗传信息经过转录、翻译等一系列过程，合成特定的蛋白质，进而发挥其特定的生物学功能和生物学效应的全过程。但并非所有基因表达过程都产生蛋白质（rRNA、tRNA）。整个基因表达的过程分为基因活化、转录、转录后加工、翻译、翻译后加工等。在上述各个环节中均存在着基因表达调控的控制点。与原核生物比较，真核生物的基因组更为复杂，可列举如下：♦真核基因组比原核基因组大得多，大肠杆菌基因组约4X106bp,哺乳类基因组在109bp数量级，比细菌大千倍；大肠杆菌约有4000个基因，人则约有10万个基因。♦真核生物主要的遗传物质与组蛋白等构成染色质，被包裹在核膜内，核外还有遗传成分（如线粒体DNA等），这就增加了基因表达调控的层次和复杂性。♦原核生物的基因组基本上是单倍体，而真核基因组是二倍体。♦细菌多数基因按功能相关成串排列，组成操纵子的基因表达调控的单元，共同开启或关闭，转录出多顺反子801丫&$仃0磔的mRNA；真核生物则是一个结构基因转录生成一条mRNA，即mRNA是单顺反子（monocistron），基本上没有操纵子的结构，而真核细胞的许多活性蛋白是由相同和不同的多肽形成的亚基构成的，这就涉及到多个基因协调表达的问题，真核生物基因协调表达要比原核生物复杂得多。♦原核基因组的大部分序列都为基因编码，而核酸杂交等实验表明：哺乳类基因组中仅约10%的序列为蛋白质、rRNA、tRNA等编码，其余约90%的序列功能至今还不清楚。♦原核生物的基因为蛋白质编码的序列绝大多数是连续的，而真核生物为蛋白质编码的基因绝大多数是不连续的，即有外显子（exon）和内含子（intron），转录后需经剪接（splicing）去除内含子，才能翻译获得完整的蛋白质，这就增加了基因表达调控的环节。♦原核基因组中除rRNA、tRNA基因有多个拷贝外，重复序列不多。哺乳动物基因组中则存在大量重复序列（repetitivesequences）o真核细胞表达调控的特点（一）真核基因表达调控的环节更多基因表达是基因经过转录、翻译、产生有生物活性的蛋白质的整个过程。同原核生物一样，转录依然是真核生物基因表达调控的主要环节。但真核基因转录发生在细胞核（线粒体基因的转录在线粒体内），翻译则多在胞浆，两个过程是分开的，因此其调控增加了更多的环节和复杂性，转录后的调控占有了更多的分量。（二）真核基因的转录与染色质的结构变化相关真核基因组DNA绝大部分都在细胞核内与组蛋白等结合成染色质，染色质的结构、染色质中DNA和组蛋白的结构状态都影响转录，至少有以下现象：.染色质结构影响基因转录.组蛋白发生变化.转录活跃的区域也常缺乏核小体的结构.转录活跃区域对核酸酶作用敏感度增加.DNA碱基修饰变化（三）真核基因表达以正性调控为主真核RNA聚合酶对启动子的亲和力很低，基本上不依靠自身来起始转录，需要依赖多种激活蛋白的协同作用。真核基因调控中虽然也发现有负性调控元件，但其存在并不普遍；真核基因转录表达的调控蛋白也有起阻遏和激活作用或兼有两种作用者，但总的是以激活蛋白的作用为主。即多数真核基因在没有调控蛋白作用时是不转录的，需要表达时就要有激活的蛋白质来促进转录。换言之：真核基因表达以正性调控为主导。转录水平的调控调控作用主要是通过反式作用因子、顺式作用元件和RNA聚合酶的相互作用完成的反式作用因子结合顺式作用元件后影响转录起始复合物的形成一、转录起始复合物的形成（TATA复合物）在转录起始复合物形成过程中，RNA聚合酶与启动子的结合是关键的转录因子是RNA合成起始所必需的因子转录起始复合物的形成过程1口尸11结合TATA^；.RNA聚合酶识别并结合TFIID-DNA复合物；.其他转录因子与RNA聚合酶结合，转录起始部位的DNA解链，形成转录起始复合物，开始转录二、反式作用因子(称转录因子)反式作用因子的定义(转录因子、反式因子)：是一类在细胞核内发挥作用的蛋白质因子在转录调控过程中，反式作用因子的作用主要是促进或抑制TFIID与TATA盒结合、RNA聚合酶与TFHD-DNA复合物结合以及转录起始复合物的形成分为两类：基本转录因子：是RNA聚合酶结合启动子所必需的一组因子，决定三种RNA转录的类别特异转录因子：为个别基因转录所必需，决定基因的时间、空间特异性表达，包括转录激活因子和转录抑制因子反式作用因子的主要特点是：①能识别并结合上游调控区中顺式作用元件的特异靶序列。②对基因表达具有正性调控和负性调控作用，即可激活或阻遏基因的表达。③他们必须具备识别与结合特定DNA序列或与RNA聚合酶、其他转录因子结合进行作用的能力，所以反式作用因子一般有三个功能结构域：DNA结合域、转录激活域、结合其它蛋白质的结合域。顺式作用元件与反式作用因子的相互作用1.反式作用因子与顺式作用元件的结合：大部分反式作用因子在激活后与顺式作用元件结合，但也可能有一些反式作用因子是先结合DNA,被激活后才发挥调节功能。在不同的基因中，存在着同样的顺式作用元件，增强子和上游启动子元件可以结合一些相同的蛋白质，表明一些数量有限的基因调节蛋白控制着真核细胞的基因表达。目前发现的反式作用因子中常显示以下几种DNA结合域。①a螺旋-转角-a螺旋结构域(helix-turn-helixmotif)其中一个为识别螺旋，含有较多能与DNA相互作用的AA残基，进入DNA双螺旋的大沟中。②螺旋-环-螺旋结构域(helix-loop-helixmotif)由3部分组成：两端为既亲水又亲脂的两性a螺旋区，中间是一个或几个B转角组成的环区③锌指结构域(zincfingermotif)约有30个AA残基，其中4个AA残基(可以是2个Cys,2个His或4个均是Cys)与Zn2+以配位键相互作用，形成s,与DNA双螺旋大沟结合。④亮氨酸拉链结构域(leucinezippermotif)一段肽链中每隔6个氨基酸即有一个Leu,该肽段所形成的螺旋就可出现疏水及亲水二个平面，由Leu组成的疏水面即为亮氨酸拉链。二个具亮氨酸拉链的反式因子可形成二聚体(同二聚体、异二聚体)。亮氨酸拉链不直接与DNA相互作用，拉链区以外结构参与DNA结合2.反式作用因子的作用方式：反式作用因子在增强子中的结合位点通常与其所调控的基因相距较远，在上游启动子中的结合位点也与RNA聚合酶结合位点有一定距离。3.反式作用因子的组合式调控作用：反式作用因子结合顺式作用元件后激活转录，有时则抑制转录。每一种反式作用因子结合顺式作用元件后虽然可发挥促进或抑制作用，但反式作用因子对基因表达的调控不是由单一因子完成的，而是几种因子的组合，发挥特定的作用，称为组合式基因调控。前体mRNA转录和加工mRNA前体hnRNA需经历转录后加工、由胞核运至胞浆等过程，方能作为模板参加蛋白质生物合成。对这一系列过程的调节也可控制某些基因的表达。一、hnRNA加工成熟的调节hnRNA是在核内进行加工修饰的。加工过程包括加帽、加尾、剪接、碱基修饰和编辑等。其中剪接和RNA编辑对某些基因的调节有一定的意义。.剪接过程控制一些蛋白质的表达真核细胞转录单位有单纯型和复合型。复合型转录单位转录产物可以进行不同方式的剪接（选择性剪接），参加拼接的外显子可以不按其在基因组的线性分布次序进行拼接，内含子也可以不被切除而保留，即一个外显子或内含子是否出现在成熟的mRNA中是可以选择的，这种剪接方式称为选择性剪接。选择性剪接常常在一定机制调节下以细胞类型特异性方式进行，即一种mRNA在一种细胞或组织表达，而另一种mRNA在另外一种细胞或组织中表达。.RNA编辑调节某些蛋白质的功能RNA编辑的转录后加工过程是mRNA前体加工过程中另一可调节点。通过RNA编辑，成熟mRNA的序列已与基因组DNA相应外显子部分有所区别，指导生成的蛋白质结构不再完全由基因中的核甘酸序列决定。RNA编辑在一些较低等真核生物如原生动物线粒体、植物及其叶绿体中广泛存在，而且有些mRNA经过编辑序列改变可达50%以上。在高等真核生物，RNA编辑非常少见，而且编辑仅涉及单个核昔酸的改变。二、mRNA运输、胞浆内稳定性的调节RNA无论在核内进行加工、由胞核运至胞浆，还是在胞浆内停留（至降解）都是与蛋白质结合形成核蛋白体复合物（RNP）。mRMA的运输、在胞浆中的稳定性等均与某些蛋白质成分有关。翻译水平的调控翻译水平的调控机制，一般都是通过细胞质中特异的mRNA和多种蛋白质之间的相互作用实现的。 蛋白质的翻译不仅与其mRNA编码序列有关，并受5'和3'端的非编码区（5’UTR和3'UTR）结构的控制一、mRNA的细胞质定位5’非编码区从mRNA起点的甲基鸟嘌吟核昔帽延伸到AUG起始密码子，而3,非编码区从编码区末端的中止密码子延伸至多聚A尾巴的末端。控制mRNA在细胞质中定位的信息位于3,非编码区，虽然mRNA定位的机制还不很清楚，但可以认为是通过识别mRNA中定位序列的蛋白质所介导的。微管和微丝与细胞中特定部位的mRNA的聚集有一定关系，微管主要涉及转运mRNA到细胞质特定部位，而微丝的作用则被认为是用来锚定已达到目的地的mRNA。二、mRNA翻译的调控蛋白质生物合成过程很复杂，涉及众多成分。目前发现的一些调节点主要在起始阶段和延长阶段，尤其是起始阶段。.mRNA5端非编码区长度对翻译的影响当第一个AUG密码子离5,端帽子的位置太近时，不容易被40S亚基识别。当第一个AUG密码子离5/端帽子结构的距离在12个核甘酸以内时，有一半以上的核糖体40S亚基会滑过第一个AUG；当5/端非编码区长度在17〜80个核甘酸之间时，体外翻译效率与其长度成正比。所以，第一个AUG至5/端之间的长度可影响翻译起始效率和翻译起始的准确性。.翻译起始因子（eIF）活性的调节通过磷酸化调节起始因子活性对起始阶段有重要的控制作用。如eIF-2亚基的磷酸化使得鸟甘酸交换因子（GEF,又称eIF-2B）与非活化状态的eIF-2-GDP紧密结合在一起，妨碍了eIF-2的循环利用，从而影响eIF-2-GTP-Met-tRNAfmet前起始复合物的形成，抑制了蛋白质合成的起始。eIF-4E在mRNA与核蛋白体结合过程中至关重要，决定着起始复合物能否形成及合成开始。它含有帽结合结构区，通过与mRNA5/端帽结构结合促进核蛋白体小亚基结合于mRNA翻译起始点部位。三、mRNA稳定性的调节mRNA的半衰期可影响蛋白质合成的量，通过调节某些mRNA的稳定性，即可使相应蛋白质合成量受到一定程度的控制。早期实验证明，缺乏polyA尾的mRNA注射到细胞内后迅速降解，然而，同样的mRNA因拥有polyA尾而相对稳定，提示mRNA寿命与它的polyA尾长度有关。翻译后水平的调控从mRNA翻译合成蛋白质，并不意味着基因表达的调控就结束了。新生肽链合成后通常还需加工、修饰和正确折叠才能成为有功能的成熟蛋白质。其中包括：一、蛋白质折叠：二、蛋白酶切割（如胰岛素）三、蛋白质内含子：四、蛋白质的化学修饰（乙酰化、甲基化、磷酸化等）原核细胞的转录RNA聚合酶原核生物细胞中只有1种RNA聚合酶，兼有合成mRNA、tRNA和rRNA的功能。目前研究得比较透彻的是大肠杆菌RNA聚合酶，该酶由多个亚基组成：a2BB,。称为全酶，去掉。因子的部分a288,称为核心酶。转录过程一、转录的起始首先聚合酶在启动子处识别并结合在双链DNA上，随即通过解旋DNA的两条链，编码链与模板链分开，同时形成一个转录泡（transcriptionalbubble）,以便让RNA聚合酶识别模板，且有利于底物核糖核甘酸的配对。转录泡也称为转录复合物，就^NA聚合酶、DNA模板和转录产物RNA三者结合在一体的复合物（图3-16）。RNA聚合酶沿DNA链前移，RNA链也逐渐延长，DNA双链则随RNA聚合酶的移动不断小规模的展开，已转录的区段又随即复合。二、RNA链的延伸转录的延长阶段，原核生物与真核生物之间没有太大差别，只是催化的RNA聚合酶不同而已。当转录起始并合成了几个核甘酸后，。因子就从起始复合物上解离下来，解离的。因子可重新用于转录起始。随着。的脱落，核心酶构象发生改变，酶和DNA模板的结合亲和力下降，有利于RNA聚合酶沿模板向前移动。三、转录终止转录终止分为三个步骤，即RNA聚合酶停止移动，RNA从RNA聚合酶中的释放和RNA聚合酶从模板DNA上的释放等过程。通过对原核生物和噬菌体的基因序列的比较发现了转录的终止子结构。终止子是基因或操纵子的3,端特定的核甘酸序列，它具有终止转录的功能。转录产物的加工由于发现rRNA和tRNA成熟分子的5'端为单磷酸，而原始转录产物为三磷酸；成熟分子比原始转录产物小；成熟分子含有异常碱基，儿原始转录产物中没有。因此，rRNA和tRNA的转录产物必然存在一个加工过程：、rRNA前体的加工：rRNA前体的剪切，最后得到16SrRNA、23SrRNA及5SrRNA的成熟rRNA二、tRNA前体的加工：.剪切作用tRNA的剪切时，先由内切酶E和F切去3'端侧翼序列。在前体的3'端留下一个9核甘酸，然后由核酶D依次切去3'区域的7个碱基，接着由RNaseP内切5'核甘酸，生成成熟的tRNA。最后经过一系列的修饰.添加和修复3,端CCA序列tRNA3,端CCA序列是tRNA转运氨基酸时必不可少的序列。有些tRNA前体中的3,端CCA序列在经过核酸外切酶剪切时被破坏，也有些tRNA前体加工时需添加或修复这一序列。这一作用是由tRNA核酸转移酶催化完成的。.化学修饰成熟的tRNA分子中有一些稀有碱基，它们是前体中特殊位置的核甘酸在酶作用下经过化学修饰形成的。例如tRNA分子中的两个假尿嘧啶是由尿嘧啶经化学修饰产生的。原核生物基因表达调控原核生物基因表达调控的环节，主要在转录水平，其次是翻译水平。原核转录起始调控最重要的模式一一操纵子操纵子是原核转录调控的主要形式，相关的基因排列成簇，由同一个启动序列所控制，“一开俱开，一闭俱闭”，对环境条件的改变作出相应的反应，如乳糖（he）操纵子、阿拉伯糖（ara）操纵子及色氨酸。叩）操纵子等。原核基因的协调表达就是通过调控单个启动基因的活性来完成的。在很多原核操纵子系统，特异的阻遏蛋白是控制原核启动序列活性的重要因素。当阻遏蛋白与操纵序列结合或解聚时，就会发生特异基因的阻遏或去阻遏。原核基因调控普遍涉及特异阻遏蛋白参与的开、关调节机制。一、乳糖操纵子的结构大肠杆菌的乳糖（/ae）操纵子包含了乳糖代谢所需的三个结构基因Z、Y、A,它们紧密连锁在一起，形成一个基因簇，被乳糖一起诱导。这些基因按照ZYA的顺序排列，由启动子转录成多顺反子mRNA,指导合成大肠杆菌利用乳糖所需的酶类。Z基因编码含1170个氨基酸的多肽，以四聚体形式组成有活性的B-半乳糖甘酶，催化乳糖的分解；Y基因编码含260个氨基酸的半乳糖背透酶，促使环境中的乳糖进入细菌；A基因编码含275个氨基酸的转乙酰基酶，以二聚体的活性形式催化半乳糖的乙酰化。乳糖操纵子由三个结构组成：LacZ:编码B半乳糖甘酶，它可以将乳糖水解为半乳糖和葡萄糖：LacY:编码半乳糖背透性酶，它能将乳糖运送透过细菌的细胞壁：LacA:编码硫代半乳糖甘乙酰转移酶二、CAP的正性调控CAP的通用名称是分解（代谢）物基因激活蛋白（catabolicgeneactivatorprotein,CAP）在lac操纵子的启动序列上游有一段序列能与CAP特异结合，称为CAP结合位点，CAP与这段序列结合时，可使转录提高50倍原则上CAP有两种方法来激活转录：.它可能直接和RNA聚合酶相互作用，增强RNA聚合酶的转录活性.或者它作用于DNA,以某种方式改变其构象，从而帮助RNA聚合酶结合增强子对启动子有几种作用方式（1）拓朴效应：认为增强子的作用是诱导染色质结构变化，使核小体产生DNaseI敏感区，有助于双螺旋的打开，使和转录有关的蛋白质因子和DNA结合，然后再延着DNA滑向启动子；(2)滑动模型：认为增强子通过一些蛋白质因子的介导可与远距离的启动子结合，使DNA形成了一个环，从而促使远距离的启动子的转录。这一模型已得到普遍的认可。(3)成环模型：DNA的特殊序列可以和核基质结合形成侧环，使这些基因能得以表达，显示了基因表达的组织特异性。第四章基因工程基因工程(geneticengineering)是将外源DNA与载体系统连接，通过转化或转染宿主细胞使外源DNA克隆和表达，从而创造生物新品种或新物种的一项遗传学技术。工具酶工具酶：基因工程中的工具酶主要是指用于DNA和RNA分子的切割、连接、聚合、修饰、反转录等有关的各种酶系统核酸酶：能将聚核甘酸链的磷酸二酯键切断的酶核酸外切酶：能从DNA或RNA链的一端逐个水解下单核昔的酸核酸核酸内切酶：催化水解多核甘酸内部的磷酸二酯键的核酸酶限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease)：能够识别双链DNA分子上某些特殊碱基序列并且将其切开的核酸内切酶，也叫限制酶基因工程所用的限制酶都是II类限制酶II类酶的识别序列与催化特点特异识别及切割48个bp长度且具有回文序列的DNA片段，主要产生3种缺口：5'—粘性末端、3'—粘性末端、平端或钝端(平齐末端)回文序列：是指该部位的核甘酸序列呈180O旋转对称；粘性末端：是指经内切酶特异切割后产生的5'—末端突出或3'—末端突出的碱基序列相互具有互补性。同裂酶、同尾酶与可变酶其它特殊性质的1型限制酶：同裂酶(异源同工酶)、同尾酶、可变酶同裂酶又称异源同工酶。指来源不同，但具有相同的识别序列。在切割DNA时，其切割点可以是相同的，产生平头末端，称为同识同切；切割点也可以是不同的，产生3'或5'粘性末端，称为同识异切。同尾酶指来源不同，但识别与切割顺序有一定的相关性的一类酶。它们作用后产生相同的粘性末端。可变酶识别顺序中的一个或几个碱基是可变的，并且识别顺序往往超过6个碱基对。酶的星号活性酶的星号活性：当反应条件改变时，第二类限制性内切酶的专一性可能会降低，以致同一种酶可识别和切割更多的位点pH或离子状况的改变直接影响酶的活性，因此，为了得到一种限制性内切酶的最适反应速度和理想的消化专一性，必须坚持应用推荐的反应条件。DNA聚合酶DNA聚合酶IE.ColiDNA聚合酶I(DNApolI)(全酶)是一个具有3种酶活性的多功能性酶。包括：5'-3'DNA聚合酶活性、5'-3'核酸外切酶活性、3'-5'核酸外切酶活性DNApolI应用⑴催化DNA缺口平移反应，制备高比活性DNA探针；⑵第二条cDNA链的合成；⑶对DNA3’突出末端进行标记；⑷DNA序列分析。逆转录酶特点：逆转录酶是一个多功能性酶，至少具有以下3种酶活性：⑴以单链RNA为模板，催化合成cDNA单链⑵具有RNaseH活性，能水解RNA:DNA杂交链中的RNA⑶以DNA为模板，催化合成cDNA双链。逆转录酶的应用：⑴将mRNA逆转录成cDNA,构建cDNA文库；⑵补平和标记5'-末端突出的DNA片段；⑶代替Klenow酶用于DNA序列分析；⑷制备杂交探针等。载体与宿主载体(vector)是将外源DNA(目的DNA)片断引入宿主细胞的运载工具，其化学本质为DNA。克隆载体(cloningvector):使目的片段能在细菌细胞中复制的载体；表达载体(ExpressionVector):使目的基因能在细菌细胞中表达为RNA或蛋白质的载体。载体的种类和特性载体必须具备的基本条件①有启始位点，能自我复制，或整合到染色体DNA上的能力；②具有限制性内切酶位点(多克隆位点)；③具有合适的遗传表型或筛选标记；④载体的相对分子质量要小；⑤在细胞内稳定性高；⑥必须是安全的。克隆载体用来克隆和扩增DNA片段的载体，具有3点共性：⑴能够在受体细胞复制；⑵带有药物抗性基因，便于筛选；⑶可导入受体细胞。质粒载体质粒(plasmid)：是存在于细菌染色体外的、能自主复制的双链环状DNA分子。作为克隆载体的质粒应具备以下特点：.分子量相对较小，能稳定存在于细菌体内，有较高的拷贝数.具有1个以上的遗传标志，便于筛选.具有多克隆位点总而言之，质粒载体应该是一种分子量较小、高拷贝的“松弛型”质粒，且具有一个以上遗传标志和多克隆位点的质粒。广泛应用的质粒：pBR32质粒、pUC系列等噬菌体载体噬菌体是一类细菌病毒的总称，其结构要比质粒复杂，在噬菌体DNA分子中，除具有复制起点外，还有编码外壳蛋白的基因。噬菌体感染细菌后，可大量复制、扩增。噬菌体中首先被改造成为载体的是人噬菌体，此外还有单链噬菌体载体和粘性质粒载体等。一、入噬菌体载体组成特点：双链线状DNA分子，全长50kb,含65个基因，在其分子两端各含有12个碱基的互补单链，是天然的粘性末端，被称为COS位点。入噬菌体感染细菌后的溶菌性生长和溶源性生长溶菌性生长（lyticpathway）噬菌体感染细菌后，借助其2个COS位点互补成环，在宿主菌体内连续复制，合成大量基因产物，进而装配成噬菌体颗粒，裂解宿主菌，释放出来的噬菌体又可感染其他细菌。溶源性生长（lysogenicpathway）噬菌体感染细菌后，可将自身DNA整合到细菌的染色体中去，与之一起复制，并遗传给子代细胞，宿主细胞不被裂解。二、M13噬菌体载体6.4kb单链闭合环状DNA基因组感染宿主细胞后从感染的细胞中分泌出噬菌体颗粒，宿主细胞仍能继续生长和分裂M13-DNA上的所有基因都是噬菌体增殖所必需的表达载体基因工程表达载体是指适宜在受体细胞中表达外源基因的载体。除了要具备一般载体的特性，如含有选择标记基因、载体的复制起点、外源基因插入的多克隆位点之外，还需要有能控制外源基因进行有效转录的序列以及适当的翻译调控序列，即具有启动子、翻译增强子、终止密码子、核糖体结合位点、poly（A）信号和剪接信号等。原核表达载体大肠杆菌表达系统具有遗传背景清楚，目的基因表达水平高，培养周期短，抗污染能力强等特点。对大肠杆菌表达载体有如下要求：①有一个强的启动子，并且转录是可调控的；②应有SD序列，并且SD序列与起始密码子ATG之间要有适当的距离；③具备适用于外源基因插入的酶切位点，外源基因与载体连接后，必须形成正确的开放阅读框（openreadingframe）；④外源基因下游应插入不依赖p因子的转录终止区（强终止子）。外源基因在大肠杆菌表达的三种形式非融合型表达蛋白：直接转录并翻译出目的基因开放阅读框架（ORF）对应的多肽序列。易被降解，表达载体pKK223-3、pPLC245等融合蛋白：将外源基因与受体菌自身蛋白质编码基因拼接在一起一同表达后，在体外应用蛋白酶切割或化学试剂特性性断裂来回收外援蛋白。表达载体pGEX、pMC1871等分泌型表达蛋白：为了避免被胞内蛋白酶降解，表达的外源蛋白分泌到细胞外或内外膜的周间质区中。表达载体pIN-ompA、pEZZ18等酵母细胞表达载体①附加体质粒（YEp）YEp主要被用作基因克隆载体。该质粒载体含有来自细菌质粒pBR322的复制起点、氨苄青霉素抗性基因（Ampr）还有来自酵母2um质粒的复制起点以及一个作为酵母选择标记的URA3基因②自主复制型质粒载体（YRp）YRps常被用作遗传互补研究，也可用作基因克隆载体。该质粒含有来自细菌质粒pBR322的复制起点和作为大肠杆菌选择标记的氨苄青霉素抗性基因（Ampr）和四环素抗性基因（Tetr）,以及来自酵母染色体的自主复制序列（ARS）。③整合型质粒载体（YIp）YIp型载体的特点是转化率低（只有1〜10转化子/微克DNA）,但是转化子稳定，多用于遗传分析工作。该质粒包含大肠杆菌质粒pBR322的复制起点和作为大肠杆菌选择标记的氨苄青霉素抗性基因（Ampr）和四环素抗性基因（Tetr）,以及来自酵母的遗传标记URA3（尿嘧啶合成途径中乳清酸核甘5-磷酸脱氢酶基因）、LEU2（亮氨酸合成途径中B-异丙基苹果酸脱氢酶基因）、TRP1和HIS3。动物病毒载体真核病毒载体有两个显著的优点:高拷贝和强启动子。目前常用病毒载体有3：SV40病毒、逆转录病毒和昆虫杆状病毒等，使用这些病毒载体的目的多为将目的基因或序列放入动物细胞中表达或试验其功能、或作基因治疗等。转化（transformation）：以质粒作载体构建的重组体导入受体细胞的过程；转染（transfection）：以病毒作载体构建的重组体导入受体细胞的过程；转导（transduction）：以噬菌体作载体构建的重组体导入受体细胞的过程。感受态细胞（competentcell）：用特殊方法处理后，受体细胞才具备接受外源DNA的能力，这种细胞称感受态细胞。基因重组基因重组是遗传的基本现象，病毒、原核生物和真核生物都存在基因重组现象。减数分裂或体细胞有丝分裂均有可能发生基因重组。基因重组的特点是双DNA链间进行物质交换。重组体的鉴定一、酶切鉴定从转化菌落中随机挑选出少数菌落，快速提取质粒DNA,根据克隆片段和插入载体位点选择合适的限制酶酶解，结果通过凝胶电泳分析来确定外源基因是否插入极其插入的方向等。二、篮白筛选它是一种利用蓝色化合物的形成作为指示剂的筛选方法，筛选含有编码B-半乳糖甘酶的基因。三、PCR鉴定抽提少量重组DNA-PCR扩增一电泳鉴定一序列分析四、抗生素筛选法是指利用载体具有抗药性标记的特性直接筛选的方法。带有抗生素标记的载体转化宿主细胞后，能在含抗生素（Amp或Tet）的培养平板上生长；未转化的则不能生长。插入失活：当外源DNA序列插入质粒中某一抗药基因内，使该基因失活，转化细胞就不能生长在含相应抗生素的培养平板上。基因转染技术物理转化法一、磷酸钙沉淀法二价金属离子能够促进细菌细胞吸收外源DNA,将外源DNA溶解在磷酸缓冲液中，然后加入CaCl2混匀，DNA与磷酸钙形成颗粒性的共沉淀。这种颗粒性的沉淀物吸附于宿主细胞表面，通过胞饮作用进入细胞内，该法转染效率较低，一般仅为10-4,而且较长的DNA片段（＞20Kb）效果更差，结合甘油或DMSO对宿主细胞进行休克的方法，可提高转化效率。二、电转法此法也叫电脉冲刺激法或电击法。对于不适于采用磷酸钙共沉淀法转化的哺乳动物细胞，如生长在悬浮液中的淋巴细胞，可采用此法进行转化：将受体细胞悬浮于含有待转化DNA的溶液中，在盛有上述悬浮液的电击池两端施加短暂的脉冲电场，在外加电场的作用下，细胞膜电位发生改变，使细胞膜瞬间产生细小可逆性的的空洞，增加了其通透性，此时一定数量的外源DNA片段便经细胞外扩散直接进入细胞质和细胞核内，并进一步整合在宿主染色体上，完成转基因过程三、脂质体包埋法用于动物细胞的转染四、DNA显微注射法生物转染法一、动物病毒转染法：逆转录病毒、SV40、腺病毒、牛痘病毒等二、工程胚胎干细胞法：胚胎干细胞三、转基因体细胞移植法：哺乳动物细胞核移植第五章PCR技术聚合酶链反应（polymerasechainreaction,PCR）：体外酶促合成特异DNA片段的一种方法特点：特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等PCR原理基本反应过程：双链DNA变性（90°C以上进行）一引物与单链模板的退火（50°C左右进行，最使温度根据引物顺序而定）f引物延伸，合成新的DNA越过靶区域（70°C左右进行）最终的DNA扩增量：Y=（1+X）nY-DNA片断扩增后的拷贝数X-平均每次的扩增效率n-循环次数平台期（plateau）引物及dNTP底物浓度降低，掺入速度减慢随产物增加，酶与模板的比例下降，出现底物过量非特异性产物或引物二聚体与反应物的竞争产物的再结合PCR扩增产物可分为长产物片断和短产物片断两部分实现PCR的基本条件PCR体系：模板DNA、特异性引物、耐热DNA聚合酶、dNTP和Mg2+等反应条件的优化：控制引物浓度、采用合适的耐热DNA聚合酶、调整dNTP浓度、Mg2+浓度、缓冲液浓度、控制pH值和设置合理的循环参数等检验PCR扩增效率的三个指标：特异性、有效性、忠实性模板（DNA或mRNA）DNA可以作为直接作为模板；RNA需要逆转录为cDNA后才能进行PCR扩增，模板的制备很关键模板DNA的用量（每个反应中）：哺乳动物基因组DNA—1.0Pg,相当于常染色体单拷贝基因的约3X105拷贝数的DNA量酵母DNA—10ng;细菌DNA—1ng;质粒DNA—1pg引物引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核甘酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量