基础医学第三讲 分子生物学在药理学中的应用

基础医学第三讲分子生物学在药理学中的应用单细胞凝胶电泳法（SCGE)

荧光原位杂交技术（FISH）

单链构象多态性分析（PCR-SSCP)

mRNA差异显示技术（DDRT-PCR)

抑制消减杂交技术（SSH）

基因芯片技术

转基因动物一、单细胞凝胶电泳法(SCGE)单细胞凝胶电泳（Single-CellGelElectrophoresis,SCGE）：又称慧星试验（cometassay），是一项较新的电泳方法。自1978年被Rydcbert等人成功地用于检验单细胞DNA单链断裂以来，经过不断的改进，已成为一种快速、灵敏、简便的检测DNA损伤的方法，广泛地应用于DNA放射损伤、药物的遗传毒性评价、细胞凋亡鉴定等工作中。1.SCGE的基本原理有核细胞的DNA分子量很大，DNA超螺旋结构附着在核基质中，用琼脂糖凝胶将细胞包埋在载玻片上，在细胞裂解液作用下，细胞膜、核膜及其它生物膜遭到破坏，使细胞内的RNA、蛋白质及其它成分进入凝胶，继而扩散到裂解液中，但核DNA仍保持缠绕状态附着在剩余的核骨架上，并留在原位。DNA超螺旋结构细胞未受损伤:

电泳时，核DNA停留在核基质中，呈圆形荧光团，无拖尾现象。细胞受损:在中性电泳液（PH=8）中，DNA双链断裂时，断片进入凝胶，电泳时向阳极迁移，形成荧光拖尾现象，形似彗星。在碱性电泳液（PH＞13）中，碱变性为单链，单链碎片进入凝胶，电泳时离开核DNA向阳极迁移，形成拖尾。Singh等人1988年描述的SCGE具体操作方法(碱性SCGE法)

：细胞样品处理：细胞染毒和细胞制备①细胞染毒：invitro,可直接将受试物加到生长培养基中，也可对包埋于琼脂糖中细胞进行染毒；invivo，以不同途径给动物染毒，间隔一定时间后，取组织分离细胞，检测细胞活力，立即进行SCGE分析。2.SCGE的简要操作步骤②细胞制备：单细胞培养时要注意胰酶消化和刮取收获细胞的方式可诱导DNA损伤。制片：首先制备细胞悬液，然后制片。常用“三明治”凝胶：第一层，5％正常熔点琼脂糖，第二层，细胞悬液与0.5％低熔点琼脂糖混合液（10：1）,第三层，0.5％低熔点琼脂糖。细胞裂解：碱性试验中，pH值为10～12的含去污剂的高盐溶液做溶解液，以裂解细胞。电泳：电泳前先将玻片浸没于碱性电泳缓冲液中，使DNA解螺旋，然后进行电泳。中和，染色：用Tris缓冲液中和凝胶后，用染色剂染色。常用染色剂有溴化乙锭、吖啶橙、碘化丙啶（PI）等。图像分析：在荧光显微镜下观察单细胞电泳图像3.SCGE的主要计算指标

典型的DNA损伤细胞荧光图像象慧星一样头尾分明。（1）形状指标比较粗略的指标。细胞分类：慧星样细胞和非慧星样细胞；计数一定量细胞中慧星样细胞所占的比例，即慧星样细胞发生率，估计DNA的损伤程度。特点：可通过镜下观察直接得到，方便实用。（2）距离指标

尾长，即沿电泳方向“慧星”尾部最远端与头部中心的距离；总慧星长度，即“慧星”电泳方向上的最大长度；尾长与头部直径比值等，以评价DNA损伤程度。特点：泳动距离易于测量，无需复杂的仪器设备及图像处理软件，在损伤因素剂量较大时，这些数值的大小与作用剂量之间呈较为良好的线性关系。（3）强度指标用“慧星”头部中心处荧光强度与电泳方向上一定距离处荧光强度的比值来描述DNA的损伤；根据“慧星”尾部荧光强度将细胞分为五类，由弱到强分别计为0、1、2、3、4，将100个细胞的分值加在一起表示DNA的损伤程度，该数值与总慧星长度有较好的相关性。特点：不同程度地反映了电泳中泳动DNA的量。（4）“矩”类指标

“尾矩”（tailmoment，TM），尾部DNA占总DNA的百分比与头、尾部中心间距的乘积。特点：优越，被广泛接受。优点：反映细胞群体中不同类型细胞对作用因素的不同反应，为确定遗传毒性因素的靶细胞提供可能；方便易行，对细胞所处生长状态没有要求，也不需同位素标记，适用于各种有核细胞；样品用量少；试验周期短，灵敏、快速；对各种理化因素都较敏感，费用少，非常适用于接触遗传性有害因素人群的生物检测，并可用于筛检对DNA损伤因素敏感的高危人群。4.SCGE方法的优缺点不足：各实验室的操作方法差异极大，包括溶解液、电泳液的配方，电泳参数、DNA结合荧光染料的选择都没有标准化。评价标准不统一，有待改进和完善5.SCGE在药理学与毒理学中的应用(1)DNA损伤与修复的研究很多化学物质对DNA具有损伤作用，如氯乙烯(VCM)，交联剂（如丝裂霉素C，MMC）、氧化剂等。(2)遗传毒性评价(SCGE可能是研究低剂量遗传效应最有效的工具)如：二氯胺基酚≧50μg/ml，V79细胞出现明显的DNA迁移，证明二氯胺基酚是DNA损伤剂。(3)生物检测

放射检测：以人外周血淋巴细胞作为检测材料，γ射线照射－诱导突变；

环境因素对健康影响的早期检测：长期接触苯的工人，其淋巴细胞DNA损伤比对照组显著提高；

吸烟者比不吸烟者患肺癌的几率高7－11倍；被动吸烟者患癌症的比例也在增加。

(4)细胞凋亡的研究

凋亡细胞DNA断裂很有规律，发生在核小体之间，产生180～200bp大小的DNA片段，在SCGE试验中呈现形态学特征。

？小头大尾

荧光原位杂交（Fluorescenceinsituhybridization，FISH）是一门新兴的分子细胞遗传学技术，是20世纪80年代末期在原有放射性原位杂交技术（insituhybridization,ISH）的基础上发展起来的一种非放射性原位杂交技术。二、荧光原位杂交技术(FISH)1.FISH技术基本原理通过荧光标记的已知各类DNA和RNA单链核酸探针，按照碱基互补的原则，与待检材料（组织、细胞或染色体）中未知的单链核酸（DNA、RNA）在载玻片上进行特异性结合（杂交），形成可被检测的杂交双链核酸。2.探针分类与标记

按结合位点分类：染色体特异性序列探针、由许多DNA大片段组成的全染色体探针和着丝点探针按制备方法分类：直标型探针和间标型探针直标型探针：DNA探针直接共价连接荧光素基团；低背景、高特异性间标型探针：DNA探针先与某个半抗原（生物素或地高辛）连，再与荧光素基团连接形成探针－半抗原－荧光素基团。灵敏度高3.FISH简要操作步骤（1）探针的制备和标记（2）原位杂交：变性处理染色体标本和探针，复性杂交（3）荧光检测：直标型探针，荧光标记的卵白素；间标型探针，荧光标记的相应抗体。常用荧光标记分子有异硫氰荧光素（绿光）、罗丹明（红光）、德州红（深红）等。（4）荧光显微镜检测：特定波长光波激发4.FISH特点(1)避免使用放射性同位素带来的问题;(2)荧光试剂和探针标记相对经济和安全；(3)快速、检测信号强、杂交特性高；(4)可同时分析中期和间期核，灵敏度高；(5)定位的DNA序列从1kb发展到整条染色体范围；(6)根据基因组部位不同用不同颜色标记探针，可在同一细胞核或中期染色体中显示不同的颜色，可同时观察代表不同染色体区域的荧光信号多色FISHM-FISH技术荧光原位杂交不同荧光物质标记的探针显示同一细胞

不同染色体区段上的DNA

5.FISH在药理学与毒理学研究中的应用（1）检测有丝分裂中期细胞染色体畸变（2）检测间期细胞染色体畸变常用间期分析方法是用特异染色体区域探针，如着丝重复序列探针进行杂交，检测染色体非整倍体异常。5.FISH在药理学与毒理学研究中的应用（3）哺乳动物精子非整倍体检测是有效检测人精子遗传损伤尤其是染色体数目异常的可靠手段。如：用FISH技术评价吸烟、饮酒以及饮用咖啡等对精子染色体非整倍体的影响。（4）微核来源鉴定三、PCR-SSCP技术单链构象多态性（singlestrandconformationpolymorphism,SSCP):指单链DNA由于有链内碱基配对而具有一定的空间构象，当DNA链上的碱基发生改变时，单链DNA会形成不同的构象。

1.基本原理

将DNA单链放入非变性溶液，它将以序列特异方式折叠，形成具有一定空间结构的构象。而如果一个碱基发生改变，该分子折叠的形状和大小就会有所不同。用非变性凝脉电泳分离时，不同形状的DNA分子可能以不同的速度移动，电泳完毕，这些片段位置就会不同，借此可以显示片段中是否有碱基改变。2.简要操作步骤以检测P53基因突变为例：（1）PCR扩增目的片段DNA；（2）将样品的1/10（约5μl）稀释于15-40μl0.1%SDS，10mMEDTA溶液；（3）按1:1将上述溶液与98%甲酰胺、89mMTris、2mMEDTA、89mM甲酸、0.05%溴酚兰、0.05%二甲苯青上样液混合；（4）95℃热变性2分钟（产生单链，变性应彻底）；（5）上样（a）6%非变性聚丙烯酰胺凝胶，（b）6%非变性聚丙烯酰胺凝胶加10%甘油；（6）在室温电泳，8W8-16小时；（7）放射自显影或银染法3.影响SSCP分析结果的因素（1）片段大小最重要的因素Sheffield等人（1993年）对3个基因64个突变的研究结果复合而成的。最佳片段大小为155bp。（2）凝胶的孔径/交联度：10％凝胶，1.3％交联度较好

（3）碱基组成和凝胶中甘油浓度（高G+C含量，蔗糖比甘油好）（4）电泳条件：温度和电泳缓冲液的离子强度等

条件优化：室温5-10%甘油或4℃无甘油的情况下进行电泳会获得比较好的分析结果

（5）突变和邻近序列效应（corctexteffects）突变所在片段的性质及突变所处的位置对检测有影响4.SSCP方法的优缺点优点：简便，步骤少，无复杂的理论，无需特殊设备，突变条带与野生型分开后可用于分析，可以不用放射标记进行测定，即银染法；缺点：

突变位置未知，分析片段的大小受限制（150～200bp），强烈依赖实验条件的选择，可能会漏检突变，有时电泳结果比较复杂难于解释。5.在药理学和毒理学中的应用（1）癌基因和抗癌基因突变的鉴定赵永良等大鼠气管上皮细胞p53基因突变，转化细胞中p53基因Exon8的单链条带有差异，经证实G265C，精氨酸脯氨酸。α粒子辐射（2）化学致癌剂的致癌机理研究Maino等在1992年用化学致癌剂诱发小鼠鳞状细胞癌，用SSCP法检测出了特异性H-ras基因的第13密码子发生了突变。（3）P450酶基因的突变研究

人CYP4F12基因组8个突变四、mRNA差异显示技术（DDRT-PCR）

高等生物,30000个基因，10%的基因表达，按时间和空间顺序有序进行。包括新出现的基因表达与表达量有差异的基因表达。生物体表现出的各种特性，由基因的差异表达引起。药物/毒物和环境因素引起的基因改变和新基因的出现,未知；未知新基因的发现、分离和克隆是一项非常重要和具有创造性的工作。

常见差异性表达mRNA方法：

（1）mRNA差异显示（mRNA-DifferentialDisplay，mRNA-DD）（2）抑制性消减杂交（SuppressionSubtractiveHybridization，SSH）（3）cDNA代表性差异分析（cDNARepresentationalDifferenceAnalysis，cDNA-RDA）（4）cDNAmicroarray

原理：

真核细胞mRNA3’端具有多聚腺苷酸尾（polyA）结构，用含oligo（dT）的寡聚核苷酸为引物将不同的mRNA反转录成cDNA。设计合成12种下游引物，即3′-锚定引物，通式为5’-TnMN-3′(n=10~20,M=dA/dC/dGN=dA/dC/dG/dT)。

5’-端随机引物：20种，10bp

创始人LiangP和PardeeA

（一）传统mRNA差异显示技术（DDRT-PCR）DDRT-PCR的优缺点：优点:（1）速度快,较易操作；（2)由于PCR扩增技术的应用,使得低丰度mRNA的鉴定成为可能,且灵敏度高；（3)可同时比较两种以上不同来源的mRNA样品间基因表达的差异。

缺点:

（1）出现差别条带太多,假阳性率高达70%左右,重复性差,且对高拷贝数的mRNA具很强的倾向性；（2）在有差异的显示片段中难以知道哪个基因是已经研究过的，哪些是未知基因；（3）得到的有差异的扩增条带短,一般在110～450bp之间；（4）局限性，只适合含PolyA尾的真核生物。

原理：

首先以oligo（dT）的寡聚核苷酸为引物将不同的mRNA反转录成cDNA。

再用限制性内切酶酶切cDNA，然后在酶切后的cDNA片段两边加上特殊接头进行扩增。

（二）改进的限制性酶切片段差异显示技术（RFDD-PCR）参考文献：胡岳山;李杰芬;王剑.限制性酶切片段差异显示及其应用.生物技术通讯.2004,15(1):65-66改进的限制性酶切片段差异显示技术（RFDD-PCR）RFDD-PCR优点（1）采用优先切割翻译序列的限制性内切酶（如TaqI），优先展示编码区，更加适合于下游功能分析；（2）使用标记引物来扩增，使差异条带检测更便利、灵敏；（3）重复性更高，极大地降低了假阳性率。原理：

基于抑制PCR,并结合标准化(normalization或equalization)和消减杂交(substractivehybridization)。抑制PCR通过利用含引物序列的双链接头(adaptor)充当引物模板,使两端接上同一接头的非目的双链片段具有反向末端重复序列,PCR中不能扩增,从而达到抑制非目的片段而选择性扩增目的片段的目的。标准化步骤平衡了目的基因群(tester)中cDNA的丰度,即低丰度差异表达的基因不会丢失,而高丰度差异表达的基因又不会被过量分离。消减杂交则扣除了目的基因群(tester)与驱赶基因群(driver)间的同源序列。

由Diatchenko等于1996年以mRNA差异显示技术为基础建立起来的筛选未知差异表达基因的新技术。

（三）抑制消减杂交技术（SSH）suppressionsubtractivehybridization（SSH）SSH的优缺点优点:（1）在杂交过程中，高丰度的杂交双方较低丰度者容易退火，因而经第一次消减杂交后，未杂交的高、低中度丰度序列浓度趋向一致；（2)操作容易掌握，步骤简便。无需像DDRT-PCR那样，对每一条片段单独进行克隆；（3)敏感性较高；（4)重复性和可靠性高，真阳性率可达90%以上。缺点:（1）所需mRNA样品量较多（1~2μg）（2)同DDRT-PCR和RDA等方法一样，SSH中产生的cDNA片段以基因3’端序列为多。

（3)一次只能比较两个样本（1）肿瘤相关基因的筛选；（2）外源化合物或环境因素诱导的特异基因的研究；周等将人肺A549细胞暴露于镍化合物，Ni3S2与NiCl2均可诱导出Cap43基因，另外的12种金属化合物未能诱导出。结论：Cap43是镍化合物诱导的特异基因。（3）细胞凋亡基因表达的差异分析；（4）药物/毒物作用机理研究和细菌耐药机理研究。差异显示技术在药理学和毒理学中的应用如：差异表达基因筛选－大肠杆菌对喹噁啉类耐药分子机制研究检测对象（tester）：大肠杆菌79O4-2驱赶者（driver）：大肠杆菌79~20

筛选到44个差异片段，其中18个为物质合成相关基因，11个为物质代谢相关基因，3个为膜转运蛋白基因，3个为参与鞭毛装配的蛋白基因，1个为质粒上的迁移蛋白基因，5个为功能未知的假定蛋白基因，3个在Genbank中未找到显著相似序列。18个物质合成相关基因分别参与蛋白质、硫辛酸、类脂A、肠道菌共同抗原、脂肪酸、海藻糖和CTP的生物合成，11个物质代谢相关基因分别参与损伤蛋白及时清除、糖原分解、氧化磷酸化过程。差异片段同源性分析推测耐药机理：通过启动铁硫簇结合蛋白、硫辛酸合成蛋白（LipA）和海藻糖合成蛋白（OtsA）的表达，抵抗氧化损伤

五、基因芯片技术

基因芯片(Genechip)：又称DNA芯片（DNAChip）或生物芯片(Biologicalchip）。基因芯片技术是随着人类基因组计划的进展而发展起来的，是90年代中期以来影响最深远的重大科技进展之一。融微电子学、生物学、物理学、化学、计算机科学为一体的高度交叉的新技术。

1.基本原理：采用原位合成（insitusynthesis）或显微打印手段，将数以万计的DNA探针固化于支持物（substrate）表面上，产生二维DNA探针阵列，然后与标记的样品按碱基配对的原理进行杂交，通过检测杂交信号来实现对生物样品快速、高通量、高效的检测或医学诊断。

2.基因芯片的主要类型：

以片基(substrate)的不同分类：可以分为无机片基和有机合成物片基。片基探针固定方式探针密度显色及检测方式无机片基如玻片、半导体硅片等原位合成（insitusynthesis）高荧光，激光共聚焦扫描、定量分析；生物传感器等有机合成片基如NC、Nylon膜等离片合成后点样(off-chipsynthesis)低荧光基因芯片的主要类型及其简要特点以探针不同分类：主要有基因芯片（DNA和cDNA），蛋白质或肽芯片、组织芯片等。3.

技术路线以核酸杂交为原理的检测技术，其主要过程为：

样品制备：扩增的靶序列或样品标记杂交：标记靶序列或样品与探针杂交

芯片清洗

图象的分析:

激光共聚焦显微镜对芯片扫描并进行分析。

GeneExpressionMicroarry技术路线

4.优缺点：（1）高通量：一次可以对大量的DNA分子或RNA分子进行检测分析；（2）自动化程度高；（3）高效率；（4）需专用的仪器设备；（5）需专用的程序软件分析，成本高（6）要求全基因组序列已知（1）大规模筛选差异表达基因以及环境有害因素对基因表达的影响研究

mRNA差异显示、cDNA代表性差异分析、SSH：只能对少数基因的表达进行分析；针对性不强，效率低下，绝大部分工作都是繁琐重复劳动。5.基因芯片技术在药理学和毒理学中的应用基因芯片技术：能够从整个基因组水平上对某一刺激或疾病进行检测。通过基因芯片分析正常组织和药物处理组织基因表达情况的差异，能够从表达异常的基因中发现新的药物作用相关基因（靶点）。Brown等就正常人与病人的T细胞标本对表达的变异与数千个遗传、遗传流行病和环境条件的图像进行比较，以确定与二氧化物和汞接触的关系。（2）用于基因突变的检测及基因组多态性的分析对人BRCAⅠ基因外显子11、CFTR基因、β-地中海贫血、酵母突变菌株间、HIV-1逆转录酶及蛋白酶基因等的突变检测、耐药突变点的检测等；对人类基因组单核苷酸多态性的鉴定、作图和分型，人线粒体16.6kb基因组多态性的研究等。

（3）研制的毒理芯片的应用原理：根据cDNA微阵列可以测定基因表达，反过来特定的基因表达就可以作为被测试样品毒性信息的标记物。通过构建大量模型化合物的毒理效应数据库，分析大量某类化学物质，揭示出遭受特定暴露时开放或关闭的基因模式。一类毒性终点的基因表达变化具有其共性的“标记”，一旦建立起毒物标记库，可以在同一模型系统下将未知药物所引起的基因表达与库中的数据相对比，通过这种对比匹配，能获得未知药物的毒理作用机制。（3）研制的毒理芯片的应用不同机制的化合物都有其特定的基因指纹图谱，如果得到所有药物的基因指纹，就得到了轮廓或识别模式，有了这一模式，当对一个新药物进行测试时，通过微阵列芯片测定得到基因表现性轮廓，就能预测出该药物的毒理性质。

应用：研究受检毒物的毒作用机制；确定以基因表达模式为基础的化合物的毒性毒理芯片的局限性毒理芯片仅能用于检测在mRNA水平上基因的变化，不能检测由该基因翻译的功能蛋白质所发生的变化；许多药物是通过与蛋白质的结合或改变大分子的结构来表现最初毒性的，而并不是直接诱导基因表达或使基因表达发生改变；对于多机制作用药物的分析，利用基因表达图谱则很难描绘出药物最初的毒性作用；虽然在单一因素下能够根据数据库和基因表达图谱预测出药物毒性，但如果实验条件不同则不能肯定其预测性。（4）其它应用药物靶标筛选药物抗性的鉴定环境毒理学检测生态毒理学检测六、转基因动物1.定义

转基因动物（transgenicanimal）：是指在体内基因组中稳定地整合有外源基因的遗传工程动物，其外源基因可遗传给后代。转基因动物集整体、细胞和分子水平于一体，更能体现生命整体研究的效果。2.转基因动物发展简史：

1974年,Jaenisch等将病毒SV40的DNA注入小鼠的胚泡，首次成功地培育转基因动物。

1982年，Palmiter等用显微注射法成功地得到了7只转基因小鼠。

此后，转基因动物技术迅速发展，被广泛应用于生物医学研究的各个方面。

3.

转基因动物模型的构建（1）目的基因的构建首先要构建欲研究的目的基因，即“转基因”（transgene）。标准的转基因包括：编码序列和使之有效表达的调控元件，如promoter、转录起始位点、5’UTR、startcode、codingregion、stopcodeand3’UTR等。（2）目的基因的导入导入基因的不同方式：原核显微注射法逆转录病毒感染法胚胎干细胞植入法

①

原核显微注射法：主要步骤：准备假孕动物；收集受精卵；用显微注射的方法将外源基因直接注入受精卵的雄性原核内；将注入目的基因的受精卵植入假孕动物的输卵管内，使其生长发育。对幼鼠进行鉴定

对幼鼠的鉴定：幼鼠断乳后自尾部提取DNA，与目的基因探针作分子杂交，鉴定外源基因是否整合。建立鼠系，将带有外源基因的小鼠与未经转基因的小鼠交配、传代后，后代有50％概率带有整合的基因供实验用。自小鼠内脏提取RNA，与目的基因探针做分子杂交，以鉴定外源基因的表达和表达的组织特异性。表达产物可以测定活性的，也可直接自血液或组织测定活性蛋白质，常用的方法如酶联免疫吸附试验(ELISA)或放射免疫测定(RIA)等。原核显微注射法优点：任何DNA序列（大至50kb）均可直接导入原核；整合效率高（约25％的新生小鼠携带外源基因）；大部分转基因小鼠的所有细胞包括生殖细胞都带有外源基因；操作过程比较省时省力

缺点：对操作人员技术要求较高；受整合位点的影响：外源基因随机整合到宿主染色体的某一位点上，可能破坏内源基因序列或激活致癌基因，造成动物发育障碍或死亡。②逆转录病毒感染法：应用重组技术将目的基因、病毒长末端重复序列（LTR）和包装序列整合在一起，形成完整的病毒颗粒，再用这样的病毒去感染受体细胞就可以实现基因转移的目的。

优点：方法简单、不受胚胎发育阶段的影响、转移效率高，几乎可达到100％；

缺点：易激活宿主癌细胞，外源基因片段的长度受限制，一般不能超过10kb。③胚胎干细胞植入法：胚胎干细胞：人或动物的胚胎中存在的一些具有高度更新能力和多向分化能力但尚未分化的细胞。胚胎干细胞特点：体外可以分化形成肝细胞、心肌细胞、造血干细胞和神经纤维细胞等各种体细胞；可以从早期胚胎胚泡的内细胞团或桑椹胚的原始生殖细胞中分离获得；体外培养寿命比胎儿细胞和成体细胞要长。胚胎干细胞是克隆哺乳动物供核细胞最佳来源胚胎干细胞植入法步骤：选择合适的载体，将目的基因与其重组，构建重组质粒。(2)重组质粒线性化后，用电穿孔、脂质体等方法将其转入体外培养的小鼠胚胎干细胞中。(3)体外筛选稳定整合外源基因的胚胎干细胞。(4)筛选出的胚胎干细胞被重新注射到小鼠囊胚中，并植入到假孕小鼠的子宫内，使其重新发育为一个完整的胚胎。(5)产出的嵌合体小鼠通过杂交，最终获得稳定整合外源基因的纯合体转基因小鼠。胚胎干细胞植入法1995年，我国分离出小鼠胚胎干细胞；1996年，

Campbell等克隆绵羊所使用的胚胎细胞培养系类似于胚胎干细胞；1999年，Vogel获得了完全由胚胎干细胞发育来的克隆小鼠；中国：将人体体细胞的细胞核放入去核的兔卵母细胞，让融合后的细胞发育到胚泡阶段，得到胚胎干细胞？优点：囊胚腔易于注射，整合效率高，可达50％；缺点：建立胚胎干细胞系比较困难。一般毒性研究模型致突变检测模型致癌检测模型可发光转基因动物模型4.转基因动物应用与分类（1）一般毒性研究模型金属硫蛋白(MT)基因的转基因和基因敲除小鼠：金属和某些非金属的研究。MT转基因小鼠：抗镉毒性抗性增强；MT基因敲除小鼠：对镉、银、汞、四氯化碳等的毒性敏感性增强（2）致突变检测模型

转基因动物可确定靶器官以及对诱发的遗传改变做精细分析等。转基因动物是目前研究体内基因突变唯一可行而有效的系统。1989年，Gosen等建立第一个以lacZ基因作为诱变靶基因的转基因突变检测模型，并应用于体内基因突变研究和化学物质的遗传毒性分析-----所携带的靶基因以λ噬菌体为载体趋势：制备以质粒为载体的转基因动物致突变检测模型

phage(+galoperon)细菌蓝色

用含乳糖操纵子的噬菌体培育一种转基因动物，当噬菌体在体内由于受化学物的处理而受到损害，不能抄录正常的半乳糖苷水解酶，这种噬菌体在体外装配后，其感染细菌的菌落为无色。因此根据蓝色和无色菌落的多少，来判断某些化学物基因毒性的强弱。以λ噬菌体为载体的转基因突变检测模型原理（3）致癌检测模型过量表达癌基因的转基因动物模型基因敲除动物致癌检测模型用于生殖毒性研究转基因动物①过量表达癌基因的转基因动物模型TG，AC小鼠，HK-fos转基因小鼠，ras-H2转基因小鼠，携带激活的H-ras原癌基因小鼠，携带激活的Pin-1肿瘤基因小鼠等，对化学致癌剂敏感性增强很多倍。②基因敲除动物致癌检测模型用同源重组的方法，将一段DNA整合到目的基因，使该基因不能表达具有正常功能的蛋白质，用这种方法培养的动物称基因敲除动物。基因敲除动物P53(+/-)和正常动物P53(+/+)：致癌剂二硝基二甲胺处理，P53(+/-)平均寿命29周，P53(+/+)的平均寿命42周，其肿瘤的发生与分布也有很大的差异。③用于生殖毒性研究转基因动物ZP3基因敲除小鼠、雌激素受体基因或孕酮受体基因敲除小鼠、DNA甲基转移酶基因敲除小鼠等。（4）可发光转基因动物模型

原理：将荧光素酶基因整合到细胞，微生物，或实验动物上，当荧光素酶基因表达时，在有底物荧光素存在的情况下，会产生生物发光现象。利用高灵敏度CCD和软件系统可对这些光学信息进行采集和分析，从而获取生物体内的基因表达、疾病发展，新药的药效等信息。活体成像系统原理

将荧光素酶基因连接于启动子下游，稳定整合到细胞染色体内，使荧光素酶得到持续表达。体内表达外源注入底物活跃细胞体内发光全球首例转基因克隆兔研究策略先从一种特殊水母中提取绿色荧光蛋白基因，然后经过物理、化学处理，把该基因转染到培养的兔成纤维细胞中，再挑选出发绿色荧光的转基因体细胞，将其细胞核移植到成熟的去核兔卵母细胞中，最终构成了转基因胚胎。胚胎经过手术，移植入“代孕兔”体内。经过30天的发育，剖腹产获得转基因克隆兔。特点：为研究人员提供观察实验动物体内发生的生物学现象的窗口，使在分子水平上实时跟踪生物学过程成为可能。应用：广泛应用于多个医学研究领域，如药理,药效,药物代谢，安全性/毒性评价，给药方式等。农业研究领域：遗传育种、人类疾病模型体外试验在药理学和毒理学中的应用

体外细胞培养的方法在药理学与毒理学中的应用

体外基因重组技术在药理学中的应用体内试验（invivotest）：又叫整体动物实验，利用整体实验动物模型提供的资料，判断外源物及其制品和混合物对健康是否有损害作用。体外试验（invitrotest）：利用体外的方法，如体外细胞培养、亚细胞组分、离体脏器灌流等，研究外源化合物的药理与毒理机制。(一)体外试验的目的和分类目的确定药/毒理学性质确定安全接触限量探究药/毒理学机制（二）基本原理药/毒理学效应是外源物和/或其活性代谢产物在敏感性细胞上或细胞内某一分子靶部位（如酶）作用的结果将敏感细胞或细胞的分子靶部位，在体外条件下，维持其正常功能，观察外源物对靶部位的作用及靶部位对外源物的反应。（三）体外试验的优缺点优点能控制环境因素可同时和/或反复多次采样可排除体内各系统相互干扰较为快速、简便减少整体动物的使用，经济可利用人体细胞缺点体外到体内外推的问题：如体外浓度与体内剂量间的换算；缺乏毒理学反应的调控因素：不同细胞间的相互影响、细胞与组织的修复等；难以预测慢性毒性：缺乏体外试验的理论依据，长期生理状态难以维持。（四）体外试验系统脏器灌流：肝脏灌流、肠灌流脏器切片：肝、肾、脑、心等原代细胞培养：肝细胞、巨噬细胞、淋巴细胞传代细胞（细胞系）培养：肾细胞、胚胎细胞组织匀浆：对细胞酶系统的毒理作用研究亚细胞组分：微粒体、线粒体（五）体外细胞培养1.常用细胞（系）：

细胞系（CellLine），原代培养物经首次传代成功,细胞系可泛指一般可能传代的细胞。其中能够连续传代的细胞叫做连续细胞系或无限细胞系，不能连续培养的称为有限细胞系。大多数二倍体细胞为有限细胞系。细胞株（CellStrain），通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得具有特殊性质或标志物的培养物，细胞株是用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群。细胞株的特殊性质或标志必须在整个培养期间始终存在。各种物种的成纤维细胞系：如V79中国仓鼠卵巢细胞（CHO）：由Puck在1957年建立的细胞株HeLa细胞系：1951年从一位名叫HenriettaLacks的妇女身上取下的宫颈癌细胞培养而成其它细胞：淋巴（母）细胞、脂肪细胞、肝细胞、神经细胞等。2.培养细胞的鉴定目的观察培养有无变化，以决定是否终止培养观察培养条件变化对培养细胞的影响鉴定内容污染鉴定：真菌、细菌或支原体污染生存鉴定：台盼蓝排斥试验、酶漏检试验、MTT法测细胞相对数和相对活力细胞性质：形态、生长特性、染色体等形态学成纤维样细胞单层培养时，长度＞2倍宽度上皮样细胞多角形淋巴样细胞圆形生长特性克隆效率测定由单个细胞生长的克隆接种效率克隆数目/植入细胞数目×100％

其他染色体结构和数目、DNA、RNA、蛋白质含量测定3.应注意的问题细胞类型的选择：一般药/毒理研究应用细胞系，但代谢机理研究多不用细胞系，P450酶活性代谢活化：加肝S9，与原代细胞混合培养等受试物给与：有机溶剂浓度应低于0.1％设立阳性对照组：如环磷酰胺

毒性指标的选择：IC50、细胞膜损伤、大分子合成与降解的速度、代谢能力、形态学观察IC50：经3天培养后，引起生长速率减至对照组一半时所需受试物的浓度。生长速率可用蛋白总浓度来表示

细胞膜损伤：台盼蓝摄取、胞浆酶漏出、Ca2+的释放、钙泵的变化等指标大分子合成与降解的改变：选用[14C]亮氨酸蛋白试验和[3H]尿嘧啶掺入RNA试验等指标代谢能力：可选择ATP浓度、NADP／NADPH比、谷胱甘肽含量、氧消耗量等指标，还可选择毒物代谢酶的活性、细胞膜脂质过氧化作用及[14C]-葡萄糖氧化代谢成14CO2的速率形态学观察：通过光学显微镜和电子显微镜观察，了解受试物对培养细胞的形态改变情况。4.细胞培养在毒理学中的应用一般毒性急性细胞毒性器官特异性毒性毒作用机理生物转化、毒性代谢产物的形成遗传毒性程序外DNA合成测定繁殖毒性比较毒性、光敏毒性本身有毒的化合物：

核苷酸同位素标记法b.

本身无毒，代谢后有毒的化合物：

在细胞培养液中加入肝细胞抽提液以帮助代谢毒物；或用少量原代细胞与被检的传代细胞混合培养，由引入的原代细胞提供代谢酶。如：化学物的基因毒性研究

c.建立细胞株：能合成某种单一的酶，有针对性地研究毒物的毒性作用。把转录某种代谢酶的DNA连接到基因载体上(多为质粒或病毒)，通过一定的方式引入到体外培养细胞，利用细胞的转录因子，表达这种特异的酶。

人CYP1A1，2A6，2E1，3A4等，已成功引入人淋巴样细胞株、鼠胎盘细胞株、仓鼠肝癌细胞株等，灵敏度高。如:硝基二甲基胺的毒性检测,2A6(+)细胞≧500×2A6(-)细胞株（敏感性）和2E1（＋）细胞株（500倍）硝基二甲基胺要代谢以后才能显示毒性；2A6是能将硝基二甲基胺转化为毒性代谢物的代谢