基因工程操作原理-基因工程

Geneengineering基因工程内容简介基因工程，是生命科学的核心学科之一。它以类似于工程学的方法与技术，对生命元件进行设计、构建、组装和应用，有目的地改造生物物种生产出人们所期望的生命物质。基因工程技术的显著特点是，打破了常规育种难以突破的物种界限，使原核、真核生物之间，动植物之间，以至人与其他生物之间的遗传信息进行重组和转移。本课程主要介绍基因工程概述、基因工程操作原理（从基因的表达调控机制入手，将DNA重组技术归纳为切、接、转、增、检五大基本操作单元）、基因工程应用（按照受体细胞的生物学分类，逐一展开各系统基因工程的原理和应用）。基因工程的地位基因工程生命科学分子生物学生物工程FieldafteroneroundofapplicationofRoundupherbicideTransgenictomatoplantsshowresistance(left)whilenon-transformedplantsaresusceptibletocucumbermosaicvirusunderfieldconditions(right)

/online/feature/BioTechnology/Images/2.4.jpgInsectinfestationonBt(right)andnon-Bt(left)cottonbolls/programs/lifesciences/TransgenicCrops/images/cotton.jpgWild-typecornshowinginfestation-BtcornisresistanttothisPotatoesareoneofmanyplantsbeingusedtoproducevaccines/sept_issue/images/breakthrough/veggievaccine.jpgGoldenriceandnormal(white)

/wsjbiotech.html嗯？！真的？预防传染病！还不快吃愣什么！DNAISEVERYWHERE植物？动物？物种？1.基因工程概述（2）2.分子克隆工具酶（3）3.分子克隆载体（2）4.人工染色体载体（1）5.表达载体（2）6.基因工程技术（8）7.基因工程应用（8）8.基因工程产品的安全及其管理（2）9.答疑及课程考核（2）授课内容及学时安排组成部分：

平时考勤：10%

课外作业：20%

期末考查：70%作业要求：按时完成独立思考书写整齐成绩考核第一章基因工程概述主要教学内容1.1基因工程与基因操作的基本概念1.2基因工程的诞生与发展1.3基因工程的研究内容1.4基因操作的理论基础1.5基因工程的应用1.6基因工程的安全性掌握基因工程的基本概念；熟悉基因工程的主要研究内容，发展历程；了解基因工程的应用及安全性。重点与难点基因工程的概念及研究内容；基因工程技术的特点。教学目标与要求教学要求与传统育种相比，基因工程育种有哪些特点和优势？简述基因工程的主要步骤。基因工程技术存在哪些潜在危害？简述基因的结构组成对基因操作的影响。需掌握专业词汇

geneengineering；clone。问题与思考1.1基因工程的基本概念1.1.1重组DNA技术的基本定义重组DNA技术是将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传，并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。因此，供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元件。(1)基因工程：通过基因操作来定向改变或修饰生物体或人类自身，并具有明确应用目的的活动。另:指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技术）；下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。(2)基因操作：指对基因进行分离、分析、改造、检测、表达、重组和转移等操作的总称。1.1.2基因工程的基本定义（1）DNA是遗传物质肺炎双球菌转化实验,

1944年Avery，确定了基因的分子载体是DNA，而不是蛋白质。噬菌体转染实验,

1952年AlfredHershy和MarshaChase进一步证明遗传物质是DNA。1.2基因工程的诞生与发展

1.2.1基因工程诞生的理论基础

1953年JamesD.Watson和FrancisH.C.Crick揭示了DNA分子的双螺旋结构和半保留复制机制。(2)DNA双螺旋结构英国《NATURE》杂志

1953年4月25日“脱氧核糖核酸的结构”沃森，克里克1962年12月10日诺贝尔奖颁奖仪式中关村街头雕塑脱氧核糖碱基磷酸AGCT基本单位－脱氧核苷酸DNA的结构

鸟嘌呤脱氧核苷酸胞嘧啶脱氧核苷酸P脱氧核糖AP脱氧核糖TP脱氧核糖GP脱氧核糖C四种脱氧核苷酸：

腺嘌呤脱氧核苷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸

脱氧核苷酸的连接P脱氧核糖含氮碱基P脱氧核糖含氮碱基ATGCATGCDNA双链的连接DNA分子的立体结构------规则的

双螺旋结构1.双链、反向平行2.外侧：脱氧核糖和磷酸交替连接------基本骨架3.内侧：碱基对碱基互补配对原则

G=C;A=T

1957年Crick又提出了遗传信息传递的“中心法则”

DNA

RNA

protein

1964年MarshallNirenberg和GobindKhorana等终于破译了64个遗传密码(3)中心法则和遗传密码遗传物质应具备的特点：1.携带大量遗传信息；2.自我复制、从亲代到子代传递遗传信息；3.能够让遗传信息得到表达，控制细胞代谢活动，控制生物性状；4.能够突变并保留突变；---------DNA分子碱基对排列顺序的多样性（1）限制性内切酶（restrictionenzymes）

1970年H.O.Smith等分离出第一种限制性核酸内切酶。WernerArber理论预见限制酶HamiltonO.Smith得到第一个限制酶DanielNathans用限制酶切得SV40DNA片断1.2.2基因工程诞生的技术突破1967年5个实验室几乎同时发现了DNA连接酶。（3）载体（vector）

1972年前后使用小分子量的细菌质粒和噬菌体作载体。在细菌细胞里的大量扩增。（4）感受态体系

1970年M.Mandel和A.Higa发现经过氯化钙处理的大肠杆菌容易吸收噬菌体DNA。1972年S.Cohen发现这种处理过的细菌同样能吸收质粒DNA。（2）DNA连接酶（ligase）

1970年Baltimore等人和Temin等人同时各自发现了逆转录酶。（6）琼脂糖凝胶电泳

1960s发明了琼脂糖凝胶电泳，可将不同长度的DNA分离开。（7）DNA测序技术

1975年F.Sanger、A.Maxam和W.Gilbert发明了DNA快速测序技术。（5）逆转录酶（1）Berg的开创性实验

1972年斯坦福大学的PaulBerg小组完成了首次体外重组实验：将SV40的DNA片断与噬菌体的DNA片断连接起来。1.2.3基因工程的诞生

1973年斯坦福大学的S.Cohen小组将含有卡那霉素抗性基因的大肠杆菌R6-5质粒与含有四环素抗性基因的另一种大肠杆菌质粒pSC101连接成重组质粒，具有双重抗药性。后来又把非洲爪蟾核糖体基因片断同pSC101质粒重组，转化大肠杆菌，并在菌体内成功转录出相应的mRNA。这是第一次成功的基因克隆实验。（2）Boyer-Cohen实验pSC101抗四环素pR6-5抗卡那霉素DNA连接酶重组DNA分子EcoRI抗卡那霉素基因培养平皿卡那霉素基因四环素\卡那霉素基因大肠杆菌四环素平板抗四环素抗卡那霉素抗四环素\抗卡那霉素（1）目的基因的获取从复杂的生物基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片断。（2）重组体的制备将目的基因的DNA片断插入到能自我复制并带有选择性标记（抗菌素抗性）的载体分子上。1.3基因工程的研究内容(步骤）将重组体（载体）转入适当的受体细胞中。(4)克隆鉴定挑选转化成功的细胞克隆（含目的基因）。(5)目的基因表达使导入寄主细胞的目的基因表达出我们所需要的基因产物。(3)重组体的转化基因工程基本过程1.4

基因的结构-基因操作的理论基础

基因是遗传信息的基本单位。基因是一段核苷酸序列；可以是连续的，也可以是不连续的；可以是DNA也可以是RNA；可以存在于染色体上，也可以存在于染色体之外（如质粒等）。基因具有可分性、重叠性和可变性。

什么是基因？1.基因是存在于细胞内有自我繁殖能力的遗传单位.

2.基因是一个具有遗传功能的特定核苷酸序列的DNA片段.

3.编码一个RNA或一条多肽链的DNA片段称为一个基因.

4.基因是生物体遗传的基本单位,存在于细胞的染色体上,作直线排列.

5.基因是生物体内一切具有自主复制能力的最小遗传功能单位,其物质基础是一条以直线排列具有特定核苷酸序列的核酸片段.下面收录了对"基因"的五个定义1.4.1原核细胞的基因结构编码区非编码区非编码区编码区上游编码区下游调控遗传信息的表达(调控序列)编码蛋白质(编码序列)原核细胞的基因结构编码区非编码区非编码区与RNA聚合酶结合位点RNA聚合酶是一种蛋白质，能识别并与调控序列中的结合位点结合，能催化DNA转录为RNA原核细胞的基因结构与RNA聚合酶结合位点RNA聚合酶AGGTCACGTCGTCCAGTGCAGC原核细胞的基因结构与RNA聚合酶结合位点AGGTCACGTCGTCCAGTGCAGCRNA聚合酶AGGUCACGUCG

原核细胞的基因结构与RNA聚合酶结合位点AGGTCACGTCGTCCAGTGCAGCAGGUCACGUCG1.4.2真核细胞的基因结构编码区非编码区非编码区编码区下游调控遗传信息的表达(调控序列)外显子(能编码蛋白质)内含子(不能编码蛋白质)真核细胞基因结构和原核细胞基因结构的异同点1）相同点：都是由能够编码蛋白质的编码区和具有调控作用的非编码区组成。2）不同点：原核细胞基因的编码区是连续的，真核细胞基因的编码区是间隔的，不连续的。在真核细胞中，控制不同种类的蛋白质的基因，所含的外显子和内含子的数目是不同的，长度也有差别。注：内含子：指真核生物基因中不能翻译成蛋白质的DNA片段；外显子：能够翻译成蛋白质的任一间断的基因片段，一个基因可有多个外显子。（1）共线性基因决定蛋白质的序列组成，是由密码子对应特定氨基酸所决定的。当一个基因的核苷酸序列与其产物的氨基酸序列是一一对应时，则表明它们是共线性的。（2）基因及其产物的非共线性

由于真核生物的断裂基因具有内含子，使得一个基因的核苷酸序列与其产物的氨基酸序列不是一一对应关系，则表明基因及其产物是非共线性的。

ATG

GCG

GCT

GCC

GGT

GCT

CTC

TTT

TTC

CTA

TTC

TCC

TCC

TTC

TGC

MetAlaAlaAlaGlyAlaLeuPhePheLeuPheSerSerPheCysATG

GCG

GCT

GCC

GGT

GCT

CTC

TTT

TTC

CTA

TTC

TCC

TCC

TTC

TGC

MetAlaAlaAlaGlyAla…….…..PheSerSerPheCys1.4.3基因及其产物的共线性与非共线性DNA的复制过程1）基因制药

通过DNA重组技术将天然存在于人体内起着各种生理功能且含量甚少以至微量的活性多肽、蛋白质、糖肽所编码的基因片断导入微生物或哺乳动物细胞中进行扩增和表达,通过纯化、提取制备出高纯度、高活性的生物有效物质。1.5基因工程的应用

1.5.1基因工程在医药上的应用1976年，27岁的风险投资人RobertSwanson与UniversityofCalifornia的教授HerbBoyer共饮了几杯啤酒，讨论了基因工程技术的商业前景。讨论结束时，他们决定建立一个公司，并取名为Genentech（GeneticEngineeringTechnology）。1982年,首次批准重组动物疫苗----抗球虫病疫苗。1982年,第一个基因工程药物----人胰岛素生产上市。生物活性多肽单克隆抗体疫苗三大类基因药物产品:制造一种专一抗体的浆细胞进行培养，就可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群，即单克隆。单克隆细胞将合成针对一种抗原决定簇的抗体，称为单克隆抗体。

将正常的外源基因导入靶细胞中以弥补靶细胞所缺失或突变的基因、或抑制异常表达的基因。2）基因治疗1）提高植物的光合作用效率①提高CO2的固定率改变与光合作用有关的酶的结构和组成（如二磷酸核酮糖羧化酶）。②提高光能吸收率和转化率改变光能交换系统的分子的基因结构。1.5.2基因工程在农业生产中的应用使非固氮植物转变为固氮植物或能与根瘤菌共生固氮。3）转基因植物是农业生物技术的主要内容。是将克隆到的特殊基因导入受体植物，使之增加一些优质性状（高产、稳定、优质、抗虫、抗病等）。2）提高豆科植物的固氮效率转基因植物特性申请单位马铃薯抗病毒中科院抗病中国农科院抗逆北京大学高营养品质北京大学水稻抗虫中科院抗病毒北京大学抗病农科院抗除草剂水稻所上市的转基因产品棉花抗虫中科院农科院美国孟山都公司玉米抗虫美国孟山都公司等大豆抗除草剂农科院小麦抗除草剂北京农林科学院高营养品质北京农林科学院番茄抗病北京大学耐储存中科院华中农大甜椒抗病北京大学辣椒抗病毒中科院烟草抗病毒北京大学抗虫中科院北京大学番木瓜抗病毒中国热带作物广藿香抗病农业科学学院矮牵牛改变花色北京大学杨树抗虫中科院微生物提高固氮效率中科院农科院华中农大广东微生物所将外源基因导入动物细胞，并在基因组内稳定整合，遗传给后代。改善子代特性；研究遗传性疾病的动物模型；使动物成为生物反应器生产有用的活性蛋白等。4）转基因动物大鼠生长激素基因转入小鼠1）纤维素的开发利用克隆各种参与纤维素降解的酶的基因，导入酿酒酵母，就可能利用廉价的纤维素来生产葡萄糖，发酵成酒。2）酿酒工业用外源基因改造酿酒酵母，产生优质的啤酒。或用酿酒酵母生产蛋白质等。1.5.3基因工程在工业中的应用1）检测水污染用重组细菌或转基因鱼等检测水污染。2）生物降解用带有重组质粒的“超级菌”分解油（烷烃类）、有机农药污染。1.5.4基因工程在环境保护中的应用1976GenentechGenentech创立1977首次在微生物中生产了人蛋白生长激素抑制素1978克隆了人胰岛素基因1979克隆了人生长激素基因1980公司上市，募集$35million1982第一个基因重组药（人胰岛素）上市1985第一个自己生产的产品（人生长激素）1987生产组织纤溶酶原激活剂（TPA）1990生产interferon1Genentech的骄人业绩基因工程试剂的高回报碱性成纤维细胞生长因子231元/ug红细胞生成素1072元/ug白细胞介素-2410元/ug巨细胞粒细胞集落刺激因子1960元/ug胰岛素10.2元/mg1）对环境