第1章基因工程

基因工程概论

参考教材

1.基因与基因工程的定义2.基因工程的理论基础3.基因工程的技术基础及诞生4.基因工程技术的发展5.基因工程的研究内容6.基因工程的应用和面临问题主要内容第一章导论1.基因与基因工程的定义★

基因：核酸分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列，是遗传物质的最小功能单位。

按照是否能转录、翻译分类：

转录、翻译蛋白质

转录、不翻译反义RNA等

不转录、不翻译调控序列如：操纵基因

孟德尔：生物每一个性状都是通过遗传因子来传递的，遗传因子是一些独立的遗传单位。1940s：“一个基因一种酶”的假说，认为基因对性状的控制是通过基因控制酶的合成来实现的。（多个基因一个酶，一个基因多个酶）RNA基因的发现：

ribozymes,

microRNA等；RNA基因组的发现

Amodernworkingdefinitionofageneis"a

locatableregion

of

genomic

sequence,correspondingtoaunitofinheritance,whichisassociatedwithregulatoryregions,transcribedregions,andorotherfunctionalsequenceregions

基因工程：在体外对不同生物的遗传物质（基因）进行剪切、重组、连接，然后插入到载体分子中（细菌质粒、病毒或噬菌体DNA)，转入微生物、植物或动物细胞内进行无性繁殖，并使之行使正常功能和稳定遗传，从而构建出新的物种或菌株的遗传学技术。

按照工程学的方法设计和操作DNA，形成新的组合，并能引入新的宿主中行使功能，克服了基因信息在生物物种之间的固有限制。Geneticengineeringaltersthegeneticmakeupofanorganismusingtechniquesthatremove

heritable

materialorthatintroduceDNApreparedoutsidetheorganismeitherdirectlyintothehostorintoacellthatisthen

fused

orhybridized

withthehost.

1.基因与基因工程的定义2.基因工程的理论基础3.基因工程的技术基础及诞生4.基因工程技术的发展5.基因工程的研究内容6.基因工程的应用和面临问题主要内容2.基因操作技术建立的理论基础理论基础（19世纪后期到20世纪50s初）2.1确定了蛋白质是生命活动的主要基础物质2.2确定了生物遗传的物质基础是DNA

1952年Hershey和Chase利用同位素标记的噬菌体转染实验进一步证实，传递遗传信息的是DNA而不是蛋白质。赫尔希也由于这一研究而荣获1969年的诺贝尔医学生理学奖。1944年，Avery等人发表了"脱氧核糖型的核酸是III型肺炎球菌转化要素的基本单位“,即DNA是细菌的转化因子，第一次证明了DNA是遗传物质。肺炎双球菌转化实验噬菌体转染实验★肺炎双球菌转化实验1928年,Griffith设计的实验：

光滑型菌株注入小鼠体内：死亡粗糙型菌株注入小鼠体内：无害光滑型菌株加热杀死后，再注入小鼠体内：无害杀死的光滑型菌株与粗糙型菌株一起注入小鼠体内：死亡说明被杀死的光滑型菌株含有某种因子，它进入了粗糙型菌株中将它转化成了致死的光滑型菌株，但没有证明这种因子是什么物质。

1934年，Avery实验从加热杀死的光滑型菌株中提取DNA，然后将除去了蛋白质的DNA与粗糙型菌株混合后，再注入小鼠体内：死亡。说明带有有毒性的和能使荚膜形成的信息分子DNA整合进了无毒菌株的染色体里，使它转化成了有毒的菌株。实验证明了Griffith所说的转化因子就是DNA。理论基础（20世纪50s初～60s）2.3DNA双螺旋结构模型的建立

1953年，Watson和Crick在《自然》杂志上发表DNA双螺旋结构的论文，并发现了DNA的复制机理。1958年诺贝尔奖

2.4遗传信息传递中心法则的建立

从1961年开始，以Nirenberg等为代表的一批科学家，确定遗传信息是以密码方式传递的，每三个核苷酸组成一个密码子，代表一种氨基酸。到1966年全部破译了64个密码，编排了一个震惊世界的密码字典，阐述了中心法则，提出的遗传信息流是DNA→RNA→蛋白质。2.5对蛋白质结构与功能的进一步认识

1956-58年Anfinsen和White根据对酶蛋白的变性和复性实验，提出蛋白质的三维空间结构是由其氨基酸序列来确定的原则2.基因操作技术建立的理论基础1.基因与基因工程的定义2.基因工程的理论基础3.基因工程的技术基础及诞生4.基因工程技术的发展5.基因工程的研究内容6.基因工程的应用和面临问题主要内容3.1限制性内切酶（restrictionenzymes）1968年第一个限制酶EcoK马特·梅索森1970年H.O.Smith等分离出第一种限制性核酸内切酶WernerArber理论预见限制酶DanielNathans用限制酶切得SV40DNA片断HamiltonO.Smith得到第一个限制酶1978年Nobel生理与医学奖3.基因工程的技术基础和诞生★3.2DNA连接酶（ligase）1967年MartinGellert从大肠杆菌中发现DNA连接酶3.3载体（vector）1972年前后使用小分子量的细菌质粒和噬菌体作载体，在细菌细胞里的大量扩增。3.4感受态体系1970年M.Mandel和A.Higa发现经过氯化钙处理的大肠杆菌容易吸收噬菌体DNA。1972年S.Cohen发现这种处理过的细菌同样能吸收质粒DNA。3.5琼脂糖凝胶电泳1960s发明了琼脂糖凝胶电泳，可将不同长度的DNA分离开。1980年Nobel化学奖1972年斯坦福大学的PaulBerg小组完成了首次体外重组实验：将SV-40病毒DNA与噬菌体P22DNA

片断连接起来。1.Berg的开创性实验基因工程的诞生★构筑了第一个重组的DNA分子，这意味着生物体的遗传性状可以人为地改造2.Boyer-Cohen实验1973年斯坦福大学的S.Cohen小组将含有卡那霉素抗性基因的大肠杆菌R6-5质粒与含有四环素抗性基因的另一种大肠杆菌质粒pSC101连接成重组质粒，具有双重抗药性。后来又把非洲爪蟾核糖体基因片断同pSC101质粒重组，转化大肠杆菌，并在菌体内成功转录出相应的mRNA。这是第一次成功的应用质粒进行外源基因克隆与表达实验，打破了基因的物种界限。StanleyCohen1986Nobel生理医学奖（和此无关）HerbBoyerBoyer-Cohen实验R6-51976年，Boyer与斯旺逊共同组建了Genentech公司，促进了基因工程的发展：1977年该公司成功实现了在大肠杆菌中表达人类蛋白质——生长激素抑制素的成就，首次实现在其他物种中表达人类蛋白质，具有里程碑意义。

1978年，公司又成功生产出人胰岛素1979年生长素1980年干扰素1.基因与基因工程的定义2.基因工程的理论基础3.基因工程的技术基础及诞生4.基因工程技术的发展5.基因工程的研究内容6.基因工程的应用和面临问题主要内容4.基因操作技术的发展☆1975年，DNA测序技术

F.Sanger、A.Maxam和W.Gilbert发明了DNA快速测序技术1975～1981各种印迹技术（DNA、RNA、蛋白质）1980年：显微注射培育出第一个转基因动物：转基因小鼠1983年：农杆菌介导培育出第一例转基因植物：转基因烟草1980年Nobel化学奖1983年，PCR技术美国人KaryB.Mullis发明PCR仪，建立了DNA体外扩增技术。1987年发表了“SpecificsynthesisofDNAinvitroviaapolymerase-catalyzedchainreaction”，于1993年获诺贝尔化学奖。1987年，基因敲除技术

Thompsson首次建立了完整的胚胎干细胞基因敲除的小鼠模型。直到现在，运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最普遍的使用方法。

1992年，基因芯片技术

Affymatrix公司Fodor领导的小组运用半导体照相平板技术，对原位合成制备的DNA芯片作了首次报道，这是世界上第一块基因芯片。1995年，Stanford大学的P.Brown实验室发明了第一块以玻璃为载体的基因微矩阵芯片。标志着基因芯片技术进入了广泛研究和应用的时期。LIC（LigationIndependentCloning)技术基因组编辑技术4.基因操作技术的发展1.基因与基因工程的定义2.基因工程的理论基础3.基因工程的技术基础及诞生4.基因工程技术的发展5.基因工程的研究内容6.基因工程的应用和面临问题主要内容5.基因操作的研究内容

5.1基础研究

(1)克隆、表达载体开发：原核、真核微生物的克隆载体；Ti质粒及其衍生载体（植物基因工程）；动物病毒克隆载体（动物基因工程）；构建新载体（适于高等动植物转基因表达载体和定位整合载体），应大力发展。简化操作，提高克隆和表达效率（2）受体系统：

克隆载体的宿主：外源目的基因表达场所

原核,如大肠杆菌，早期的蓝藻

真核单细胞生物如酵母菌。人和高等动、植物复杂基因组文库的受体系统

小球藻和衣藻，高等植物受体（愈伤组织、细胞和原生质体、部分组织和器官），双子叶植物拟南芥、烟草，单子叶植物水稻、玉米等。

动物体细胞再分化能力差，主要是生殖细胞或胚细胞受体，已获转基因鼠、鱼等。

人体细胞受体。转基因细胞系作病理研究，以异常生长细胞作受体，通过转基因使其回复正常生长状态（基因治疗）。

扩展基因操作的对象（3）目的基因

开发人们特殊需要的基因，即目的基因（优良性状的基因、致病基因）。发达国家激烈竞争的焦点，有限的战略性资源，可申请新基因专利。

自然界调取，构建基因组文库或cDNA文库；PCR直接从某生物基因组扩增；DNA改组通过人工进化获取新基因；人工设计与合成已获目的基因大致种类：与医药相关的基因；抗病、虫害和恶劣环境的基因；编码特殊营养价值的蛋白或多肽基因等。

2008年发现一种粉红粘帚霉能将纤维素变成生物燃料，成分与柴油等燃料相似粉红粘帚霉排出的气体大部分都是碳氢化合物，其中至少有8种化合物是柴油中最丰富的成分

基因组：某种生物的全部基因：

1990年开始实施“人类基因组计划”，2000年6月已绘制“工作框架图”。意义：人生长、发育、繁殖，遗传性疾病的病因（基因治疗），优生优育。（P6)“水稻基因组计划”：中国水稻（籼稻）基因组“工作框架图”和数据库已完成。中、英两国合作“家猪基因组计划”。

（4）工具酶

指体外进行DNA合成、切割、修饰和连接等系列过程中所需要的酶（DNA聚合酶、限制性核酸内切酶、修饰酶和连接酶等）。

限制性核酸内切酶：有规律地切割DNA，获得特定末端的DNA片段。研究热点：耐热内切酶和长识别序列稀切酶。

DNA连接酶、重组酶

DNA聚合酶：人工合成序列、引物等DNA小片段以及含基因的较大的DNA片段，制备DNA探针。已发现的多种耐热性DNA聚合酶有Taq、Tth、Bst、Pwo、pfu等。

DNA修饰酶：修饰DNA分子的有甲基化酶，修饰末端的有碱性磷酸酯酶、转移酶、核酸外切酶等。5.2新技术开发：

基因导入技术：一系列用于不同类型受体细胞的DNA转化方法和病毒转导方法；基因枪、电激仪等克服了某些克隆载体应用的物种局限性，提高外源DNA转化的效率。

基因的检测技术：放射性同位素标记探针，非放射性标记DNA探针和荧光探针技术。

基因分离技术：凝胶电泳可分开几万碱基的DNA分子或DNA片段；脉冲电泳能分开上百万碱基的DNA分子或片段或完整的染色体。

DNA分子连接技术：多片段一步克隆法无痕修饰技术：没有任何多余的序列残留在DNA上基因组编辑技术：同源重组和非同源重组，新型人工核酸酶

☆1.基因与基因工程的定义2.基因工程的理论基础3.基因工程的技术基础及诞生4.基因工程技术的发展5.基因工程的研究内容6.基因工程的应用和面临问题主要内容

药物(活性肽、疫苗等）、诊断与治疗(见下表）生物基化学品、酶工业、发酵工业（生物乙醇、有机酸等)

环保（降解废、毒物等）农业、食品（抗逆、抗病虫害、性状改良的转基因农作物等）观赏娱乐6.基因操作技术的应用和问题

☆在美国