第七章植物原生质体培养及细胞融合2014

内容植物原生质体分离，植物原生质体培养，植物细胞融合。要求了解原生质分离、纯化、活力测定及其影响因素，掌握植原生质体培养的方法、步骤和影响因素；理解植物细胞融合的原理及方法。第七章原生质体培养

植物细胞中除去细胞壁的裸露的有生活力的部分。除了没有细胞壁外，具有细胞的一切特征。原生质体包括▲细胞质膜▲膜内细胞质▲其他具有生命活性的细胞器，如细胞核、线粒体和高尔基体等。原生质体（protoplast）原生质体培养意义是植物细胞工程的核心技术。

1.除去了细胞壁，为植物细胞之间的融合扫平了障碍，实现体细胞杂交，为制造新杂种开辟了道路。

(克服远缘杂交不亲和性)2.原生质体是各种遗传操作的理想受体，从而可以进行品种的遗传改良。可摄入外源DNA，细胞器、细菌或病毒颗粒，为高等植物的遗传饰变打下基础。3.获得细胞无性系和选育突变体的优良起始材料。一、原生质体的分离（一）材料来源植物的茎、叶、胚、子叶、下胚轴等器官组织以及愈伤组织和悬浮培养细胞均可作为原生质体分离的材料。

目前较多采用叶片分离原生质体，但分裂旺盛的、再分化能力强的愈伤组织或悬浮细胞系，尤其是胚性愈伤组织或胚性悬浮细胞系是最理想的原生质体分离材料。

第一节原生质体的分离与纯化材料预处理意义▲提高原生质体的分裂频率；▲逐步提高植物材料的渗透压，以适应培养基中的高渗环境。方法◆暗处理豌豆枝条取下后，分离原生质体前，先在黑暗中（一定湿度）放1-2d，提高原生质体存活率高，并能继续分裂；◆预培养羽衣甘蓝先去叶下表皮，再在诱导愈伤组织的培养基中预培养7d，再去壁，原生质体高度液泡化，叶绿体也解体；◆低温处理龙胆试管苗的叶片只有用4℃低温处理后，分离得到的原生质体才能分裂。（在很多情况下材料不必经过专门的预处理）1.

机械法Klercker于1892年最早进行分离高等植物原生质体的研究。其方法是把细胞置于一种高渗的糖溶液中，使细胞发生质壁分离，原生质体收缩成球形，然后用利刃切割，发生质壁分离的细胞壁被切去后释放出原生质体。缺点◆原生质体的产量低；◆方法繁琐费力；◆对分生细胞和其它液泡化程度不高的细胞不适用。未得到广泛应用。优点

能够排除外加酶对离体原生质体的结构和代谢活性的有害影响。（二）原生质体分离方法2.

酶分离法1960年，Cocking首先利用纤维素酶处理番茄根尖，分离得到收率高、活力强、完整性好的原生质体。1968年，纤维素酶和离析酶商品化生产后，大量进行植物原生质体的研究。现在果胶酶处理→单细胞－－纤维素酶处理→原生质体分离原生质体最有效方法。细胞壁的组成纤维素

半纤维素

果胶质少量蛋白质25-50％53％5％纤维素酶半纤维素酶果胶酶酶的种类及特点◆

纤维素酶主要含有纤维素酶C，作用于天然的和结晶的纤维素，具有分解天然纤维素的作用，还含纤维素酶CX，作用于定形的纤维素，可分解短链纤维素，另含有纤维素二糖酶、木聚糖酶、萄聚糖酶、果胶酶、脂肪酶、磷脂酶、核酸酶、溶菌酶等，总体作用是降解纤维素，得到裸露的原生质体。

◆半纤维素酶降解半纤维素为单糖或单糖衍生物。◆

果胶酶使细胞间的果胶质降解，把细胞从组织内分离出来。此外，还有蜗牛酶（主要用于花粉母细胞和四分体细胞）等。原生质体酶分离法◆两步分离法用果胶酶离析植物组织，收集细胞；经洗涤后用纤维素酶解离细胞壁，然后获得原生质体。日本产的Onozuka纤维素酶常和果胶酶结合使用。◆一步分离法一定量的纤维素酶和果胶酶组成混合酶液，对材料进行一次性处理。上海植物生理研究所生产的ZA3-867纤维酶是多种酶的复合物，含有纤维素酶，果胶酶，半纤维素酶等，分离细胞壁的效果较好。酶液的配制◆酶的配比和浓度果胶酶/纤维素酶纯度高，但浓度不宜太高；木本植物加入半纤维素酶。如果溶液中的渗透压和细胞内的渗透压不同，原生质体有可能涨破或收缩，因此在酶液、洗液和培养液中渗透压

应大致和原生质体内的相同，或者比细胞内渗透压略大些。

较高水平的渗透剂可以阻止原生质体的破裂和出芽，但同时也可能抑制原生质体的分裂。①糖溶液系统包括甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖等，浓度约在0.40-0.80mol／L。可促进分离的原生质体再生细胞壁并继续分裂；②盐溶液系统包括KCl、MgSO4和KH2PO4等。

此外，酶溶液里还可加入适量的葡聚糖硫酸钾，提高原生质体的稳定性；使RNA酶不活化；并使离子稳定。◆渗透稳定剂◆pH酶溶液的pH值对原生质体的产量和生活力影响很大。用菜豆叶片作培养材料时发现原始pH值为5.0时，原生质体产生得很快，但损坏较严重，并且培养后大量破裂。当pH值提高到6.0时，最初原生质体却产生少，但与pH值为5.0时处理同样时间后相比，原生质体数量显著增加。原始pH值提高到7.0时，生活的原生质体数量进一步增加，损伤的原生质体也少得多。

分离叶肉原生质体的完整流程表面灭菌的叶片①撕去下表皮酶溶液及渗压稳定剂（叶段漂浮其上）②抽真空、振荡保温8hr原生质体沉于培养皿底吸掉酶液原生质体悬浮于清洗液中

⑤离心2次，第2次离心前重新悬浮于高蔗糖清洗液中原生质体（上层）⑥重新悬浮于培养基中取少量样品用血球板计数以适当的植板密度重新悬浮于培养基中③④（一）原生质体的纯化1.

沉降法（过滤离心法）-应用最广利用比重原理，低速离心使原生质体沉于底部。

过滤酶处理混合液，30-40µm微孔滤膜，

低速离心，150g以下，3-5min，弃上清，用液体培养基或甘露醇溶液悬浮洗涤，重复2-3次，

1-2ml液体培养基悬浮原生质体，备用。优点：操作方便；损失少。缺点：纯度不高二、原生质体的纯化与活力测定2.

漂浮法利用比重大于原生质体的高渗蔗糖溶液，离心后

原生质体位于蔗糖溶液和原生质体悬浮培养基的界面上，

残渣碎屑沉到管底。

先加蔗糖溶液（20%左右），

酶处理混合液置于其上，

离心，150g，5min

用液体培养基或甘露醇溶液悬浮洗涤2-3次,1-2ml液体培养基悬浮原生质体，备用。优点：纯度高缺点：收率低。3.

界面法采用2种或2种以上密度不同的溶液，离心后使完整的原生质体处在两液相的界面。最早Hughes(1978)两液相下层：450mM/L蔗糖上层：450mM/L甘露醇Piwowarczyk（1978）改进了上述方法两液相下层：培养基，含500mM/L蔗糖中层：培养基，含140mM/L蔗糖，360mM/L山梨醇上层：含原生质体酶液，含300mM/L山梨醇和100mM/LCaCl2现在用不同连续梯度Ficoll（聚蔗糖）溶液，上面为酶-原生质体混合液，经离心（150g，5min）,不同比重的原生质体漂浮在不同浓度梯度的界面上。优点：收获的原生质体大小均匀一致。缺点：收率低。纯化后的叶肉原生质体（二）原生质体活力的测定1.以胞质环流作为进行活跃代谢的指标，

但对在细胞周围携有大量叶绿体的叶肉细胞原生质体来说，这种方法的作用不大；2.以氧的摄入量作指标，摄入量可通过一个能指示呼吸代谢强度的氧电极进行测定。3.以光合活性作指标。4.以完整的质膜排斥伊凡蓝的能力作指标。5.以荧光素双醋酸酯（FDA）的染色能力为指标。一、供体植物的选择

供体组织的生理状态很重要。一般情况下，在可控光、温、湿的环境条件下能得到重复的结果，

即在无菌条件下生长的幼苗制备原生质体较好。第二节原生质体培养1.基本培养基

MS和B5，或其衍生的培养基。

CaCl2促进细胞分裂。钙可增强原生质体稳定性，提高分裂频率，明显改变细胞质内外的离子交换。

NH4NO3降低细胞分裂频率。2.生长调节物质生长素/细胞分裂素类。针对不同的研究对象，培养基中生长素和细胞分裂素的水平要做适当调整。二、原生质体培养基3.渗压剂在没有再生出一个坚韧的细胞壁之前，原生质必须有培养基渗透压的保护。高渗溶液，培养时一般逐步过渡。通常的渗透剂是甘露醇和山梨醇。

MS＋NAA2.0ppm＋BA0.5ppm＋3％蔗糖＋9％甘露醇

4.pH：5.6-6.0培养基用醋酸纤维微孔滤膜过滤灭菌。新分离出来的原生质体应在散射光或黑暗中培养。

培养温度一般在25-30℃下。三、培养条件

1.液体浅层培养

原生质体悬浮在液体培养基（约2×105/ml密度）

—将原生质体悬浮液移到直径为6cm的培养皿中（2-3mm为宜）

—5-10天后开始原生质体分裂

优点▲通气好；▲原生质体代谢物易扩散，防止有害物质积累过多造成毒害；▲转移添加新鲜培养基方便，便于观察和照相；▲操作简单；▲可微量培养，细胞植板率高。缺点：原生质体沉淀，分布不均；细胞团聚集多，难成单细胞株系。四、培养方法

原生质体（密度为4×105/ml）与等量体积琼脂糖培养基均匀混合

—置于6cm培养皿（2-3mm）,

—暗培养

—5-7天原生质体开始分裂。

优点

原生质体分布均匀，利于分裂，容易获得单胞株系；

可定位观察。

缺点

原生质体易受热伤害，易破碎；

原生质体始终处于高渗透压胁迫下生长发育缓慢，植板率低。

2.

固体/平板培养原生质体采用平板培养方法包埋在培养皿底层；

上面再加入相同成分的液体培养基，

暗培养。

需更换新鲜液体培养基。

优点

原生质体分布均匀，有利于分裂，易获单细胞株系；

能除去抑制分裂的有害物质，细胞植板率高。

缺点

原生质体易受热伤害，易破碎。

3.

（固、液）双层培养五、低密度培养与细胞培养相似，原生质体初始植板密度对植板效率有显著的影响。原生质体培养的一般密度为104-105。高密度下，个别原生质体形成的细胞团在相当早时就交织在一起，如果原生质体群体在遗传上是异质的，就会形成嵌合体组织。在体细胞杂交和诱发突变的研究中，最好能获得个别细胞的无性系。需要低密度（100-500）原生质体培养。1.

培养基KM8pKao&Michayluk（1975）Vicia

hajastana（一种蚕豆）单细胞再生出壁，并分裂形成愈伤；在苜蓿、豌豆和Vicia中培养中，低密度下（小于100）分裂的更快；培养马铃薯原生质体及马铃薯/番茄原生质体融合产物获得成功。黑暗或近于黑暗（50lx）培养。2.培养方法1）饲养细胞层法

用X射线或紫外线照射细胞（106），抑制细胞分裂，但不破坏细胞代谢，

将其清洗，

植板在软琼脂培养基上，此平板称饲喂层，

然后将未照射处理的原生质体铺在饲喂层上。

特点

以一种植物细胞制成的平板，支持另一种植物原生质体的生长。

饲喂层没有种的特异性。烟草原生质体植板密度低于104时，一般不能分裂，用此方法，植板密度可低至10-100。2种类型的活跃代谢和正在分裂的原生质体

混合在液体培养基中一起培养。

用于某些物种原生质体或杂种细胞的培养。

条件

2个物种原生质体间能发生有效的互馈；

其产生的愈伤组织形态上能彼此区分。2）共培养法3）Cuprak微滴法高国楠（1977）及Gleba（1978）设计特别培养皿培养单个原生质体及其再生的细胞。两室大的内室：很多小穴，加入原生质体悬浮液（0.25-0.5µl）；小的外室：注入无菌水，保持培养皿内湿度。可进行单个原生质体培养。六、细胞壁的形成培养2-4天，原生质体失去其特有的球型外观，这是再生新壁的象征。研究认为，旋花科植物原生质体只有在外源供应一种易于代谢的碳源（蔗糖）时，细胞壁才能再生。培养基中若存在电解质渗透压调节剂时会抑制壁的再生。壁的形成与细胞分裂有直接关系，凡是不能再生壁的原生质体就不能进行正常的有丝分裂。愈伤组织形成后，转入不含渗透压调节剂的培养剂中，其培养及植株再生与一般组织培养方法相同。原生质体培养的程序

一、原生质体融合意义

原生质体融合也称体细胞杂交，

即，分离下来的不同亲本杂交的原生质体，

在人工控制下互相融合成一体。

自然条件下，原生质体自然融合频率极低，

必须加以一定的方法诱导，才能促进原生质体的融合。第三节原生质体融合原生质体融合◆打破了种间界限（生殖隔离），使基因交流扩大范围；◆克服有性杂交特别是远缘杂交的不亲和性；◆扩大了遗传变异及种质资源的范围。原生质体融合的意义甘薯原生质体融合植株1.

化学法融合1）无机盐诱导融合1909年，Kuster证实，低渗NaNO3处理可诱导发生质壁分离表皮细胞2个原生质体融合。缺点异核体形成频率不高，尤其是对于高度液泡化的叶肉原生质体。二、原生质体融合方法Carlson等（1972）获得第一个体细胞杂种2）高pH-高钙离子诱导融合Keller和Melcher（1973年）强碱性的高浓度钙离子（pH，10.5；钙离子，50mmol/L）37℃处理30min，两个品系烟草叶肉原生质体很容易融合。1977年，获得烟草种间和种内体细胞杂种。对矮牵牛效果也很好，但对有些物种，高pH可能有毒。高国楠等（1974）提出，现被广泛采用。

滴150µl混合双亲的原生质体悬浮液于载体玻片上，形成一层薄层;

吸取PEG融合诱导液（28-58%，分子量1500-6000）450µl，

使其逐渐与原生质体接触，促使原生质体相粘连；

培养基进行清洗。

高Ca2+-高pH溶液清洗，

可提高原生质体融合频率。3）聚乙二醇（PEG）诱导融合优点

▲采用聚乙二醇作为融合剂时，

异核体形成的频率很高，可重复性很强；

▲对大多数细胞类型来说毒性很低；洋葱烟草将原生质体悬浮液离心，去上清，用电击液（10%甘露醇，0.1mmol/L醋酸钙，0.5mmol/L醋酸镁）悬浮，置于融合小室；

在电融合仪的交变电场作用下，原生质体彼此靠近，紧密接触，在两极间排成串珠状。给予瞬间的高强度电脉冲，质膜发生可逆性电激穿，导致融合。电融合法的优点（与化学融合法相比）▲简单、迅速、效率高；▲经融合处理后没有中毒反应；▲需要特殊设备，不常采用。2.

物理法融合（电融合技术）德国农业科学院培育枝头上开花、结出鲜红的番茄，而地下块茎却是马铃薯。番茄马铃薯德国汉堡大学把牛肉细胞和番茄细胞融合成杂交种细胞，繁殖出一种杂交新品种。▲内含牛肉动物蛋白和番茄植物蛋白各半；▲蛋白质总量为普通番茄的40倍；▲所结出的果实

兼有牛肉味和番茄味，营养也较全面。牛肉番茄◆对称融合完整原生质体融合，产生核－核、胞质－胞质重组的对称杂种。常因分裂不同步使一方的染色体全部或部分丢失。◆不对称融合使一方的细胞核失活（胞质体）或同时也使另一方的胞质失活（核质体），产生不对称杂种。◆微原生质体融合只有一条或几条染色体的微核与原生质体融合。原生质体融合类型◆胞壁再生比原生质体培养稍滞后。◆核融合异核体、同核体及多核体的混合群体。异核体双核分裂同步——子细胞含双亲的遗传物质；

不同步——一方染色体丢失；◆细胞增殖有的在条件适合时继续分裂形成细胞团或愈伤组织；有的中途停止分裂、死亡。融合体的培养和发育经过融合处理后的原生质体群体内包含未融合的2种亲本原生质体，同核体、异核体、各种其他核-质组合。异核体是未来杂种的潜在来源，约占0.5-10%，但其在生长和分化两个方面均无竞争优势可言，有效鉴定和选择杂种细胞，是体细胞杂交成功的关键。三、杂种细胞的筛选与鉴定1.根据物理特性直观选择1）根据可见标志选择如根据亲本原生质体含有的色素，对融合产物进行鉴定，在其可辨特征消失之前，将其从混合群体中分离出来单独培养。主要用于非绿色原生质体

与含有叶绿体的原生质体的融合。用不同荧光染料标记2种原生质体，杂种存在2种荧光染料。在酶解时，染料

0.5mg/L，加到酶混合液中。异硫氰酸荧光素（绿）碱性蕊香红荧光素（红）2）根据荧光标记选择用发不同荧光的荧光染料标记3）低密度植板选择把原生质体以低密度植板在琼脂培养基上，以便追踪个别的杂种细胞及它们的后代。1）激素自主性互补选择2个亲本原生质体生长，需要生长激素，杂种自身能产生生长激素。无激素培养基筛选。Carson筛选出粉蓝烟草和