第8章-PCR技术及其应用-张静2014

第八章PCR技术及其应用前言PCR技术简史第一节PCR技术原理和工作方式第二节PCR产物的克隆第三节PCR扩增未知DNA片段第四节与反转录相关的PCR（自学）第五节PCR产生DNA指纹（自学）第六节实时定量PCR前言PCR技术简史链式反应：chainreaction核链式反应：指能自持进行的原子核反应。

DNA的复制聚合酶链反应的发明PCR：polymerasechainreaction，聚合酶链式反应。1971年，Khorana(霍拉纳)提出：经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。但由于测序和引物合成的困难，以及70年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能，所以，Khorana的设想被人们遗忘了……ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’解旋酶解链酶DNA解旋解链合成引物子链延长设想ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5’AUCGCG5’引物酶引物酶ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5’AUCGCG5’TAGCGCTATCGCATCGACGCT3’ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG3’DNA聚合酶DNA聚合酶1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis(穆利斯)等人发明了聚合酶链反应（PCR）基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制最初采用E.coliDNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错耐热DNA聚合酶1989年美国《Science》杂志列PCR为十余项重大科学发明之首，比喻1989年为PCR爆炸年，Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。引物引物Mullis的构思DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段Taq

DNA聚合酶（Thermusaquaticus)酶活性(%)温度(℃)4050607080901001008060402072℃94℃55℃PCR循环一、PCR的基本原理第一节PCR技术原理和工作方式TargetAmplificationNo.of No.AmpliconCycles CopiesofTarget1 22 43 84 165 326 6420 1,048,57630 1,073,741,8241cycle=2Amplicon2cycle=4Amplicon3cycle=8Amplicon4cycle=16Amplicon5cycle=32Amplicon6cycle=64Amplicon7cycle=128Amplicon二、PCR反应体系缓冲液脱氧三磷酸核苷(dNTPs)引物模板耐热性的DNA聚合酶131

缓冲液10mmol/LTris-HCl，50mmol/LKCl，pH=8.3-9.0，厂商提供。Mg2+是DNA聚合酶的激活剂，厂商提供，使用浓度为0.5-2.5mmol/L反应体系。Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中dNTPs、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。2、脱氧三磷酸核苷(dNTPs)

dATP、dGTP、dCTP、dTTP四种的等量混合物。dNTPs浓度取决于扩增片段的长度。浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量。PCR引物的设计一般原则1.引物长度一般以18～30bp为宜。2.解链温度(Tm值)直接决定了退火温度(Ta值)的高低。两条引物间的Tm值越接近越好。3.避免引物内部出现二级结构。3、引物

使用浓度为0.1-0.5mol/L。

浓度过低则产量低，过高则易导致错配，PCR特异性下降。4.要避免引物自身或引物间特别是3’末端碱基序列互补。5.G/C和A/T碱基均匀分布，G+C含量在40～60%之间，引物碱基序列尽可能选择碱基随机分布。6.引物3’末端碱基一般应与模板DNA严格配对，并且3’末端为G、C或T时引发效率较高。7.引物5’末端碱基可不与模板DNA匹配，可添加与模板无关的序列，便于克隆和表达，但其保护碱基有一定的要求。8.引物的碱基顺序不能与非扩增区有同源性。4、模板单、双链DNA均可。模板纯度不高（混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类）往往是限制PCR扩增的重要因素。一个PCR反应中104至107个模板分子可获得较理想的效果。不同属性的模板所加的理想的量不同。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。5、耐热性的DNA聚合酶均从耐热性的细菌中分离出来，普遍具有5’→3’聚合酶和5’→3’外切酶活性，但在3’→5’外切酶活性、耐热性和附加功能上有差异。常用的有：1）TaqDNA聚合酶：最常用，95℃时的半衰期为40分钟，75℃时活性最强，没有校正功能。2）TthDNA聚合酶：95℃时的半衰期为20分钟，74℃时进行扩增，在MnCl2催化下的高温反转录功能。

3）VentDNA聚合酶：100℃时的半衰期为1.8小时，具校正功能，保真度比Taq高5-15倍。4）PwoDNA聚合酶：100℃时的半衰期大于2小时，有校正功能，保真度高。5）PfuDNA聚合酶：具有极高的热稳定性，目前公认是最保真的。

6）混合DNA聚合酶：将具有校正功能的酶与Taq酶按一定比例混合，具有类似Taq的强启动合成能力，同时又有一定的保真度，而且具有一定的扩增长片段的能力。Taq酶的延伸速度为1-2kb/min，但具有校正功能的酶的延伸速度要小些，一般只能按照600-700bp/min来预计。三、PCR反应程序1、常规程序：94℃左右预变性几十秒至几分钟；

94℃左右变性5秒至1分钟；50-65℃左右退火30秒至1分钟；72℃左右延伸30秒至几分钟；72℃左右最后延伸和加尾3-10分钟；4-25℃保持3分钟或更长。20-35个循环222、退火和延伸温度：

退火温度Ta值由Tm值决定，多数情况下Ta采用Tm减去3-5℃。当退火温度高到与延伸温度接近时，可以将退火和延伸温度合为一个，这时PCR就由三步法变成了两步法。3、反应时间：变性步骤一般为5秒至1分钟。退火时间一般为30秒至1分钟即可。延伸时间从半分钟到10分钟以上不等，由扩增片段的长度和DNA聚合酶的延伸速度共同决定。Taq扩增时按1kb/min计算，具校正活性的酶则按0.6-0.7kb/min计算。4、循环次数：多数为25-35，主要取决于模板属性、模板丰度、引物退火效率、DNA聚合酶的扩增能力。5、PCR反应液的配制：加试剂顺序：双蒸水、缓冲液、MgCl2、dNTPs、正向引物、反向引物、模板、DNA聚合酶。酶要用冰盒取放，禁止因手的接触或暴露于空气中而使酶升温。第一次使用各试剂时要轻柔充分混匀。正确保存各种试剂，尤其是要避免核酸因反复冻融而降解，各试剂宜分装成适量的小管。PCR仪1234522557294时间（min）温度（℃）适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍模板DNA95℃PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点50℃引物1引物2DNA引物PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72℃第1轮结束第2轮开始PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72℃第2轮结束PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点重复30轮后230=1,073,741,824模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增理想拷贝数=2nn循环次数实际拷贝数=(1+x)nX平均效率,约为0.85n循环次数

PCR的特点灵敏度高皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平能从100万个细胞中检出一个靶细胞病毒检测的灵敏度可达3个RFU细菌检测的最小检出率为3个细菌简便、快速一次性加好反应液，2～4小时完成扩增扩增产物一般用电泳分析对标本的纯度要求低血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNAPCR中其它注意的事项1.防止污染试剂小量分装吸头及EP管一次性使用器皿及工作区域要分开，无菌操作2.设立对照：阳性对照：阳性模板阴性对照：阴性模板、无模板第二节PCR产物的克隆一、在PCR产物两端添加限制性酶切位点在PCR引物的5’加上根据需要而设计的酶切位点（保护碱基），PCR产物内部没有该切点。PCR产物经电泳回收后，直接用限制酶进行切割，纯化后与目标载体连接重组。该法适用于直接将PCR产物克隆到表达载体进行功能研究，但构建好的表达载体必须测序才能证明PCR产物的身份正确且没有突变。二、A/T克隆这是目前最通行的PCR产物克隆方法，基本思路是先将PCR产物与特制的T载体进行连接重组，测序证明正确无误后，再从T载体上亚克隆到表达载体上进行功能研究。Taq酶PCR产物的特点：该酶具有末端转移酶活性，通常在其产物DNA分子每条链的3’末端加上一个突出的A。T载体：通过特定制作技术制作的在多克隆位点中间已开环的质粒载体，其每条链的3’末端具有一个突出的T。A/T克隆：将3’末端具一个突出的A的PCR产物与T载体连接重组，转化大肠杆菌，对鉴定为阳性的重组克隆子的多克隆位点区的插入片段进行测序，然后再亚克隆到其它载体进行功能研究等。PCR-TOPO技术：T载体上已经偶连有拓扑异构酶，因此PCR产物无需DNA连接酶而可直接与该T载体进行快速连接重组。三、平末端DNA片段的克隆所有具有校正功能的DNA聚合酶扩增出来的PCR产物均为平末端，有两种克隆思路：一是在PCR完成后加入适量的Taq酶并在72℃保温20-30分钟，A/T克隆。二是将平末端PCR产物与平末端载体进行连接克隆：1、pPCR-ScriptAmpSK(+)克隆载体：连接体系中除加有T4DNA连接酶外，还加有限制酶SrfⅠ，连接过程中载体自连的产物总是被SrfⅠ切开，而重组载体确不能被切开，转化子中重组子的比例就较高。41422、pCR-Blunt克隆载体：载体的lacZ’基因下游融合了一个致死基因ccdB，载体自连转化的大肠杆菌不能存活，重组载体的转化子则能长成菌落，因为致死基因已被插入失活。四、长片段DNA的PCR扩增通常所用的PCR方法都在两个方面有局限，即目标产物精确程度和合成片段的大小。在常规的PCR反应中，其产物一般在2kb以下。策略有：一是改进PCR缓冲液体系、优化PCR条件。二是采用混合酶，尤其是Taq与Pwo的混合酶可扩增40kb左右的片段。一、反向PCR(reversePCR)

是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。可对未知序列扩增后进行分析，如探索邻接已知DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长cDNA的克隆，扩增基因文库的插入DNA；建立基因组步移文库。未知序列未知序列已知序列第三节PCR扩增未知DNA片段已知序列未知序列未知序列限制酶限制酶连接酶二、利用接头的PCR/锚定PCR(anchoredPCR)

将基因组总DNA用限制酶切割，然后将序列已知的接头连接到酶切片段的两端，以提供PCR的锚定引物，该锚定引物与已知序列中的基因特异引物(gene-specificprimer,GSP)组合后，用于目标基因侧翼序列的扩增。锚定PCR技术进行染色体步行的操作流程48三、热不对称交错PCR(thermalasymmetricinterlacedPCR,TAIL-PCR)

原理：利用目标序列旁的已知序列设计3个嵌套的特异性引物(specialprime,简称sp1,sp2,sp3)，用它们分别和1个具有低Tm值的短的随机简并引物(Arbitrarydegenerateprime简称AD)相组合，以基因组DNA作为模板，通过3轮具热不对称的温度循环的分级反应来进行PCR扩增，从而获得已知序列旁的侧翼序列。

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第一轮产物第二轮产物第三轮产物第一轮模板为基因组DNA，引物SP1+AD第二轮将第一轮产物稀释1-1000倍作为模板，SP2+AD第三轮将第二轮产物稀释1-1000倍作为模板，SP3+AD已知序列(T-DNA)未知序列SP1SP2SP3AD

TAIL-PCR的操作流程：1.基因组DNA的获取2.已知序列的验证3.引物的设计：3个嵌套的特异性引物长度一般在20~30bp之间；Tm值一般设58~68℃；SP1、SP2和SP3之间最好相距100bp以上以便在电泳时更容易区分3轮PCR产物；随机引物是按照物种普遍存在蛋白质的保守氨基酸序列设计的，长度一般是14bp左右，Tm值介于30~48℃之间。

4.三次TAILPCR反应：第1次PCR反应由5次高特异性反应、1次低特异性反应、10次较低特异性反应和12次热不对称的超级循环构成。通过5次高特异性的反应，使sp1与已知的序列退火并延伸；1次低特异性的反应使简并引物结合到较多的目标序列上；

接下来10次较低特异性的反应使两种引物均能与模板退火，从而使原来由高严谨性循环所产生的单链靶DNA复制成双链DNA。最后是进行12次热不对称的TAIL循环（超级循环即2次高特异性和1次低特异性循环交替），目的片段得以指数性地扩增。53

经过第一轮的PCR反应得到了不同浓度的3种类型产物：类型1是特异引物和随机引物之间扩增的产物（即目标产物；类型2是单独由特异引物扩增的产物；类型3是单独由任意引物引发的产物。

增加目标产物浓度

特异性增加目标产物浓度

在第三阶段结束后，基本上只有类型1产物，即目的产物。5.取第一，第二，第三轮PCR产物各3ul，用1%琼脂糖凝胶进行电泳检测。6.切胶回收清晰的电泳条带，以SP3为引物对PCR产物进行测序验证。基因mRNA蛋白质多肽链第四节与反转录相关的PCR逆转录酶ＤＮＡ聚合酶mRNAcDNA杂化双链PCR扩增一、cDNA末端快速扩增(rapidamplificationofcDNAends,RACE)用于克隆全长cDNA的5’和3’末端序列。1、5’RACE原理示意图2、3’RACE原理示意图二、差异显示PCR(differentialdisplayPCR,DD-PCR)检测相似材料表达谱差异的经典方法，此后已衍生出许多新方法。

DD-PCR是在AP-PCR(任意引物PCR)基础上发明的一种RT-PCR方法，主要用于2种或多种类似生物个体在基因表达上的差异分析。基本原理：所有真核生物的成熟mRNA都含有不同长度的poly+(A)尾部序列，根据poly+(A)内部的2个核苷酸排列的不同，可以将所有的mRNA分子分为12类。

根据这12种mRNA序列可合成12种相应的反转录引物，即M’N’TTTTTTTT……，用其分别进行反转录，即可将所有mRNA分类合成12种cDNA（于12个试管内），然后再用锚定引物和随机引物，以这12种cDNA分别做模板进行PCR扩增，那么与表型相关的mRNA就很容易被发现并克隆出来。真核生物12种mRNA的序列特点DD-PCR示意图箭头所示为特异扩增产物一、多重PCR(multiplexPCR)：在一个反应体系中使用一对以上引物的PCR称为多重PCR。其结果是产生多个PCR产物，用于检测特定基因序列的存在或缺失。引物电泳第五节PCR产生的DNA指纹二、随机扩增多态性DNA(randomamplifiedpolymorphicDNA,RAPD)：在高等真核生物庞大基因组背景下，引物长度缩短到一定程度以后，单一引物就可以扩增出多个PCR产物。RAPD引物一般为10-11nt。三、扩增片段长度多态性(amplifiedfragmentpolymorphism,AFLP)：将高等真核生物基因组DNA酶切，连接接头，然后进行选择性PCR扩增。PCR与模板定量：PCR最终产物是其模板一定程度的放大，因此PCR产物的量可以间接反映初始模板的量。但正因为PCR是对初始模板的指数式扩增，如果不同样品之间在扩增中偏离指数的程度稍有不同，用PCR产物来反映初始模板丰度就会有很大的误差。通过特定设计的PCR仪器来实时检测PCR扩增过程中每一轮产物的累积数量，可以很好地推算初始模板丰度，这种工作方式叫做实时定量PCR(real-timePCR)。第六节实时荧光定量PCR一、实时荧光定量PCR的定量方式RT-qPCR仪同时进行PCR扩增和荧光检测，监测动态变化。阈值(threshold)：荧光信号由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的荧光强度值。