第十五章色谱法导论2015s

第十五章色谱法导论Chromatography

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學色谱法是一种重要的分离分析方法，它是根据组分在两相中作用能力的不同而达到分离目的。§15.1概述

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學ts1、色谱法的由来：1903年：茨维特（俄）分离植物色素；植物叶子萃取物充有碳酸钙的玻璃管加入石油醚色素中各组分互相分离形成各种不同颜色的谱带。一、色谱法简介

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學Tsweet的实验

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學2、基本术语：固定相：填入玻璃管或不锈钢管内静止不动的一相（固体或液体）。流动相：自上而下运动的一相（一般是气体、液体或超临界流体）。色谱柱：装有固定相的管子（玻璃管或不锈钢管）。

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學3、色谱分离原理利用不同物质在流动相和固定相中具有不同的分配系数，当流动相中样品混合物经过固定相时，就会与固定相发生相互作用，这些组分在两相间进行反复多次分配，原来微小的分配差异产生了很明显的分离效果，不同组分在固定相中滞留时间长短不同，从而依先后顺序流出色谱柱。

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學二、色谱法的分类：1、按两相物理状态分类按流动相分按固定相分气相色谱（GC）液相色谱（LC）超临界流体色谱（SFC）气固色谱（GSC）气液色谱（GLC）液固色谱（LSC）液液色谱（LLC）

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學2、按固定相的形式分类按固定相在支持体中的形状分柱色谱平板色谱纸色谱薄层色谱毛细管柱色谱法填充柱色谱法

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學3、按分离过程的化学原理分类吸附色谱法：利用组分在吸附剂（固定相）上的吸附能力强弱不同而得以分离的方法。分配色谱法：利用组分在固定液（固定相）中溶解度不同而达到分离的方法。离子交换色谱法：利用组分在离子交换剂（固定相）上的亲和力大小不同而达到分离的方法。凝胶色谱法亲和色谱法

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學三、色谱法的特点1.分离效率高2.灵敏度高3.分析速度快4.应用范围广5.被分离组分的定性较为困难

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學§15.2色谱基本概念一、色谱分离过程混合物样品（A+B）→色谱柱中分离→检测器→记录下来。组分从色谱柱流出时，各个组分在检测器上所产生的信号随时间变化，所形成的曲线叫色谱图。记录了各个组分流出色谱柱的情况，又叫色谱流出曲线

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學二、色谱常用术语

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學1、色谱流出曲线和色谱峰：由检测器输出的电信号强度对时间作图，所得曲线称为色谱流出曲线。曲线上突起部分就是色谱峰。如果进样量很小，浓度很低，在吸附等温线（气固吸附色谱）或分配等温线（气液分配色谱）的线性范围内，则色谱峰是对称的。

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學2、基线—在实验操作条件下，色谱柱中只有流动相通过（没有组分流出时）的曲线叫基线。稳定情况下：一条水平直线。基线上下波动称为噪音。

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學3、色谱峰的高度h峰高h—色谱峰最高点与基线之间的距离，可用mm，mV，mA表示。峰的高低与组分浓度有关，峰越高越窄越好。h

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學σ4.色谱峰的宽度标准偏差σ——峰高0.607倍处的色谱峰宽的一半。

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學峰底宽Wb——色谱峰两侧拐点所作切线在基线上的距离Wb=4σ

半峰宽W1/2——峰高一半处色谱峰的宽度

W1/2

=2.354σW1/2

=0.589Wb

Wb

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學5.色谱峰面积A——色谱峰与峰底所围的面积。对于对称的色谱峰A=1.065hW1/2

对于非对称的色谱峰

A=1.065h(W0.15+W0.85)/2

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學6.色谱保留值——定性的依据t0（1）死时间t0——不被固定相吸附或溶解的组分流经色谱柱所需的时间。从进样开始到柱后出现峰最大值所需的时间。气相色谱—惰性气体（空气、甲烷等）流出色谱柱所需的时间。

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學(2)保留时间tR———组分流经色谱柱时所需时间。进样开始到柱后出现最大值时所需的时间。操作条件不变时，一种组分对应有一个tR定值。

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學（3）调整保留时间t’R扣除了死时间的保留时间。t’R=tR-t0t’R体现的是组分在柱中被吸附或溶解的实际时间。t’R

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學保留值用体积表示：（4）死体积V0—不被固定相滞留的组分流经色谱柱所消耗的流动相体积称死体积，色谱柱中载气所占的体积。

V0=t0F0F0为柱后出口处流动相的体积流速mL/min

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學（5）保留体积VR

—组分从进样开始到色谱柱后出现最大值时所需流动相体积，组分通过色谱柱时所需流动相体积。VR=tRF0（6）调整保留体积V’R—扣除了死体积的保留体积，真实的将待测组分从固定相中携带出柱子所需的流动相体积。V’R=t’RF0V0、t0与被测组分无关，因而V’R、t’R更合理地反映了物质在柱中的保留情况。

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學（7）相对保留值γ2，1或γi,s—在相同操作条件下，组分2或组分i对另一参比组分1或s调整保留值之比

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學（8）保留指数：是一种重现性较好的定性参数规定正构烷烃保留指数为分子中碳原子个数乘以100，如正己烷、正庚烷的保留指数分别为600和700。被测物质的保留指数Ix可采用两个相邻正构烷烃的保留指数进行测定将碳数为n和n+1的正构烷烃加到被测物质x中进行色谱分析，测得它们的保留值

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學保留指数计算方法n）tR(n+1)

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學由色谱流出曲线，可以看出：(i)根据色谱峰的个数，可以判断样品中所含组分的最少个数；(ii)根据色谱峰的保留值，可以进行定性分析；(iii)根据色谱峰的面积或峰高，可以进行定量分析；(iv)色谱峰的保留值及其区域宽度，是评价色谱柱分离效能的依据；(v)色谱峰两峰间的距离，是评价固定相（或流动相）选择是否合适的依据。

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學7、分配系数K在一定温度和压力下，组分在固定相和流动相间达到分配平衡时的浓度比值，用K表示。8、分配比k

在一定温度和压力下，组分在固定相和流动相之间分配达到平衡时的质量比，称为分配比，也称容量因子，用k表示。

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學分配系数和分配比之间的关系

分配系数K：与柱中固定相和流动相的体积无关，而取决于组分及两相的性质，并随柱温、柱压变化而变化。分配比k：决定于组分及固定相的热力学性质，随柱温、柱压的变化而变化，还与流动相及固定相的体积有关。

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學理论上可以推导出：β称为相比

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學9、保留值与分配系数、分配比之间的关系根据物料平衡原理，可推导出保留体积与热力学平衡常数K之间的关系：

色谱基本保留方程

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學两个组分怎样才算达到完全分离？首先

两组分的色谱峰之间的距离必须相差足够大其次

峰必须窄下图是A、B两组分沿色谱柱移动时，不同位置处的浓度轮廓。溶质A和B在沿柱移动时不同位置处的浓度轮廓浓度沿柱移动距离LAABB§15.3色谱理论基础

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學一、塔板理论——平衡理论

在50年代，色谱技术发展的初期，Martin等人把色谱分离过程比作分馏过程，并把分馏中的半经验理论－塔板理论用于色谱分析法。

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學把色谱柱比作一个精馏塔，将连续的色谱分离过程分割成多次的平衡过程的重复，同时引入理论塔板数作为衡量柱效率的指标。对一个色谱柱来说，若色谱柱长度L固定，每一块塔板的高度用H表示，称为塔板高度。

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學塔板理论假设：1.色谱往内径和校内填科填充均匀，在柱内一小段高度内组分分配瞬间达平衡（H→理论塔板高度）。2．载气非连续而是间歇式（脉动式）进入色谱柱，每次进气一个塔板体积。3．样品和载气均加在第0号塔板上，且纵向分子扩散可以忽略（沿柱方向的纵向扩散）4．分配系数在各塔板上是常数

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學1.理论板数和理论塔板高度的计算色谱柱长：L理论塔板高度H

：使组分在柱内两相间达到一次分配平衡所需要的柱长理论塔板数n

：组分流过色谱柱时，在两相间进行平衡分配的总次数，则三者的关系为：n=L/H理论塔板数与色谱参数之间的关系为：单位柱长的塔板数越多，表明柱效越高。用不同物质计算可得到不同的理论塔板数。

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學2.有效塔板数和有效塔板高度保留时间包含死时间，在死时间内不参与分配，即：组分在tM时间内不参与柱内分配。需引入有效塔板数和有效塔板高度：n有效与H有效扣除了死时间，更能真实地反应柱效

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學3、塔板理论的优缺点成功之处：解释了色谱流出曲线的形状，并提出了计算和评价柱效能高低的参数（n，H）。局限性：塔板理论只能定性的给出理论塔板数和塔板高度的概念，却不能解释板高受哪些因素影响；也不能说明为什么在不同的流速下，可以测得不同的理论塔板数，因而限制了它的应用。

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學二、速率理论:色谱过程动力学理论吸收了塔板理论中板高的概念，并充分考虑了组分在两相间的扩散和传质过程，从而在动力学基础上较好地解释了影响板高的各种因素。该理论模型对GC、LC都适用。㈠速率理论方程式：H=A+B/u+Cu式中u为流动相的线速度；A、B、C为常数，分别代表涡流扩散系数、分子扩散项系数及传质阻力项系数。

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學1.涡流扩散项A

A=2λdp

（1）影响因素：①λ：填充物的不规则程度。λ↓，A↓。②dP：填充物的平均颗粒直径。dP

↓，A↓。（2）减小A的方法：①填充色谱柱时要均匀、紧密；②使用适当细度、颗粒均匀的填充物。

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學2.分子扩散项B/u以GC为例：

B/u=2γDg/u（1）影响因素：①γ：弯曲因子，填充物对分子扩散的障碍因素，γ↓，B↓，(B/u)↓。②Dg：组分在流动相中的扩散系数。Dg↓，B↓，(B/u)↓。影响Dg的因素：与载气分子量的平方根成反比；随T柱↓而↓，随P柱↑而↓。

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學③流动相的流速：u↑，(B/u)↓。（2）减小(B/u)的方法：①选用合适分子量的载气；②增大流动相的流速；③选择合适的柱温、柱压。3、传质阻力项(Cu)：以GLC为例：Cu=(Cg+C1)u（1）气相传质阻力Cg：试样从气相到达气液两相界面上受到的阻力。

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學①dP：dP

↓，Cg↓。②Dg：Dg↑，Cg↓。（M载↓，柱温↑，柱压↓。）

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學2、液相传质阻力系数

C1：试样从气液两相界面到达液相内部过程中受到的阻力。

①液膜厚度df：df↓，Cl↓。②Dl：组分在液相中的扩散系数。Dl↑，

Cl

↓。3、流动相的流速：u↓，(Cu)↓。

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學4、消除传质阻力项的方法：（1）采用粒度小的均匀填充物；（2）采用合适分子量的气体作载气；（3）降低固定相的液膜厚度；（4）增大组分在液相中的扩散系数；（5）选择合适的柱温柱压；（6）选择合适流速的载气。

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學㈡速率理论方程式的具体形式及其讨论：1、表达式：对于GLC：2、提高柱效能的方法（或降低板高的方法、增大理论塔板数的方法，影响色谱峰变宽的因素）（自己总结）

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學3、载气线速度对H的影响：（1）影响：矛盾u↑，(B/u)↓，(Cu)↑u↓，(B/u)↑，(Cu)↓必须找到Hmin对应的uopt。（2）Hmin和uopt：uHuopt

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學uHuopt

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學（3）讨论：较低线速时，分子扩散项起主要作用；较高线速时，传质阻力项起主要作用；u较小时，选用M较大的载气，较低的柱温和较高的柱压；u较大时，选用M较小的载气，较高的柱温和较低的柱压。

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學速率理论为色谱分离和操作条件选择提供了理论指导。阐明了流速和柱温对柱效及分离的影响。各种因素相互制约：增大载气线速度，会使分子扩散项的影响减小，柱效能随之增加，但同时传质阻力项的影响会增大，柱效下降；柱温升高，有利于传质，但又加剧了分子扩散的影响，只有选择最佳条件，才能使柱效达到最高。

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學三、色谱基本分离方程（一）分离度Ｒ——色谱柱的总分离效能指标

定义：相邻两个峰的保留值之差与两峰宽度平均值之比式中：分子反映了溶质在两相中分配行为对分离的影响，是色谱分离的热力学因素。分母反映了动态过程溶质区带的扩宽对分离的影响，是色谱分离的动力学因素。结论：两溶质保留时间相差越大，色谱峰越窄，分离越好。

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两个峰tR

相差越大，W越窄，Ｒ值越大，说明柱分离较能高。Ｒ＜１.0两峰有部分重叠。Ｒ＝１.0两组分能分开，分离程度达98%。Ｒ≥１.5两个组分能完全分开（＞99.7%）

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學（二）色谱基本分离方程式 设两相邻峰的峰宽相等，即w1=w2，则

又

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學称为柱效项；称为柱选择项；相对保留因子

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學与柱效的关系（柱效因子）R∝n1/2增加柱长减小塔板高度限制：L过长，保留时间延长，分析时间延长，色谱峰扩展。使用性能优良的色谱柱，并选择最佳分离条件

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學例1在一根1m长的填充柱上，空气的保留时间为5s，苯和环己烷的保留时间分别为45s和49s，环己烷色谱峰的Wb为5s。欲得到R=1.2的分离度，则有效理论塔板数应为多少？需要的柱长应为多少？

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學例2：

在一根3m长的色谱柱上，分析某试样时，得到物质A和B的调整保留时间分别为13和16min，后者的峰底宽为1min，计算：(1)该色谱柱的有效理论塔板数；

(2)A、B两组分的相对保留值；

(3)达到完全分离时需要的有效理论塔板数为多少？此时应使用多长的色谱柱？

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學§15.4色谱定性定量分析一、试样的预处理化学衍生化通过合适的化学反应，改变组分的色谱分离性质，以及利用生成特殊衍生物改进组分的分离或增强检测器响应的方法。裂解色谱技术将一些难挥发的固体试样在裂解器中裂解成低分子碎片后，再进行色谱分析的技术。分离与富集分离一些不适合气相色谱直接分析的组分；对低含量组分进行预富集，以满足检测器灵敏度的要求。还有蒸馏、萃取、吸附和冷冻等方法。

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學二、定性分析定性分析的任务是确定色谱图上各个峰代表什么物质。

1.利用保留值与已知物对照定性（1）利用保留时间定性在相同色谱条件下，将标准物和样品分别进样，两者保留值相同，可能为同一物质。此方法要求操作条件稳定、一致，必须严格控制操作条件，尤其是流速。

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學

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學（2）利用峰高增量定性

若样品复杂，流出峰距离太近，或操作条件不易控制，可将已知物加到样品中，混合进样，若被测组分峰高增加了，则可能含该已知物。（3）利用双色谱系统定性通过改变色谱条件来改变分离选择性，使不同物质显示不同保留值。例：选用极性差别较大的两种不同固定液来制备色谱柱，不同物质具有不同保留值

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學2.根据文献保留值数据定性（1）用相对保留值：r

i,s

用组分i对标准物s的相对保留值作为定性指标。只与两组分的分配系数有关，不受操作条件的影响siis''RRttr=可选苯、正已烷、环已烷作标准物，手册上列出许多r

i,s样品、标准物——色谱柱，求得r

i,s，与手册上对比。只要固定相性质与柱温确定，r

i,s

是个定值

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學（2）保留指数定性法：是一种重现性较好的定性参数规定正构烷烃保留指数为分子中碳原子个数乘以100，如正己烷、正庚烷的保留指数分别为600和700。被测物质的保留指数Ix可采用两个相邻正构烷烃的保留指数进行测定将碳数为n和n+1的正构烷烃加到被测物质x中进行色谱分析，测得它们的保留值

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學保留指数计算方法利用上式求出未知物的保留指数与文献值对照n）tR(n+1)

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學3、利用选择性检测器定性利用检测器定性，只能确定是哪一类化合物：如若在火焰光度检测器上有响应，则组分为有机化合物；若在电子俘获检测器上有响应，则组分中含卤素、氧、氟等电负性强的原子或基团；若在硫磷检测器上有响应，则组分中含硫或磷。4、利用与其他仪器联用定性目前联用最成功的是色谱-质谱联用仪、色谱-傅里叶红外光谱联用仪。

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學三、定量分析

气相色谱定量分析是根据检测器对溶质产生的响应信号与溶质的量成正比的原理，通过色谱图上的峰面积或峰高，计算样品中溶质的含量。mi=fi

Aimi=fihi

mi—被测组分i的质量，fi—比例系数Ai、hi—被测组分的峰面积及峰高

对称峰：A=1.06×h×W1/2

不对称峰：A=h(W0.15＋W0.85)/21、峰面积测量

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學2、定量校正因子

色谱定量分析是基于组分的量与峰面积成正比关系。由于同一检测器对不同物质具有不同的响应值，即不同物质检测器的灵敏度不同，相同的峰面积并不意味着有相等的量。(1)绝对校正因子fi

：单位峰面积对应组分的质量。fi=mi/Ai

绝对校正因子受操作条件影响较大，要严格控制色谱条件，不易准确测定，没有统一标准，无法直接引用，定量分析中采用相对较正因子。

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學⑵相对校正因子

用一个标准，把所有组分的A较正到标准物的A上，在同一标准上进行比较计算，如热导池检测器常用苯作标准。相对定量校正因子fi′定义：样品中各组分的定量校正因子与标准物的定量校正因子之比。校正因子有质量校正因子、摩尔校正因子、体积校正因子三种表示方法，最常见的为质