第7章蛋白质的分离、纯化和表征

Protein第7章

蛋白质的分离纯化和表征

蛋白质含有酸/碱AA残基具有两性碱/酸越大——pI越大pI通常在6.0左右一、蛋白质的两性电离及等电点蛋白质的等电点：当溶液在某一定pH值时，使某特定蛋白质分子上所带正负电荷相等，成为两性离子，在电场中即不向阳极移动也不向阴极移动，此时溶液的pH值即为该蛋白质的等电点（pI）。在等电点时，蛋白质的溶解度最小，在电场中不移动。

蛋白质电泳：在外液pH低于等电点的溶液中，蛋白质粒子带正电荷，在电场中向负极移动；在外液pH高于等电点的溶液中，蛋白质粒子带负电荷，在电场中向正极移动。这种现象称为蛋白质电泳—带电粒子在电场中移动的现象。蛋白质在等电点pH条件下，不发生电泳现象利用蛋白质的电泳现象，可以将不同带电性质和不同大小、形状的蛋白质分子进行分离纯化。根据蛋白质净电荷的差异来分离蛋白质的一种方法是电泳法。电泳

蛋白质的分子量一般在一万至一百万道尔顿之间

1道尔顿＝1×C12绝对质量/12≈1.66×10-27千克二、蛋白质分子的大小（一）根据化学组成测定最小分子量1、测定蛋白质中某一微量元素的含量2、假设蛋白质中仅含一个铁原子最低相对分子质量=100*55.8/铁的百分含量（二）SDS－PAGE测定相对分子质量蛋白质颗粒电泳时迁移率取决于：所带电荷分子量分子形状十二烷基磺酸钠原态蛋白质变性？磺酸基极性亲水烷基亲油（蛋白质疏水区）迁移率与电荷和形状无关，仅取决于相对分子质量巯基乙醇破坏二硫键（三）凝胶过滤法测定相对分子质量蛋白质混合样凝凝胶法只适于球状蛋白分子测量三、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀（一）胶体性质（colloidalsystem）由于蛋白质分子量很大，在水溶液中形成直径1-100nm之间的颗粒，已达到胶体颗粒范围的大小，因而具有胶体溶液的通性。蛋白质的水溶液能形成稳定的亲水胶体的原因：１、蛋白质多肽链上含有许多极性基团。如：－NH3＋、－COO－、－OH、-SH、-CONH-等，它们都具有高度的亲水性，当与水接确时，极易吸附水分子，使蛋白质颗粒外围形成一层水化膜，将颗粒彼此隔开，不致因互相碰撞凝聚而沉淀。2、蛋白质是两性电解质，在非等电状态时，相同蛋白质颗粒带有同性电荷，与周围的反离子构成稳定的双电层。使蛋白质颗粒之间相互排斥，保持一定距离，不致互相凝聚而沉淀。蛋白质溶液由于具有水化层与双电层两方面的稳定因素，所以作为胶体系统是相对稳定的。蛋白质胶体性质的应用由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜，因此可以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去。透析法：以半透膜提纯蛋白质的方法叫透析法半透膜：只允许溶剂小分子通过，而溶质大分子不能通过，如羊皮纸、火棉胶、玻璃纸等二.蛋白质的沉淀

蛋白质在溶液中的稳定性是有条件的、相对的。如果加入适当的试剂使蛋白质分子处于等电点状态或失去水化层（消除相同电荷，除去水膜），蛋白质胶体溶液就不再稳定并将产生沉淀。蛋白质沉淀定义：蛋白质在溶液中靠水膜和电荷保持其稳定性，水膜和电荷一旦除去，蛋白质溶液的稳定性就被破坏，蛋白质就会从溶液中沉淀下来，此现象即为蛋白质的沉淀作用。（一）可逆沉淀定义：在温和条件下，通过改变溶液的pH或电荷状况，使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离。在沉淀过程中，结构和性质都没有发生变化，在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液，所以这种沉淀又称为非变性沉淀。可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法，如等电点沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等。1.

盐析

在蛋白质的水溶液中，加入大量高浓度的强电解质盐如硫酸铵、氯化钠、硫酸钠等，可破坏蛋质分子表面的水化层，中和它们的电荷，因而使蛋白质沉淀析出，这种现象称为盐析。

而低浓度的盐溶液加入蛋白质溶液中，会导致蛋白质的溶解度增加，该现象称为盐溶。盐析的机理：

破坏蛋白质的水化膜，中和表面的净电荷。盐析法是最常用的蛋白质沉淀方法，该方法不会使蛋白质产生变性。

各种蛋白质的亲水性及荷电性均有差别，因此不同蛋白质所需中性盐浓度也有不同，只要调节中性盐浓度，就可使混合蛋白质溶液中的几种蛋白质分散沉淀析出，这种方法称为分段盐析。2.弱酸或弱碱沉淀法(等电点沉淀）

用弱酸或弱碱调节蛋白质溶液的pH处于等电点处，使蛋白质沉淀。弱酸或弱碱沉淀法机理：

破坏蛋白质表面净电荷。酸酸碱碱碱酸溶液中蛋白质的聚沉3.

有机溶剂沉淀法：

在蛋白质溶液中，加入能与水互溶的有机溶剂如乙醇、丙酮等，蛋白质产生沉淀。有机溶剂沉淀法的机理：

破坏蛋白质的水化膜。注意：有机溶液沉淀蛋白质通常在低温条件下进行，否则有机溶剂与水互溶产生的溶解热会使蛋白质产生变性。（二）不可逆沉淀定义：在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水。由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变化，所以又称为变性沉淀。如加热沉淀（次级键）、强酸碱沉淀（影响电荷）、重金属盐沉淀（Hg2+、Pb2+

、Cu2+、Ag2+）和生物碱试剂或某些酸类沉淀等都属于不可逆沉淀。4.重金属盐沉淀(条件：pH稍大于pI为宜)

当pH稍大于pI时，蛋白质颗粒带负电荷这样就容易与重金属离子结合成不溶性盐而沉淀。重金属沉淀法的机理：重金属盐加入之后，与带负电的羧基结合。误服重金属盐的病人可口服大量牛乳或豆浆等蛋白质进行解救。

5.生物碱试剂沉淀法（条件：pH稍小于pI）

生物碱是植物组织中具有显著生理作用的一类含氮的碱性物质。（小檗碱、麻黄碱、吗啡）能够沉淀生物碱的试剂称为生物碱试剂。生物碱试剂一般为弱酸性物质，如单宁酸、苦味酸、三氯乙酸等。

生物碱试剂沉淀蛋白质的机理：

在酸性条件下，蛋白质带正电，可以与生物碱试剂的酸根离子结合而产生沉淀。例如：“柿石症”

吃柿子小心胃结石！年龄偏大的人，消化功能减退，多食易得柿石病。空腹也不要多吃柿子。如果连皮一起吃更容易形成胃结石，皮中含的鞣酸更多。含高蛋白的蟹、鱼、虾在鞣酸的作用下，很易凝固成块，形成胃结石。6.加热变性沉淀法

几乎所有的蛋白质都因加热变性而凝固。少量盐促进蛋白质加热凝固。

当蛋白质处于等电点时，加热凝固最完全和最迅速.

如：煮鸡蛋卤水点豆腐（少量MgCl2加入到大豆蛋白质的浓热溶液中）四、蛋白质分离纯化的一般原则总目标：增加制品纯度或比活1.前处理：因动/植物/细菌而异2.粗分级分离：采用盐析/等电点沉淀/有机溶剂分级分离等方法3.细分级分离：采用凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析以及亲和层析等4.结晶五、蛋白质的分离纯化方法(一)根据分子大小不同的纯化方法

1、透析和超过滤利用蛋白质分子不能透过半透膜将其与小分子物质分开半透膜为玻璃纸或纤维素材料血液透析小分子溶出小分子被带出透析机透析液加压血液2、密度梯度（区带）离心60000~80000转/分重力60万～80万倍3、凝胶过滤（二）利用溶解度差别的纯化方法1.等电点沉淀调整溶液pH

不同蛋白在各自pI处依次沉淀

2.盐溶和盐析3.有机溶剂分级分离法降低介电常数争夺水化膜（三)根据电荷不同的分离