RGQ安装时应用培训

TheRotor-GeneQ应用培训5种型号，满足不同的需要Rotor-GeneQ2Plex Rotor-GeneQ2PlexHRM Rotor-GeneQ5Plex Rotor-GeneQ5PlexHRM Rotor-GeneQ6Plex

产品概况工作过程旋转模式

仪器运行时转盘速度

400RPM(加热和冷却)

高速数据收集

样品旋转一次，数据收集一次

(0.15sec)

重力作用让试剂都在管底

除去气泡和浓缩

组分不会形成沉淀持续运动保证无差异

孔与孔间的温度和光学400

RPM>10

G离心式鼓风机混匀腔体内的空气腔体门关上，密封腔体内的空气转盘上的孔能让空气自由通过升温加热开空气进离心式鼓风机把空气吸入腔体内腔体门打开，排出热空气加热关转盘上的孔能让空气自由通过降温

离心式鼓风机混匀腔体内的空气光学通路光学通路激发光发射光PCR转子和PCR管类型136孔转子-适用

0.2ml平盖PCR管推荐反应体积20–50µL72孔转子

-适用0.1mlPCR连管推荐反应体积10–50µL

#981005；#981008#981103；#981106转盘72

-72个样品Rotor-Disc72，管容积50µL推荐反应体积20–25µL

需要密封膜和加热器转盘100

-100个样品Rotor-Disc100，管容积30

µL推荐反应体积15–25µL需要密封膜和加热器加热器，#9019725Rotor-Disc72，#

981301Rotor-Disc100，#

981311密封膜，#981601PCR转子和PCR管类型2加热器用来密封

Rotor-Disc密封后不能取下工作流程预热取下膜中间的封纸把膜放在

Rotor-Disc正上方放进入加热器中，拉下压杆等警报音响，从加热器中取出注意–至少放置10秒冷却把膜多余的部分撕走小心地从加热板上取下Rotor-Disck开始……点击此图标运行设置运行设置

-QuickStart模式选择模板运行设置

-QuickStart模式选择转子运行设置

-QuickStart模式确定步骤之——Hold运行设置

-QuickStart模式确定步骤之——Cycling运行设置

-QuickStart模式确定步骤之——Cycling关于Acquiring运行设置

-QuickStart模式确定步骤之——Cycling关于Acquiring运行设置

-QuickStart模式确定步骤之——Melt选做运行设置

-

Advanced

模式选择模板运行设置

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Advanced

模式选择转子运行设置

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Advanced

模式输入信息运行设置

-

Advanced

模式步骤和检测设置运行设置

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Advanced

模式步骤和检测设置之确定步骤与QuickStart模式的确定步骤同运行设置

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Advanced

模式步骤和检测设置之GainOptimisation运行设置

-

Advanced

模式步骤和检测设置之GainOptimisation运行设置

-

Advanced

模式Channel–

设置需要的数据收集通道，如果设置了多个通道，确定后有后续的相应通道的对话框弹出。TubePosition–

保证所选的位置是能够反应并发荧光的(一般是标准品)。TargetSampleRange–

与所用的检测化合物有关：

嵌入式染料(Intercalatingdyes

)应设置为1-3Fl单位；

探针染料(Probes)一般应设置为

5-10Fl单位； QuenchedFRET

检测应设置为70-80Fl

单位，因为随着反应进行其荧光值将降低

。AcceptableGainRange–

应为默认的

-10to+10步骤和检测设置之GainOptimisation运行设置

-

Advanced

模式步骤和检测设置之GainOptimisation运行设置

-

Advanced

模式设置完成关于Longrange:在到达设置的循环数后，每一循环该步骤（一般设置变性阶段）都增加1秒。关于Touchdown:在到达设置的循环数后，每一循环的该步骤（一般设置退火阶段）都降低1℃。Melt:从一个较低温度升到一个较高温度，溶剂的特性，与核酸的特有属性。HRM:HighResolutionMelt，高分辨率的熔解曲线，只有在装了HRM硬件的仪器上才能运用。运行设置

-

额外设置1关于OpticalDenaturationCycling:用荧光强度来判断变性是否完成运行设置

-

额外设置2运行设置补充说明-

DataAcquisition设置运行程序时要设置数据采集点数据采集点可以在任何的一个步骤的终结时，并以蓝色的点作标记。可以通过点击“Acquiring”作数据收集的设置。从列表中选择需要的数据收集通道，可以选择多通道。点击“DyeChart”可观测数据收集通道的信息，包括激发光和发射光波长，可以应用的染料或显色剂。在程序的任何或所有步骤都能设数据收集点。当数据曲线饱和，会在纵坐标100处形成横线。设置和调整Gain值1设置Gain值，让所有收集到的数据都在检测器(PMT)能检测的范围内

如果Gain值：

过低

→信号会因埋没在在本底噪声内而漏掉；

过高→信号会超出范围(饱和).

如果熔解曲线中，开始的一段时间纵坐标100处形成横线，熔解曲线应用较低的Gain设置来收集数据，但无需再重复做扩增反应。实际数据的不会因Gain值设置而改变，Gain值设置改变了也能反映实际的数据变化趋势。每个数据采集通道的Gain值范围是

-10~10：-10为最低的敏感度；+10最高敏感度。

0481026-2-4-6-8-1024816326412825651210242048Gain值设置每增加1，对PMT的输入电压约能增加2倍，这样对荧光检测的敏感度能增加2倍。Gain值的设置不可能每次都适用，最好能在hold阶段根据实验的奔底而做出改变。使用Auto-Gain设置能自动检测反应初始时的荧光强度，设定出合适的Gain值。当使用Auto-Gain设置时，在运行初始会出现该界面。设置和调整Gain值2编辑样品1.命名样品2.选择样品的“Type”：UnknownNoneNTCStandardPositivecontrolNegativecontrolCalibrator4.Groups–用作统计分析5.GivenConc.只有type是”Standard”时可编辑，用于制作标准曲线。3.是否选择–

Selected6.Color用于颜色区分图表中不同的样品。综述:AbsoluteQuantificationofmRNAusingrealtimereversetranscriptionpolymerasechainreactionassaysSABustinJ.Mol.Endo200025,169-193标准曲线通过已知浓度的cDNA/RNA建立关键因素: -DNA/RNA片段要纯，单一片段 -移液准确 -标准样品稀释准确，平行性好

绝对定量绝对定量标准曲线由5个或以上已知浓度样品而确定。一般每个浓度的样品做3个重复。如果每个梯度相差10倍，最理想的状态是，PCR的效率足够高到达2，预期Ct值能相差3.162。3.162是10的平方根。未知浓度的目标样品，其浓度和荧光值的变化规律与标准曲线一致。5,00050,000500,0005,000,00050,000,000500,000,000CTamount1.曲线上的Ct与浓度的log关系2.标准曲线

3.根据标准曲线计算反应效率反应效率与斜率(m)相关E=10(-1/m)–1E=1=100%.4.判定系数(R2)表示假设值与真实值的相关性，

越接近1相关性越好。绝对定量与反应效率

绝对定量绝对定量AbsoluteQuantitation绝对定量绝对定量的准确性完全决定于标准样品的准确性绝对定量参考文献:AbsoluteQuantificationofmRNAusingrealtimereversetranscriptionpolymerasechainreactionassaysSABustinJ.Mol.Endo200025,169-193标准曲线由已知浓度的cDNA/RNA构建关键因素: -DNA/RNA一定是纯的，只有一种片段的 -移液准确 -稀释准确平行性好

-未知浓度的样品的点能落在标准曲线上绝对定量相对定量Analysis>Quantitation>CyclingAGreen>Show>OK>Threshold>手动调阈值，得出Ct值熔解的特性是不同核酸的固有特性一般是用嵌入式染料分析PCR产物，加热熔解——从双链到单链不同的片段（如碱基序列不同，GC含量不同）有不同的熔解特性HRM十分敏感，能够区分一个碱基改变而引起的差别

(e.g.SNPs)HRM比较熔解曲线的型状和温度来区分不同样品的特性HRM原理双链产物单链产物HRM试剂嵌入式染料的荧光随着双链的解开而降低，其荧光强度与解链的特性相关高精度的温度控制和光学数据收集，能得到十分详细和分辨率高的数据。HRM工作流程扩增设置正常的PCR步骤和HRM步骤，用嵌入式染料

(e.gSYTO9)每个基因型都应设置Control(eg.已确定的wild-type,heterozygote,variant样品)

检测扩增曲线和扩增效率 (扩增不好，HRM的结果也不好)HRM分析运行HRM分析指定controls观测结果HRM运行设置HRM分析HRM分析仪器的维护保养1.光学检测镜头定期清洁，棉签蘸酒精擦拭光学检测镜头。2.保持实验台清洁防止杂物进入，保证降温效果，应保持仪器附近区域的清洁，特别是仪器底部纸屑、毛发等杂物。3.常保持仪器盖关闭4.腔体污染后的清洁先用物屑纸巾蘸0.1%的次氯酸钠溶液擦拭腔体，然后用PCR级的水清洁干净。问题解决OnlineHelp文件：Help>Contents(或在NewRun对话框