高分子物理何曼君第二章4

五、分子量分布的测定

－凝胶色谱法

GelPermeationChromatography1.基本原理2.分子量标定曲线3.普适曲线4.凝胶色谱的注意事项要求：重点掌握凝胶色谱基本原理与数据处理凝胶色谱的发展简史

凝胶色谱是十几年前才发展起来的一种新型液体色谱，是色谱中最新的分离技术之一．它的分离基础主要根据溶液中分子体积(流体力学体积)的大小．用多孔性物质来按分子体积大小进行分离，在五十年前就已有报道．McBain用人造沸石成功地分离气体分子和低分子量的有机化合物．1953年wheaton和BauMan用离子交换树脂按分于量大小分离了苷、多元醇和其它非离子物质．1959年Porath和Flodin用交联的缩聚葡糖制成凝胶来分离水溶液中不同分子量的试样．这类凝胶立即以商品名称“Sephadex”出售，在生物化学领域内得到非常广泛的应用，这是凝胶色谱技术在水溶性试样的分离中首次取得推广应用，成为生物化学中一项常用的分离手段．在生物化学领域内，这种分离技术被命名为凝胶过滤．有机溶剂体系的凝胶色谱首先需要解决适用于有机溶剂的凝胶的制备问题．凝胶的制备花了几年功夫才获得成．1964年，Moore以苯乙烯和二乙烯苯在不同的稀释剂存在下制成一系列孔径不同的凝胶，这些凝胶可以在有机溶剂中分离分子量从几千到几百万的试样．翌年，Maly以示差折光仪为浓度检测器、以体积指示器为分子量检测器制成凝胶色谱仪，这些凝波和仪器立即被制成商品出售．这样，凝胶色谱技术很快就在高分子科学领域内被广泛应用，作为一种快速的分子量和分子量分布测定方法，取得很好结果，并被誉为近年来这方面一项技术上的重要突破．

优点：①快速（测定周期短）②操作简便③数据可靠、重复性好，比以往的分级快十几倍到几十倍它已成为高化、生化、有机化学领域的一个重要的分离和分析手段由于历史原因，凝胶色谱的理论发展、实验技术和应用开发主要在生物化学和高分子化学领域内．对这项新技术，不同的工作者采用了不同的命名，这就造成了文献中命名方面的混乱．文献中用过的名称有：凝胶过滤(gelfiltration)，分子筛过滤(molecularsievefiltration)，分子筛色谱(molecularsievechromatography)，排除色谱(exclusionchromatography)，分子排除色谱(molecularexclusionchromatography)，凝胶排除色谱(gelexclusionchromatography)．有限扩散色谱(restricteddiffusionchromatography)，凝胶扩散色谱(geldiffusionchromatography)．体积色谱(stericchromatography)，凝胶渗透色谱(gelpermeationchromatography)，液体排除色谱(Liquidexclusionchromatography)，凝胶色谱(gelchromatography)和体积排除色谱(sizeexclusionchromatography)．一般来说，在生物化学界中常用的名称是凝胶过滤，在高分子化学界中常用的名称是凝胶渗透色谱(简称GPC)．众说不一，主要是体积排除法体积排除法：限制扩散机理流动分离机理1.基本原理基本原理①分离的核心部件是一根装有高孔性载体的色谱柱，柱中充满溶剂。②高孔性载体表面和内部有着各种大小不同的空洞和通道色谱柱示意图

（内含载体与溶剂）多孔性载体（填料）载体颗粒形貌图，尺寸在5um-50um左右颗粒表面形态结构图孔尺寸在几-几十纳米V0：粒间体积Vi：孔内体积柱内全部空间体积：V0+Vi全部由溶剂充满。③高分子试样位于柱顶，利用溶剂进行恒速淋洗:溶质随溶剂带动向下运动。最后流经整个色谱柱被淋洗出来。柱后收集的带溶质的溶液称为淋洗液从淋洗开始到溶质分子被带出所收集的淋洗液体积称为该溶质分子的淋出体积Ve

:Ve当试样随溶剂进入柱中后（1）比载体的最大的孔还要大的分子只能随溶剂流经载体颗粒之间，走的路径最短，最先淋洗出。大尺寸分子的淋出体积为V0（被排除体积）Ve（2）尺寸小于所有空洞的小分子除了走颗粒间、还要进入颗粒内的孔，走的路径最多，所以最后被溶剂冲洗出来，淋出体积为V0＋Vi溶剂的淋出体积Ve是V0＋Vi（3）尺寸居中的分子除了走颗粒间的路径，还可以进入部分孔洞，流经路径在大尺寸分子与小尺寸分子之间，在两者之间被淋洗出来淋出体积：

K：分配系数，溶质分子能够进入的孔体积与Vi之比。不同尺寸的分子，进入孔洞的能力不同，K值不同。④总之，体积大小不同进入孔洞的能力不同，流经路径长短不同，淋洗出色谱柱的顺序不同：分子量大的淋出体积小，分子量小淋出体积大由此，尺寸不同的分子得以分级。排除体积理论凝胶渗透色谱分离过程凝胶渗透过程示意图小分子大分子凝胶基质凝胶珠凝胶色谱仪流程浓度检测装置横坐标：淋出体积纵坐标：溶液浓度凝胶渗透色谱图：如何转为分子量分布曲线？（浓度、分子量）需要测量各个级分分子量的大小与含量。色谱柱的扩展效应凝胶渗透色谱是将各个级分按分子量大小不同分离开来，还不是分子量分布图。⑤测定不同淋出体积高分子的分子量，将浓度-淋出体积曲线转化为分子量分布图

直接法：淋洗液直接经过粘度计或光散射检测器测量各级分的分子量间接法：求M-Ve的关系？2.分子量－淋出体积标定曲线作法：一组分子量不等的单分散试样作为标准样品，分别测量其淋出体积与相应的分子量。凝胶色谱：测淋出体积Ve，试样浓度（紫外、红外、折光指数仪）其他仪器测分子量（粘度计、光散射与之联用）Ma：渗透极限：V0的测定Mb：接近V0＋Vi分离范围：利用标定曲线，已知Ve则可求待测试样的M。最终可求试样的分子量与分子量分布结构不同的高分子，分子量相同，在溶液中尺寸不同，淋出体积不同，lnM-Ve曲线不同，因此，不同结构的高分子须重新标定lnM-Ve曲线。困难：很多高分子难以获得分子量单分散样品，lnM-Ve曲线难以标定

能否寻求一个与分子量相关参量，其值仅和分子的尺寸相关，那么，分子结构不同的高分子可以适用同一条标定曲线（不同结构曲线重合）?3.普适标定曲线Einstein粘度公式普适标定曲线Universalcalibrationcurve

普适标定曲线两种高分子的lgM-Ve曲线不重合，但普适曲线重合利用普适曲线测分子量分布普适曲线已标定测量待测试样的淋出体积，利用普适曲线求出普适曲线的偏离情况原因：分离机理受到干扰。①不良溶剂②溶剂极性小于载体的极性③溶质与载体的相容性不好对于待定体系，必须经过证明方可使用普适曲线4.凝胶色谱注意事项载体、溶剂的选用分子量－淋出体积的标定普适标定曲线试验数据处理（1）试验过程①色谱柱的制备：——②淋洗（测Ve与浓度）——③分子量的测定——④试验数据处理葡聚糖凝胶：葡聚糖凝胶是应用最广泛的一类凝胶，国外商品名为Sephadex。它由葡聚糖Dextran交联而得。交联剂在原料总质量中所占的百分数叫交联度。交联度越大，网状结构越紧密，吸水量越小，吸水量越小，吸水后体积膨胀越少；反之，交联度越小，网状结构越疏松，吸收量越多，吸水后体积膨胀越大。琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶来源于一种海藻多糖琼脂，是一种天然凝胶，不是共价交联，是以氢键交联的。它与葡聚糖不同，孔隙度是以改变琼脂糖浓度而达到的。琼脂糖凝胶的化学稳定性不如葡聚糖凝胶。用琼脂糖凝胶进行分离操作的适宜工作条件是在pH为4.5～9，温度0～40℃。琼脂糖凝胶对硼酸盐有吸附作用，不能用硼酸缓冲液。色谱柱中凝胶种类与选择－－－一般了解即可聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成凝胶，是以丙烯酰胺为单位，由甲叉双丙烯酰胺交联成的。其稳定性比葡聚糖凝胶好。洗脱时不会有凝胶物质被洗脱下来。在pH2~11范围稳定。缺点是不耐酸，遇酸时酰胺键会水解成羧基，使凝胶带有一定的离子交换基团。疏水性凝胶常用的疏水凝胶为聚甲基丙烯酸酯凝胶或以二乙烯苯为交联剂的聚苯乙烯(如StyrogelBio-Beads-S)凝胶。“Styrogel”商品有11种型号，具有大网孔结构，可用于分离分子量1600到40，000，000的生物大分子，适用于有机多聚物，分子量测定和脂溶性天然物的分级，凝胶机械强度好。多孔玻璃珠多孔玻璃珠的化学和物理稳定性号，机械强度高，不但抵御酶及微生物的作用，还能够耐受高温灭菌和较强烈的反应条件。缺点是亲水性不强，对蛋白质尤其是碱性蛋白质有非特性性吸附，而且可供连接的化学活性基团也少。其他载体由聚丙稀酰胺和琼脂糖混合组成的载体已投入应用。它的特点是载体既有羟基又有酰胺基，并且都能单独与配基使用。但这类载体不能接触强碱，为了避免酰胺水解，使用温度不能超过40℃。GPC柱，填料为苯乙烯，二乙烯基苯多孔渗水性的凝胶，其粒子的孔径分布很宽，因此具有很宽的线形范围。有三种尺寸