阿司匹林抗氧化机制探讨

阿司匹林抗氧化作用

机制的探讨主要内容研究背景实验目的作用机制实验方法、实验分组、实验操作、检测指标

统计学分析预期结果可行性分析研究背景阿司匹林是临床常用的抗炎`抗血栓药物,其作用主要是通过抑制前列腺素的合成及环氧化酶的激活而实现的.最新的研究显示阿司匹林还具有对抗过氧化物的损伤`保护血管内皮细胞完整性的功能,其作用可能与诱导某种保护性基因表达,抑制活性氧的反应,特别是阻止铁介导的氧自由基形成有关.而近期发现铁蛋白可以快速结合细胞内游离铁,阻止其通过Fenton反应产生羟自由基对细胞的氧化损伤.因此,本研究欲证实阿司匹林的抗氧化作用是通过影响内皮细胞铁代谢`增加铁蛋白表达而实现的.阿司匹林的抗氧化作用机制铁蛋白：铁蛋白是一种贮存铁元素的可溶性蛋白质，铁蛋白占体内储存铁的三分之一，是检测人体体内是否缺铁最灵敏的一项指标。也是检测肝脏是否存在疾患的重要指标之一，也是常见的乙肝（乙型病毒性肝炎）检查项目之一铁蛋白是铁的贮存蛋白，体内游离的二价铁可通过Fenton反应催化产生OH造成细胞的氧化损伤。由于铁在生物体内的含量较其他金属元素的总和还多得多，因此。它被看作是这类反应的主要催化因子。而铁蛋白与铁有很高的结合力，lmol的铁蛋白可结合4500mol的铁，贮存在铁蛋白中的铁是三价形式，已丧失催化活性。因此，铁蛋白被看作是铁的生理性螫合剂，具有封闭隔离游离铁与活性氧分子的反应，是过氧化反应的抑制剂-。而发现阿司匹林具有诱导铁蛋白表达的作用，对于解释其在各种炎症及心血管疾病中良好的预防和治疗效果将有重要得意义。阿司匹林的抗氧化作用机制Fenton反应过氧化氢与催化剂Fe2+构成的氧化体系通常称为Fenton试剂。在催化剂作用下，过氧化氢能产生两种活泼的氢氧自由基，从而引发和传播自由基链反应，加快有机物和还原性物质的氧化。Fenton试剂一般在pH3.5下进行，在该pH值时羟基自由基生成速率最大。氧自由基的作用：氧自由基的过氧化杀伤，主要是破坏细胞膜的结构和功能，破坏线粒体，断绝细胞的能源，毁坏溶酶体，使细胞自溶。同时它对人体的非细胞结构也有危害作用，可以使血管壁上的粘合剂遭受破坏，使完整密封的血管变得千疮百孔，发生漏血、渗液，进而导致水肿和紫癜等等。说明阿司匹林是通过调节细胞铁代谢增加可用于清除铁的蛋白apo-ferritin(膜脱铁铁蛋白)的合成这类铁蛋白由于处于未饱和状态与Fe3+有极高的亲和性抑制了Fenton反应能有效地阻断氧自由基的产生而达到抗H2O2损伤的作用实验目的探究阿司匹林抗氧化作用的机制；学习内皮细胞的原代与传代培养的方法；观察不同浓度的阿司匹林在抗H2O2

损伤内皮细胞过程中诱导铁蛋白(Fn)表达的情况；培养我们的科研探讨的思维、团结协作和互相交流的能力。实验材料I型胶原酶、TritOnX-100、Ferritin、Apo-ferritin、阿司匹林、消炎痛、水杨酸钠均为Sigma公司产品；内皮细胞生长因子、Ⅳ型胶原包被的6孔培养板为Roche公司产品；细胞因子及内毒素(LPS)为北京邦定公司产品;M199培养液(GIBC0BRL公司)；小牛血清、胰蛋白酶、30%H2O2、兔抗人Ⅷ因子血清等为国产制品。实验方法人脐静脉内皮细胞的培养及鉴定,使用胶原包被的6孔培养板并加入内皮细胞生长因子(10ng/ml)进行脐静脉内皮细胞原代培养。待细胞长满2/3板底并融合成单层时进行传代,接种于22mm×11mm盖玻片上。倒置显微镜观察细胞呈铺路石样镶嵌单层排列,鉴定使用辣根过氧化物酶法(PAP法)检测Ⅷ因子相关抗原。实验分组实验分组使用传2~3代的内皮细胞进行实验,分为对照组和实验组。

实验操作在培养的内皮细胞中加入0.1mmol/L、0.5mmol/L、1.0mmol/L、2.0mmol/L、3.0mmol/L的阿司匹林,孵育24小时后收获细胞测铁蛋白含量；仅用1mmol/L的阿司匹林处理细胞,分别在4、8、16和24小时收获细胞测定铁蛋白含量；用0.1mmol/L的去铁胺及50umol/L的FeCl3预先孵育细胞6小时后加入1mmol/L的阿司匹林,24小时后收获细胞测铁蛋白含量。实验操作以上各对照组加入等体积的M199液培养相同时间后收获细胞测铁蛋白。最后将浓度分别为0.1mmol/L、1.0mmol/L、3.0mmol/L的阿司匹林及1.0mg/ml的Ferritin(已饱和铁)、1.0mg/ml的apo-ferritin(去铁蛋白)加入细胞中预先孵育8小时后,再加入浓度为0.5mmol/L的H2O2,对照组仅加入0.5mmol/L的H2O2,孵育24小时。实验结束时用倒置显微镜观察细胞形态学变化,计数活细胞数,测上清夜中MDA含量及细胞LDH释放率。检测指标细胞内铁蛋白浓度(OD)细胞乳酸脱氢酶(LDH)释放率培养液中丙二醛(MDA)细胞存活率细胞内铁蛋白浓度使用铁蛋白ELISA试剂盒,取胞浆蛋白质悬液50ul,按说明书进行操作,并在450nm波长的酶标仪上读取OD值。以各标准品的OD值为纵轴,铁蛋白浓度为横轴,绘制铁蛋白浓度标准曲线。培养液中细胞乳酸脱氢酶(LDH)释放率

LDH采用常规生化法,分别将测得的培养液中LDH及细胞裂解悬液中LDH值通过下列公式计算LDH释放率,以校正因为各组细胞数的差异而对培养液中LDH值的影响。公式如下:

培养液中MDA采用常规生化法,按试剂盒(晶美公司)说明书操作细胞存活率

0.5%台盼蓝染色细胞,死细胞被染成淡蓝色,而活细胞拒染,分别计数活细胞和死细胞数目,根据以下公式计算细胞存活率:

统计学分析

测定结果以表示,统计学分析采用单因素方差分析,两两比较用q检验.

预期结果不同剂量的阿司匹林诱导内皮细胞铁蛋白的表达：铁蛋白表达的量与阿司匹林浓度之间显示出剂量依赖的关系。不同处理时间阿司匹林诱导铁蛋白的表达：铁蛋白的表达随AS处理时间的延长而逐渐升高,两者间有时间依赖关系。细胞内铁对阿司匹林诱导铁蛋白表达的影响：去铁胺(DFO)能消除AS诱导铁蛋白增加的作用,铁蛋白浓度下降，比单用AS(1.0mmol/L)组铁蛋白浓度低；加入FeCl3后铁蛋白增加，具有明显促进AS诱导铁蛋白增加的作用。预期结果阿司匹林诱导内皮细胞抗H2O2

氧化损伤的作用：正常细胞加入0.5mmol/L的H2O2孵育24小时后细胞绝大部分死亡,LDH释放率及MDA明显增高；但加入0.1mmol/L的AS能抵抗H2O2的损伤作用,细胞存活率及LDH释放率及MDA与损伤组比较有显著性差异，且随AS剂量的增大,抗H2O2损伤的作用增强。Ferritin(已饱和铁)组对细胞无保护作用,而未含铁的apo-ferriein则对细胞有明显保护作用,其结果类似0.1mmol/L的阿司匹林。可行性分析材料的可行性本实验使用的药品,培养基质均为实验常用品,容易获得方法的可行性1.人脐静脉内皮细胞的培养及鉴定:Jaffe内皮细胞培养方法及辣根过氧化物酶法(PAP法)鉴定均是实验室常用方法,操作已很成熟.2.实验分组