青霉素培养基优化

青霉素生产的培养基优化的具体实验方法

培养基优化的基本原理一个批发酵(流加发酵):可以分为生长期和产物形成期两个阶段。第一阶段:控制菌体的生长,目的是使长好的菌体能够处于最佳的产物合成状态,即如何控制有利于微生物催化产物合成所需酶系的形成.。第二阶段:控制产物的合成;找出影响反应速度变化的主要因素并加以控制使产物的形成速度处于最佳或底物的消耗最经济。生产青霉素的菌种目前，国内青霉素生产菌按其在深层培养中菌丝的形态分为丝状菌和球状菌两种。根据丝状菌产生孢子的颜色又分为黄孢子丝状菌和绿孢子丝状菌，常用菌种为绿孢子丝状菌，如产黄青霉菌。青霉素制备的一般流程图菌种孢子制备种子制备发酵发酵液预处理及种子加滤提取及精制成品检验成品包装前体发酵阶段提取阶段前体物质

前体：某些化合物加入到发酵培养基中，能直接被微生物在生物合成过程结合到产物分子中去，而其自身的结构并没有多大变化，但是产物的产量却因加入而有较大的提高。青霉素：分子量356苯乙酸:分子量136青霉素产生菌的生长过程分生孢子发芽期菌丝繁殖期脂肪粒形成期脂肪粒减少，小空孢大空孢自溶菌丝生长期青霉素分泌期菌丝自溶期青霉素发酵培养基成分：碳源：青霉菌能利用多种碳源如乳糖、蔗糖、葡萄糖等。目前采用淀粉水解糖，糖化液进行流加。氮源：可采用玉米浆（0.3%-0.4%）、花生饼粉、精制棉籽饼粉或麸皮粉等有机氮源，及醋酸铵（提供氮源，同时提供碳源）、氯化氨、硫酸氨、硝酸氨等无机氮源。前体：为生物合成含有苄基基团的青霉素G，需要在发酵中加入前体如苯乙酸或苯乙酰胺。由于它们对青霉素有一定毒性，故一次加入量不能大于0.1%，并采用多次流加方式加入。无机盐：包括硫、磷、钙、镁、钾等盐类。铁离子对青霉素有毒害作用，应严格控制发酵液中铁含量在30ug/mL以下。青霉素发酵培养基基本配方乳糖----------22.5g,葡萄糖----------7.5g,醋酸铵----------8.0g,Na2SO-----------40.5g,MgSO4•7H2O----------0.25g,FeSO4•7H2O----------0.1g,CuSO4•5H2O----------0.005g,MnSO4•7H2O----------0.02g,CaCl2•2H2O----------0.05g,ZnSO4•7H2O----------0.02g,苯乙酸---------1.0g,蒸馏水---------1000ml,pH6.5121℃灭菌20min碳源PK：乳糖比葡萄糖更优越青霉素的生物合成，受糖分解代谢产物的阻遏，如合成青霉素的酰基转移酶就会被阻遏。在青霉素发酵过程中，被青霉素迅速利用的葡萄糖有利于菌体生长，但抑制青霉素的合成。被缓慢利用的乳糖，水解成单糖的速度正好符合青霉素生产期合成青霉素的需要，而又不会产生高浓度的分解产物来抑制青霉素的合成，是生产青霉素的优越碳源。但是，由于乳糖价格较贵，成本较高，故在生产实践中常通过间隙或滴加葡萄糖的方法控制培养液中糖的含量，以符合菌体生长和青霉素生物合成的需要。这样，在青霉素的生产中，降低了生产成本的同时，又提高了青霉素的产量。青霉素培养室

培养基优化步骤：1、发酵培养基的配制:按照正交表配制50ml。(三组:每组配制一种培养基,各接种一瓶,250ml三角瓶装液量为50ml)2、摇瓶培养:从一级斜面菌株接种到三角瓶液体培养基,25℃200rpm培养6-7天,可进行青霉素的效价测定。3、金黄色葡萄球菌菌悬液的制备:将37℃培养16-18h的斜面菌种,用0.9%生理盐水洗下，菌悬液稀释至波长650nm透光率为20%的溶液,需要12ml。4、生测平板的制备:生测培养基400ml,加入适当稀释的金黄色葡萄球菌后,制成3*6+2个平板。5、青霉素发酵液效价的测定:发酵结束后5000rpm离心5min．每个被测样品用3套平皿进行测定；37℃培养18-24h后,量取抑菌圈直径的大小。6、填正交实验表格,确定最优培养基配方。正交实验表特点（1）任何两因素之间的都是全面实验，从而保持了可比性。即任何两个因素的各种不同水平的搭配在实验中都出现了，并且出现了相同的次数。（2）任一因素个水平的重复次数相等。（3）绝大多数正交表中各列是等价的，可以任意取用。因此，正交表的实验结果非常易于分析，以至于不需要进行复杂的统计计算，就可直接求出各因素影响的大小、效应的变化趋势等。针对三因子进行正交实验乳糖----------22.5g

或葡萄糖----------7.5g醋酸铵----------8.0g苯乙酸---------1.0g青霉素培养基因子水平表

因子水平乳糖/葡萄糖醋酸铵苯乙酸120/10g7.0g0.7g222.5/7.5g8.0g1.0g325/5g9.0g1.3g设计适合的正交表由于是三因子三水平，可选用L9(34)将乳糖/葡萄糖、醋酸铵、苯乙酸分别安排在第2、3、4列，第1列为空列。为了优化产青霉素的培养基，即比较各培养基产生的青霉素的含量，就可以确定最佳优化培养基成分。本设计方案用抑菌圈大小来间接测定青霉素产量。

正交实验表：

列号试验号12乳糖/葡糖糖3醋酸铵4苯乙酸抑菌圈（g/L）123456789123123123111222333123231312132213321k1k2k3极差R

列号试验号12乳糖/葡糖糖3醋酸铵4苯乙酸抑菌圈（g/L）1234567891231231231112223331232313121322133212.1481.9391.71.7531.8981.9281.851.6491.528k1k2k3极差R实验分析一：试验的目的试验的目的：

产黄曲霉的效价，需要测定抑菌圈大小。从试验中可以看出：

乳糖/葡萄糖，苯乙酸，醋酸铵各自在水平一的时候抑菌圈最大。正交实验结果的统计分析方法分为：极差分析法和方差分析法两种。极差分析法：也称直观分析法，优点是直观、简单，适用范围广，因此在正交设计中最常用；缺点是分析结果较粗糙，当实验结果存在混杂现象时，往往给出错误结论。方差分析法：优点是可通过统计分析的方法排除实验误差的干扰，得出比较科学的实验结论；缺点是计算复杂；在多因子实验中主要用于判断因子的主次。

列号试验号12乳糖/葡糖糖3醋酸铵4苯乙酸抑菌圈（g/L）1234567891231231231112223331232313121322133212.1481.9391.71.7531.8981.9281.851.6491.528k11.9291.9081.858k21.8601.741.701k31.6761.8161.906极差R0.2530.1680.205实验分析二：比较因子极差大小在试验选择的水平范围内。极差可以直接反映各个因素选取的水平变化对优化目标影响的大小。极差越大，说明该因子的水平变动时，实验结果的变动越大，即该因子对实验结果的影响越大，从而可以按极差的大小来决定因子的主次顺序。本实验各因素极差的比较重，可根据极差的大小顺序排除因素影响的主次顺序：乳糖/葡萄糖>苯乙酸>醋酸铵实验分析三：

确定最优的培养基配比

k1、k2、k3反映了因子各水平对实验结果的影响，因而最大的k值对应于最好的水平乳糖/葡萄糖，苯乙酸，醋酸铵各自在水平一的时候抑菌圈最大。本实验较适宜的配比为：

乳糖