聚合酶链式反应

聚合酶链式反应

(PolymeraseChainReaction,PCR)

目的了解DNA特异性片段体外扩增的基本原理，掌握聚合酶链式反应的基本操作方法。基本原理在模板、引物、4种dNTP和耐热DNA聚合酶存在的条件下，特异扩增位于两段已知序列之间的DNA区段的酶促合成反应。基本步骤

1.变性：加热使双链DNA变为单链

2.退火：降温使引物和互补模板在局部形成杂交链

3.延伸：耐热DNA聚合酶按5′→3′方向催化以引物为起始点的延伸反应加热或在碱性条件下可以使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA，称之为DNA变性。去掉变性条件后，单链DNA可以重新结合，再形成双链，称之为DNA复性，又叫退火。PCR反应中退火指引物与模板的结合。退火温度太高,不能很好地复性太低,产生非特异性复性退火温度通常比理论熔解温度低3-5℃DNA双链解离一半时的温度称为熔解温度(Tm)。PCR引物的设计

1.引物设计的原则

2.引物设计的方法

（一）PCR引物设计原则1、引物长度一般为15~30个核苷酸。引物过短会使PCR的特异性降低，过长会提高相应的退火温度，并使延伸温度超过TaqDNA聚合酶的最适温度74℃,亦会影响产物的生成，且合成引物的成本增加。2、引物中的碱基尽可能随机分布，避免出现嘌呤，嘧啶的堆积现象。尤其是引物的3′端不应有连续3个G和C。否则会使引物在模板的G+C富集序列区错误配对。引物中G+C的含量在45~55%左右。设计引物时要考虑3′端和5′端引物具有相似的Tm值。Tm=4（G+C）+2（A+T）。3、引物自身内部不应存在互补序列以避免折叠成发夹结构。按经验，引物自身存在的连续互补序列，一般不超过3bp。4、两个引物之间不应存在互补序列，尤其应避免3′端的互补重叠。5、引物的碱基序列不应与非扩增区域有同源性。尤其是引物3′末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。6、引物3′端碱基是引发延伸的起点，因此一定要与模板DNA配对。引物3′端的最佳碱基选择是G和C。因为它们形成的碱基配对比较稳定。7、引物的5′端可以修饰，如附加限制酶位点，引入突变位点。

Primer5Oligo6（二）引物设计的方法PCR反应五要素1模板2引物3酶4dNTP5bufferPCR反应成分1.PCR反应的缓冲液：①10~50mmol/LTris-Cl

缓冲液，72℃时pH7.2,调节反应体系的pH值，使TaqDNA聚合酶的作用环境维持偏碱性。②50mmol/L的KCl可促进引物退火，大于此浓度将会抑制TaqDNA聚合酶的活性。③镁离子浓度：1.5mmol/L

TaqDNA聚合酶活性需要Mg2+。Mg2+

浓度过低，会显著降低酶活性。Mg2+浓度过高又使酶催化非特异性扩增增强。2.dNTPs

浓度：20~200μmol/L

dNTP浓度高可加快反应速度，同时还可增加碱基的错误掺入率和实验成本。反之，低浓度的dNTP会导致反应速度的下降，但可提高反应的特异性及实验的精确性。3.耐热DNA聚合酶：0.5~5u

在PCR反应中，DNA聚合酶是最关键的因素之一。PCR发明的初期使用的DNA聚合酶是Klenow片段、T4DNA聚合酶和T7DNA聚合酶，它们因对热的稳定性差而未得到广泛应用。直到耐热的DNA聚合酶(TaqDNApolymerase)应用于PCR反应，才使这一技术得到迅速发展和广泛应用。4.引物：0.1~0.5μmol/L

PCR反应引物浓度为0.1~0.5μmol/L。如此过量的引物才能确保模板DNA一旦变性就与引物退火，而不能与其自身退火。但引物浓度偏高会引起错配和非特异性产物扩增，且可增加引物之间形成二聚体的几率，降低扩增效率。但如果该比例太低，PCR效率也会降低。

5.模板在一定范围内PCR产量随模板浓度的升高而显著升高，但模