第6章分子荧光与磷光

第六

讲

分子荧光与磷光法CollegeofChemistry&ChemicalEngineering,YZU1.分子荧光、磷光分析法的基本原理2.荧光分析仪器3.分子荧光定量分析4.荧光的影响因素，分子荧光的分析应用CollegeofChemistry&ChemicalEngineering,YZU基态激发态CollegeofChemistry&ChemicalEngineering,YZU传递途径辐射跃迁无辐射跃迁荧光延迟荧光磷光振动弛豫内部转移系间窜跃外部转移分子中电子受激跃迁到激发态后，处于激发态的分子是不稳定的，去激返回到较低激发态或基态时有两种方式：无辐射去激和辐射去激.CollegeofChemistry&ChemicalEngineering,YZU1.分子荧光、磷光分析法的基本原理分子吸收光能被激发，回到基态所产生的发光为光致发光激发光1.1.光致发光的机理基态激发态荧光或磷光CollegeofChemistry&ChemicalEngineering,YZU通常具有不饱和基团的基态分子光照后，一个价电子跃迁，跃迁到激发态1.2.分子荧光光谱的产生基态单重态S0第一激发单重态S1单重态分子具有抗磁性，激发态的平均寿命约为10-8sn2S+1LJ光谱项中2S+1=1CollegeofChemistry&ChemicalEngineering,YZUS0振动驰豫（VR）—同一电子能级中，从较高振动能级到较低振动能级的过程内部转换IC—相同的多重态之间的转换S-S吸光吸光S0S1S2CollegeofChemistry&ChemicalEngineering,YZUS0吸光吸光S0S1S2（1）荧光谱图中包含：激发（ex）和发射（em）光谱（2）分子荧光是带状光谱CollegeofChemistry&ChemicalEngineering,YZU（3）.激发光谱与发射光谱的关系

a.Stokes位移

一般情况下，荧>激激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。

b.发射光谱的形状与激发波长无关电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量(如能级图2,1)，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光(如‘2)。

c.

镜像规则通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样）成镜像对称关系。CollegeofChemistry&ChemicalEngineering,YZU镜像规则的解释

基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动能级分布类似；基态上的零振动能级与第一激发态的二振动能级之间的跃迁几率最大，相反跃迁也然。

CollegeofChemistry&ChemicalEngineering,YZU200250300350400450500荧光激发光谱荧光发射光谱nm蒽的激发光谱和荧光光谱CollegeofChemistry&ChemicalEngineering,YZUT1S0振动驰豫（VR）—同一电子能级中，从较高振动能级到较低振动能级的过程内部转换IC—相同的多重态之间的转换S-S吸光吸光S0S1S2系间窜跃（ISC）—不同的多重态之间的转换S-T1.3.分子磷光光谱的产生CollegeofChemistry&ChemicalEngineering,YZU基态单重态S0激发态单重态S1S2……激发态单重态T1（1）若分子中电子跃迁过程中伴随着自旋方向的改变，由单重态→三重态，净自旋0。这种跃迁为禁阻跃迁（2）三重态分子具有顺磁性，激发态的平均寿命约为10-4~10S产生磷光的物质较少磷光强度弱提高检测限CollegeofChemistry&ChemicalEngineering,YZUT1S0VRICS0S1S2ISC（3）三重态能量低于单重态.λ激发<λ荧光<λ磷光CollegeofChemistry&ChemicalEngineering,YZU2.荧光（磷光）分析仪器CollegeofChemistry&ChemicalEngineering,YZU2.1荧光分析仪器

测量荧光的仪器主要由四个部分组成：激发光源、样品池、双单色器系统、检测器。

特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。基本流程如图：单色器：选择激发光波长的第一单色器和选择发射光(测量)波长的第二单色器；光源：灯和高压汞灯，染料激光器(可见与紫外区)检测器：光电倍增管。2.荧光（磷光）分析仪器CollegeofChemistry&ChemicalEngineering,YZU仪

器

光

路

图CollegeofChemistry&ChemicalEngineering,YZU仪器框图该型仪器可进行荧光、磷光和发光分析；CollegeofChemistry&ChemicalEngineering,YZU2.1.1.光源激发光源一般要求比吸收测量中的光源有更大的发射强度；适用波长范围宽荧光计中，常使用卤钨灯作光源荧光光度计中常用高压汞灯和氙弧灯利用汞蒸气放电发光的光源；常用其发射365nm、405nm、436nm三条谱线以365nm的谱线最强应用最广泛的一种光源，可发射250~800nm很强的连续光源CollegeofChemistry&ChemicalEngineering,YZU荧光计用滤光片作单色器，荧光计只能用于定量分析，不能获得光谱。大多数荧光光度计一般采用两个光栅单色器，有较高的分辨率，能扫描图谱，既可获得激发光谱，又可获得荧光光谱。第一单色器作用：分离出所需要的激发光，选择最佳激发波长

ex

，用此激发光

ex激发液池内的荧光物质。（VB2ex为471nm）第二单色器作用：滤掉一些杂散光和杂质所发射的干扰光，用来选择测定用的荧光波长

em。在选定的

em

下测定荧光强度，定量分析。（VB2

em为525nm）2.1.2.单色器471nm525nm如测VB2CollegeofChemistry&ChemicalEngineering,YZU盛放测定溶液.通常是石英材料的方形池，四面都透光，只能用手拿棱或最上边2.1.3.样品池把光信号转化成电信号,放大,直接转成荧光强度荧光的强度一般较弱，要求检测器有较高的灵敏度，荧光光度计采用光电倍增管。2.1.4、检测器CollegeofChemistry&ChemicalEngineering,YZU2.2.激发光谱和荧光光谱获得

Iex激发光谱固定em

荧光波长获得方法：先把第二单色器的波长固定，使测定的em不变，改变第一单色器波长，从200~700nm

扫描，让不同波长的光照在荧光物质上，测定它的荧光强度，以I为纵坐标，ex为横坐标得左图，即荧光物质的激发光谱从曲线上找出ex，实际上选波长较长的高波长峰激发光谱是在固定荧光波长下，测量荧光体的荧光强度随激发波长变化的光谱。550nmCollegeofChemistry&ChemicalEngineering,YZU异常现象

Iex激发光谱固定em

荧光波长550nm550nm275nmCollegeofChemistry&ChemicalEngineering,YZU荧光光谱固定ex激发光波长获得方法：先把第一单色器的波长固定，使激发的ex不变，改变第二单色器波长，让不同波长的光扫描，测定它的发光强度，以I为纵坐标，em为横坐标得左图，即荧光物质的发射光谱。从曲线上找出最大的em471nm荧光强度波长（nm)300400500Iλλfl,maxCollegeofChemistry&ChemicalEngineering,YZU荧光光谱固定ex激发光波长471nm荧光强度波长（nm)300400500Iλλfl,max471nmCollegeofChemistry&ChemicalEngineering,YZU激发光谱和荧光光谱荧光强度波长（nm)300400500硫酸奎宁的两个光谱Iλλex,maxλfl,maxCollegeofChemistry&ChemicalEngineering,YZU2.3磷光分析仪器荧光计上配上磷光测量附件即可对磷光进行测量。在有荧光发射的同时测量磷光。

测量方法：（1）通常借助于荧光和磷光寿命的差别，采用磷光镜的装置将荧光隔开。（2）采用脉冲光源和可控检测及时间分辨技术。室温测量时，不需要杜瓦瓶。CollegeofChemistry&ChemicalEngineering,YZU光源单色器样品池检测器光源单色器1样品池单色器2检测器定量关系不同（1）同一种光强度的吸收，（2）另一种光的强度仪器光路不同（1）直线，（2）一定的角度荧光法有更优的检测性能CollegeofChemistry&ChemicalEngineering,YZU光源单色器1样品池单色器2检测器光源单色器1样品池单色器2检测器磷光的激发与发射的检测不同时磷光法可避免激发背京的干扰，有更优的检测性能CollegeofChemistry&ChemicalEngineering,YZU溶液的荧光强度(If)与溶液吸收的光强度(Ia)及荧光量子产率(Фf）有如下关系

If=f

Ia

由Lambert-beer定律及吸收光强度的概念，可推导出，当bc≤0.05时，有：

If=2.303fI0

bc

与荧光类似，溶液的磷光强度(IP)与低浓度下磷光物质浓度之间的关系可表示如下：

IP=2.303ST

PI0bc

3.分子荧光（磷光）定量分析CollegeofChemistry&ChemicalEngineering,YZU定量分析依据If=Kc

Ip=Kc1)标准曲线法——最常用的定量分析方法将已知量的标准物质与试样在相同条件下处理，配制一系列标准液，测定它们的相对发光强度。以相对荧光强度为纵坐标，以标准溶液的浓度为横坐标浓度c1c2c3c4c5

cx荧光强度If1If2If3If4If5

IfxIf

IfxcxcCollegeofChemistry&ChemicalEngineering,YZU2)比较法——较简单如果试样数量不多，可用比较法进行测量配一标准溶液浓度为cs，cs与未知液浓度cx相近，并在相同条件下测定它们的荧光强度未知液If

x=Kcx

标准液If

s=Kcs比较CollegeofChemistry&ChemicalEngineering,YZU3)多组分混合物的荧光分析(1)如果两组分的荧光峰相互不干扰,可直接测定可分别在各自的荧波长处测定,求出它们的含量(2)如果两组分的荧光峰相互干扰,但激发光谱有显著区别,在某一激发光下一个组分产生荧光峰,另一组分不产生荧光;可选用不同的激发光进行测定CollegeofChemistry&ChemicalEngineering,YZU(3)如果两组分的荧光光谱和激发光谱相互干扰利用荧光强度的加和性（If=If1+If2+If3+…），在适宜的荧光波长处测定，用联立方程来求解例：硫胺荧CT

ex=385nm

em=435nm

吡啶硫胺荧CP

ex=410nm

em=480nm相互干扰荧光光谱重叠在385nm下激发，在435和480nm下分别测荧光强度,或410nm下激发在435和480nm下分别测荧光强度,CollegeofChemistry&ChemicalEngineering,YZU在385nm下激发，在435和480nm下分别测荧光强度If=Kc——K:纯物质在选定波长下测If,求K或410nm激发，在435和480nm下分别测荧光强度If435/385=26339104cT+210104cPIf480/385=9685104cT+1022104cPIf480/410=2816104cT+1709104cPIf435/410=6419104cT+252104cP硫胺荧浓度吡啶硫胺荧浓度CollegeofChemistry&ChemicalEngineering,YZU4.荧光的影响因素，分子荧光的分析应用CollegeofChemistry&ChemicalEngineering,YZU

大多数荧光物质首先吸收紫外可见光,产生*，n*跃迁激发，经过非辐射跃迁，再发生*,*n跃迁产生荧光。

*与n*跃迁相比，摩尔吸收系数大102~103倍，寿命短。

*跃迁常产生较强的荧光，n*跃迁产生的荧光弱，但可产生系间窜跃，产生更强的磷光。4.1.跃迁类型CollegeofChemistry&ChemicalEngineering,YZU具有共轭体系的芳环或杂环化合物，电子共轭程度越大，越易产生荧光;环越多，共轭程度越大，产生荧光波长越长，发射的荧光强度越强

f

ex/nm

em/nm

0.11205278苯

0.29286310萘0.46365400蒽

350菲线状环结构比非线状结构的荧光波长长4.2.共轭效应——有较强的荧光CollegeofChemistry&ChemicalEngineering,YZU芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系，多数能发生荧光。多环芳烃是重要的环境污染物，可用荧光法测定例：3，4-苯并芘——是强致癌物ex=386nm

em=430nmCollegeofChemistry&ChemicalEngineering,YZU4.3.刚性平面结构—较稳定的平面结构具有强荧光的分子多数有刚性平面结构荧光素：氧桥把两个环固定在一个平面上，具有平面结构，强荧光物质酚酞：无氧桥把两个环固定，不能很好的共平面，为非荧光物质CollegeofChemistry&ChemicalEngineering,YZU例1，2-二苯乙烯反式：平面构型强荧光体顺式：非平面构型非荧光体CollegeofChemistry&ChemicalEngineering,YZU4.4.取代基效应——取代基对荧光物质的荧光特征和强度也有很大影响。分成三类：（1）增强荧光的取代基

——有-OH、-OR、-NH2、-NHR、-NR2等给电子基团。由于基团的n电子（孤对电子）的电子云与苯环上的轨道平行，共享了共轭电子，扩大了共轭体系，使荧光波长长移，荧光强度增强。CollegeofChemistry&ChemicalEngineering,YZU（2）减弱荧光的取代基

——-COOH、-NO2

、-COOR、-NO、-SH吸电子基团,使荧光波长短移，荧光强度减弱芳环上被F、Cl、Br、I取代后，使系间窜跃加强，磷光增强，荧光减弱。其荧光强度随卤素原子量增加而减弱，磷光相应增强，这种效应为重原子效应。（3）影响不明显的取代基

——-NH3+、-R、SO3H等取代基的空间位阻对荧光也有影响，荧光减弱CollegeofChemistry&ChemicalEngineering,YZU4.5.电子跃迁类型含N、O、S杂原子的不饱和有机物，如喹啉和芳酮类物质都含有未键合的孤对n电子，电子跃迁多为n*，系间窜跃强烈，荧光很弱或不发荧光。不含N、O、S杂原子的有机荧光体多发生*类型的跃迁，摩尔吸收系数大，约为104，荧光强。CollegeofChemistry&ChemicalEngineering,YZU4.6.金属螯合物的荧光大多数无机盐类金属离子，不能产生荧光，但某些螯合物都能产生很强的荧光，可用于痕量金属离子的测定。