第五章 体内药物分析

第一节体内样品的采集与贮藏第二节体内样品分析的前处理第三节体内样品分析方法与方法验证第五章体内药物分析体内药物分析：是指体内样品（如体液、组织、器官和排泄物等）中药物及其代谢物或内源性生物活性物质的定量分析。药物进入体内后，其化学结构与存在状态均可能发生变化。存在状态游离型的药物或代谢物结合型的药物或代谢物、结合物（缀合物）体内样品的特点1．样品量少、不能重复取样：体内样品采样量一般为几十微升至数毫升；多数在特定条件下采集，无法再次取样。2．被测成分浓度低：通常在10-9～10-6g/ml，甚至10-12g/ml。3．干扰物质多：血样中含有蛋白质、脂肪等和大量内源性物质；以及代谢物、结合物等均可能干扰测定。1．体内样品一般均需经过分离、净化后才能进行分析。2．对分析方法的灵敏度及专属性要求较高。在测定前需浓缩、富集以适应分析方法要求。3．分析工作量大，数据的处理和阐明较为复杂。体内药物分析的特点色谱分析法：HPLC、UPLC、GC、HPCE灵敏度高、专属性强免疫分析法：RIA、FIA、EIA灵敏度很高、专属性较强生物学方法：体内样品中抗生素类药物的测定体内药物测定方法第一节体内样品的采集与贮藏一

体内样品的种类二

体内样品的采集与制备三体内样品的贮存与处理血液、尿液、唾液、头发、脏器组织、乳汁、精液、脑脊液、泪液、胆汁、胃液、淋巴液、粪便等尿液——主要用于药物剂量回收研究、药物肾清除率和生物利用度等研究，以及测定代谢物类型等脑脊液——怀疑药物损伤血脑屏障一体内样品的种类二

体内样品的采集与制备（一）血样：

离心全血离心上层：血清(serum)下层：血细胞（凝块）上层：血浆(plasma)下层：血细胞血液自然凝结加抗凝剂采取：一般是静脉取血、针刺手指、耳垂取血

动物实验可直接从动脉或心脏采取（二）尿液优点：采取简便，取样量大，受试者无痛苦。缺点：药物浓度变化也大，需采集一定时间内的尿样。采取：动物应在代谢笼中进行，通过笼下漏斗接收。药物可以原型（母体药物）或代谢物及其缀合物形式从尿中排出。尿中药物大多呈缀合状态，测定前要将缀合的药物游离。（三）唾液：

优点：样品易得，取样无痛苦，尤易为儿童接收。缺点：药物浓度变化大采取：漱口15分钟，收集自然流出或经舌在口内搅动流出的唾液。也可采取物理、化学方法刺激使唾液流出。

制备：采取后，立即测量除去泡沫部分的体积。分层→离心→取上清液（四）组织：

药物动物实验、服用药物过量中毒死亡时使用组织常用的脏器组织有：胃、肝、肾、心、、肺、脑等

制备：组织样品在测定之前，需先加入一定量水或缓冲液匀浆均匀化。

处理：沉淀蛋白、酸水解或碱水解

、酶水解（枯草菌溶素）三、体内样品的贮存取样后最好立即进行分析，不能立即分析的，则短期内冷藏(4℃)，长期冰冻(-20℃或-80～70℃)

。全血未经分离，不宜直接冷冻保持。尿液是很好的细菌生长液，若需收集24小时或更长时间的样品或不能立即测定的，应置冰箱冷藏或加防腐剂（1%甲苯、过饱和氯仿等）保存。

注意：避免将样品反复解冻-冷冻-解冻——冷冻前分装成若干小份贮存（一）冷藏与冷冻1、终止酶的活性①液氮中快速冷冻②微波照射③匀浆及沉淀④加入酶活性阻断剂（氟化钠、四氢尿苷、三氯醋酸等）2、阻止药物氧化及光解：易被氧化药物，加抗氧剂（如维生素C）（二）去活性第二节

体内样品分析的前处理药物在体内的存在形式游离型：原形药物或代谢物缀合物：药物或其代谢物与葡萄糖醛酸或硫酸等结合结合物：药物与蛋白质结合一、体内样品前处理的目的2、满足测定方法的灵敏度、准确度和专属性3、改善分析环境：保护测定仪器不受体内样品中类脂和蛋白质等的污染。1、使待测药物游离二、生物样品前处理方法分离与浓集化学衍生化去除蛋白质缀合物的水解（一）去除蛋白质加入与水混融的有机溶剂(乙腈、甲醇、丙酮、四氢呋喃)加入中性盐(饱和硫酸铵、硫酸钠、枸橼酸盐)加入强酸(三氯醋酸、高氯酸、偏磷酸)加入金属沉淀剂(CuSO4-Na2WO4、ZnSO4-NaOH)热凝固法水溶性有机溶剂除蛋白效果血清与水溶性有机溶剂比例为1:(1~3)可除90%蛋白乙腈—块状絮凝物、易于分离；成分损失可能性大，上清液pH为8.5-9.5甲醇—细小颗粒沉淀、不易分离；成分损失可能性小，上清液pH为8.5-9.5超速离心分离（12000r/min)—离心1-2min强酸及中性盐除蛋白效果血清与饱和硫酸铵比例为1：2可除90%蛋白血清与强酸比例为1：0.6可除90%蛋白（二）缀合物的水解尿液中药物多数呈缀合物状态。（1）酸水解：适量盐酸（2）酶水解：常用β-葡糖糖醛酸苷酶或硫酸酯酶或两者混合。（3）溶剂解某些药物的硫酸酯，往往加入萃取溶剂时发生分解，同时提取入有机溶剂中。目的：从大量共存物中分离出所需要的微量组分方法：1、液相萃取（liquid-liquidextraction,

LLE）（三）分离与浓集2、固相萃取（

solid

phaseextraction，SPE）

液-液萃取中需注意的问题：①适当的有机溶剂：常用乙醚、氯仿、乙酸乙酯等。③离子型药物：离子对萃取（ionpairextraction）④提取技术：②适当的水相pH值1、液相萃取（LLE）多数药物是亲脂性的，可用有机溶剂萃取出来，而大多数内源性杂质是强极性的，不被萃取出。对于离子性特强，水溶性极大的药物，可采用离子对萃取②适当的水相pH值：由药物的pKa值确定，一般碱性药物在碱性条件、酸性药物在酸性条件下萃取。碱性药物最佳pH高于pKa值1-2个pH单位酸性药物最佳pH低于pKa值1-2个pH单位中性药物：pH=7附近为避免体液中杂质进入有机相，溶液pH值偏高一些较好空白血清的乙醚提取物的HPLC图（UV-220nm检测）pH为13时空白血清杂质峰最少提取溶剂用量：有机相与水相比1:1或2:1

提取方式：密塞情况下，将萃取试管置于振荡器或涡旋混合器混合，也可采用首尾颠倒的方式混合。提取次数：尽可能少，不要求提取完全，而要求适量而稳定的提取率。离心与分离通常离心机4000rpm，离心10min分离出有机相。④提取技术：

2、固相萃取（SPE）担体亲水性：硅藻土疏水性：活性炭、聚苯乙烯或C18化学键合硅胶常用微型柱：BoundElut、Sep-pak利用固体材料为固定相，当含多组分的体内样品溶液通过时，固定相对各组分具有不同的亲和性，一些组分受到“分配”或“吸附”作用而滞留在固定相上，当使用流动相冲洗时，由于流动相对组分的亲和性更强，遂按组分洗脱的难易，将其携带出柱，使之达到分离。

用有机溶剂(甲醇)冲洗——洗净用水冲洗——活化上样用水或缓冲液冲洗，洗去内源性物质有机溶剂洗脱药物收集洗脱液······微型柱固相萃取步骤真空固相萃取装置固相微萃取法（Solid-phasemicroextraction,SPME）

SPME

装置图1、压杆2.筒体3.压杆卡持螺钉4.Z形槽5.筒体视窗6.调节针头长度的定位器7.拉伸弹簧

8.密封隔膜9.注射外管10.熔融石英纤维11.熔融石英纤维

（表面涂有高分子固相液膜）

3、被测组分的浓集浓集方法：1、末次提取时，加入溶剂尽可能少2、挥去溶剂：（1）通入气流（氮气）吹干（2）减压法：适于易随气流挥发或遇热不稳定药物（四）化学衍生化GC中，极性较大、挥发性低的药物或代谢物→极性小、稳定性好的衍生物HPLC中，分子结构无紫外、荧光吸收→具紫外吸收或荧光的衍生物GC中化学衍生化RCOOH、ROH、RSH、RNH2CH3I、CH3N2等RCOOCH3、ROCH3、RSCH3、RNHCH3例：烷基化极性降低，挥发性增加烷基化（碘庚烷、叠氮甲烷）酰化（乙酸酐、丙酸酐）硅烷化（三甲基氯硅烷TMCS等）。HPLC中化学衍生化化学衍生化分类柱后衍生化柱前衍生化衍生化方法紫外衍生化荧光衍生化：邻苯二醛、丹酰氯、荧胺等。非对映衍生化：手性衍生化试剂将药物对映异构体转变为非对映异构体，用常规HPLC测定。第三节体内样品分析方法与方法验证一、分析方法的建立（一）方法的选择1、色谱分析法：GC、HPLC、GC-MS、HPLC-MS适合大多数小分子药物及代谢物的测定2、免疫分析法：RIA、FIA、EIA

多用于蛋白质、多肽等生物大分子类的检测3、生物学方法：抗生素类药物的体内分析，需与特异性高的色谱法平行检测（二）分析方法建立的一般程序1、对照品测定：选择测定条件、浓度线性范围等2、经过纯化处理的空白样品测定：测定空白值，考虑分离度。3、空白样品加对照品（质控样品）测定：求得样品回收率，检验样品中是否有干扰。4、体内实际样品测定二分析方法的验证(一)特异性(二)标准曲线与线性范围(三)精密度与准确度(四)定量下限(五)样品稳定性(六)提取回收率

所测的物质是原型药物或特定的活性代谢物，内源性物质和相应的其他代谢物及其他药物不影响样品的测定。空白血浆空白血浆＋标准物质受试血浆(一)特异性1、内源性物质的干扰：比较待测物标准物质、至少6个不同个体的空白生物介质和质控样品的检测信号2、未知代谢物的干扰：比较至少6个不同个体用药后的实际体内样品和质控样品的检测信号3、伍用药物的干扰：比较待测药物、伍用药物、质控样品和添加伍用药物的干扰样品的检测信号4、与参比方法的相关性：(二)标准曲线与线性范围Y=9.56610-2X+6.15310-3

r=0.9995空白生物介质加入系列标准溶液至少6个浓度点建立标准曲线线性范围必须覆盖全部待测浓度，不得外推6.412.819.225.63232.41.81.20.60茶碱(µg/ml)·····isHH最高浓度应高于达峰浓度(Cmax)；最低浓度应低于Cmax的10%～5%——回归方程的截距应接近于零——相关系数要求≥0.99(色谱法)或≥0.98(生物学方法)附录《药物制剂人体生物利用度和生物等效性试验指导原则》规定相对回收率一般应在85～115%范围内，在LOQ附近应在80～120%范围内。(三)精密度与准确度1、准确度方法：取空白生物基质（如血浆）数份，加入高、中、低三种浓度的药物对照品，制备质控(qualitycontrol，QC)样品，照标准曲线项下方法操作，用标准曲线计算——高(接近上限)、中、低(LLOQ的3倍)3个浓度——每一浓度至少5个样本——与随行的标准曲线同法测定、计算，每个样品分析测定1次方法：日内精密度（intra-dayPrecision）：将高、中、低三种药浓样品，每种分别取样3-5次，同一天内同一仪器测定。日间精密度（inter-dayPrecision）：将高、中、低三种药浓样品，一周（或10天）内分别取样3-5次测定。2、精密度批内精密度：

——将高、中、低三种药浓样品，每一浓度5～6个样品，每个样品测定1次，用随行标准曲线分别计算3个浓度及每1浓度的RSD批间精密度：

——每1分析批内每一浓度制备1个样品，每个样品测定1次；用随行标准曲线计算3个浓度(每一浓度5～6个分析