转录与转录后加工

transcriptionandpost-transcriptionalprocessing

(转录和转录后加工)

陈熙C4005

xi.chen@主要内容转录概述原核生物RNA聚合酶原核生物转录过程真核生物转录特点真核生物基因的启动子及转录起始复合物的组装主要内容转录后加工rRNA前体的加工tRNA前体的加工mRNA前体的加工RNA的自我剪接真核mRNA前体的剪接真核mRNA前体的选择性剪接RNA的编辑transcription（一）概述以DNA为模板合成RNA的过程。转录和DNA复制的区别Template(模板)模板链(templatestrand)：反义链(anti-sensestrand)非模板链(non-templatestrand):编码链(codingstrand),有意义链(sensestrand)

differentgenesmayusedifferentstrandsastemplate（二）原核生物RNA聚合酶E.coliRNA聚合酶全酶(holoenzyme)：

α2ββ’ωσ核心酶(coreenzyme)：

α2ββ’ωDNA指导的RNA聚合酶DNAdependentRNApolymerase(DDRP)β’αα

ωσcoreenzyme细菌中单一类型的RNA聚合酶负责合成所有的RNA。利用SDS从E.coliRNA聚合酶中分离各个亚基亚基基因分子量(kD)数目功能αrpoA402酶的装配，与启动子上游元件及活化因子结合βrpoB1501结合底物，催化磷酸二脂键形成β’rpoC1601结合DNA模板σrpoD32-901识别启动子，促进转录起始ω9未知σ因子的结构σ70因子的一级结构σ因子与启动子的特异性相互作用E.coli与枯草杆菌各的σ因子同源区结合核心酶后（三）转录过程promoterterminatorStartpoint+10+20downstream+1upstream-35-10–1transcribedregion1.templaterecognition（模板的识别）2.Initiation(起始)3.elongation(延伸)4.termination（终止）原核生物转录过程启动子（promoter）：RNA聚合酶识别，结合并开始转录的一段DNA序列。模板的识别转录起始位点-35序列-10序列TTGACATATAAT五种不同启动子的共同顺序箭头表示突变，向上表示增加转录水平，向下表示降低转录水平提供RNA聚合酶识别信号有助于DNA局部双链解开σ因子对RNA聚合酶与DNA结合的影响σ因子使RNApol特异性的识别启动子σ因子的更替可控制转录起始转录的起始RNA链的合成方向5′→3′转录的延伸σ循环:RNA聚合酶与启动子结合,使DNA局部熔解,当转录延伸时,σ因子与核心酶分离,与其它新的核心酶结合,起始新的转录事件.转录的终止终止子（terminator）：提供终止信号的DNA序列。E.coli有两类不依赖ρ因子的终止子:

依赖于ρ因子的终止子不依赖ρ因子的终止子:简单终止子，又称内在终止子（Intrinsicterminator）转录终止不依赖任何辅助因子。而依靠转录产物形成特殊的茎环二级结构具有茎环结构有茎环结构，富含GC茎环结构后有寡聚尿苷依赖ρ因子的终止子（rho-dependentterminators）穷追(Hotpursuit)模型通读(read-through)：某些因子可使酶越过终止子继续转录。抗终止因子(anti-terminationfactor)：引起抗终止作用的蛋白质。常见于某些噬菌体的时序控制通读典型的真核细胞转录产物是单顺反子mRNA（四）真核生物转录特点真核DNAPAPBPC转录mRNAABC原核DNAABCP转录mRNAABC真核细胞转录和翻译在时间上和空间上都是分开的，转录在细胞核，翻译在细胞质。

真核细胞RNApol高度分工启动子更复杂和更多样性，不同的RNA聚合酶有不同的启动子真核生物转录需要许多转录因子(transcriptionfactor,TF）的参与。真核基因DNA的顺式作用元件比原核复杂得多真核生物的转录调控以正调控为主。转录因子（transcriptionfactors）Definition:

转录起始所需要的，而非RNA聚合酶本身组分的任何蛋白质Functions:BindingtoDNARecognizinganotherfactorRecognizingRNAPolIncorporatingintoinitiationcomplex转录因子（transcriptionfactors）转录因子（transcriptionfactors）Classification：普遍性转录因子：使RNA聚合酶结合到启动子上，形成前起始复合物。其作用相对较弱，

仅在本底水平上支持转录并实施最小程

度的调控。又称通用因子转录调控因子：通过与启动子及增强子等调控元件结合而调控转录活性的蛋白因子包括上游因子和可诱导因子是在所有启动子的RNA合成中都是必需的。是能够识别并结合转录起始位点上游的特异性短序列的DNA结合蛋白。普遍存在，且活性不被调控。在特定的时间或特定的组织被激活或合成，能控制转录在特定的时间和地点进行的一类因子。通用因子(Generalfactor)上游因子(Upstreamfactor)可诱导因子(Induciblefactor)转录因子（transcriptionfactors）顺式作用元件（Cis-actingelements）Definition:

指与基因表达调控相关、能够被调控蛋白特异性识别和结合的特异DNA序列。包括启动子、增强子，负调控元件等反式作用因子(Trans-actingfactors)Definition:

指真核细胞内通过与顺式作用元件相互作用而调节基因转录活性的蛋白质因子。

S1核酸酶图谱技术引物延伸法测定转录起点的方法（五）真核生物基因转录起始的几种研究方法1.S1核酸酶图谱技术5’mRNA3’3’5’S1探针5’3’3’5’S1核酸内切酶水解变性电泳5’mRNA3’3’5’S1探针5’mRNA3’3’5’逆转录延伸引物变性电泳2.引物延伸法1.5’端缺失系列分析法:常用于测定哺乳动物基因调控区的上游边界研究顺式作用元件结构的方法5’端缺失系列分析法AB切割位点AB核酸外切酶CAB连接接头ABCAB切割位点B和C报告基因连接报告基因载体转化E.coli分离质粒DNA分别转染培养细胞通过报告基因产物的活性，以检测基因活化与上游调控区片段的关系2.接头扫描突变法可以找出存在于基因转录起始位点和5’端边界之间的所有调控元件方法的基础是构建一系列序列重叠的调控区突变体，每个突变体内各有一个短序列的核苷酸序列被打乱，然后分别转染培养细胞，或微量注入爪蟾卵母细胞，并分析它们对报告基因的影响接头扫描突变法机制疱疹病毒胸苷激酶基因启动子的连接扫描突变（六）真核生物RNA聚合酶对α-鹅膏蕈碱的敏感性

酶的种类

中等敏感

RNA聚合酶III

敏感

RNA聚合酶II

不敏感

RNA聚合酶I

1.真核细胞的三类RNA聚合酶α-鹅膏蕈碱的结构鬼笔鹅膏菌是一种能产生α-鹅膏蕈碱的毒磨RNA聚合酶对α-鹅膏蕈碱的敏感性（核仁）（核质）U6snRNA,7SLRNA,7SKRNA老鼠肝脏细胞三类RNA聚合酶在离子交换层析中的分离RNA聚合酶I定位于核仁RNA聚合酶II和III定位于核质

EukaryoticRNApolIIhas>10subunits2.RNA聚合酶II酵母RNA聚合酶II有12个亚基核心亚基：Rpb1、Rpb2和Rpb3共同亚基：

Rpb5、6、8、12存在于所有三类RNA聚合酶中非必要亚基：Rpb4、7RNA聚合酶II最大亚基的异质性CTD:

carboxylterminaldomain（C末端结构域）Aminoacidsequence:

—Tyr—Ser—Pro—Thr—Ser—Pro—Ser—TargetforkinaseFunction:triggerinitiation老鼠浆细胞RNApolII部分亚基结构o、a、b是最大亚基的三种形式与酵母的RNApolII的Rpb1相对应c是与酵母的Rpb2相对应RNApolII最大亚基不同形式间的相互关系IIa是CTD未被磷酸化的形式，主要负责转录的起始IIo是CTD被磷酸化的形式，主要负责转录的延伸IIb是被蛋白酶消化而失去CTD的形式thecrystalstructureofRNApolymeraseIIfromyeast（七）真核生物基因的启动子及转录起始复合物的组装类型I启动子类型II启动子类型III启动子类型II启动子基本启动子(basalpromotor)转录起始位点(initiationsite,Inr)上游元件(upstreamelements)下游元件(downstreamelements)核心启动子(corepromotor)启动子近侧序列元件上游元件下游元件序列名称位置序列反式作用因子TATA-box

-25~–30TATAAAA

TBP作用是确定精确的转录起始位点，而不起调节转录效率的功能基本启动子(basalpromotor)序列名称位置序列

反式作用因子CCAAT-box

-75~-80GGCCAATCT

CTFC/EBPGC-box

-90GGGCGG

sp1上游元件(upstreamelements)常表现出细胞类型特异性，功能主要是提高转录的效率和特异性类型II启动子在转录起始位点周围有保守的序列，是最适表达所需要的。共同序列为PyPyANT（Py为嘧啶，N为任意碱基）转录起始位点(initiationsite,Inr)FunctionsofTFⅡXTBP：特异性地结合TATAboxTAFⅡ：多亚基，是各种转录因子的靶位点TFⅡDTBP(TATA-bindingprotein)（TATA框结合蛋白）TAFⅡ(TBP-associatedfactors)(TBP偶联因子)(8-10)X=A,B,D,E,F,H…formationofplatformFunctionsofTFⅡXTFⅡA:

激活TBP，促进TFⅡD结合于TATAboxTFⅡB:结合于TFⅡD-DNA上，确定转录起始位点，在TFⅡF协同下募集RNApolⅡTFⅡF:与RNApolⅡ结合，抑制RNApolⅡ与DNA的非特异性结合TFⅡH：ATPase,helicase，kinaseTFⅡE：促进TFⅡH的激酶活性Assemblyofpre-initiationcomplex(PIC)转录前起始复合物DABPolF复合物形成的模型聚合酶是结合在TFⅡD，A和B结合位点（TATAbox）下游的DNA上RNAPolⅡisactivatedbyCTDphosphorylationCTD磷酸化后，使CTD中羟基电荷和结构发生变化，影响它与TBP结合的稳定性，使聚合酶从启动子上脱离TFⅡDTFⅡFRNAPolⅡTFⅡHPiDNARNATFⅡBTFⅡA通用转录因子参与转录起始、启动子清除、延伸的模型a.TBP或TFⅡD，同B、F及聚合酶II形成最基本的起始复合物添加TFⅡE和H，水解ATP使DNA在起始区解链，CTD部分磷酸化，产生流产转录物，很快停止。b.随着ATP提供能量，TFⅡH使DNA进一步解螺旋并使启动子清空c.CTD进一步磷酸化,NTP不断添加,延伸复合物不断进行RNA的延伸TBP和TFⅡDB仍留在启动子上，延伸不需要TFⅡE和H，从延伸复合物解离下来FunctionsofTAFTFIID中包括至少8种TBP偶联因子,分子量为30—250kD,分别命名为TAFⅡ-30～250TAFⅡ150

识别起始子(inr)序列TAF是基因转录调控的辅助因子，为各种调控因子提供作用的靶位点它的作用是将上游调控区和远端调控区结合的转录调控因子与PIC联系在一起，而介导各种反式作用因子对基础转录的调控。来自克隆基因的产物的果蝇TFIID在体外整合的结构图果蝇、人和酵母TAFs之间的关系缺乏TATA框的启动子含有其他元件包括Inr和下游元件。TAFII250和TAFII150能结合与这些元件，因而保证了TFIID结合与启动子。或者特异性调控因子结合与上游启动子元件（UPE），这些特异性调控因子又同一个或数个TAFII相互作用，把TFIID锚定于启动子上。对缺乏TATA框启动子的起始TBP与含有TATA框或不含TATA框的启动子的相互作用模型TAFII介导各种激活因子的作用许多激活因子通过与TAFII相互作用激活起始装置NTF-1能结合于TAFII-150Sp1与TAFII-110结合真核生物基因转录受激活因子增强的模型a.最小的TBP/TAF复合物不能支持激活b.两种不同的三聚体复合物支持Gal4-NTF1的激活作用，但不能支持Sp1的激活c.包含有TAFII-100的四聚体复合物能介导Sp1的激活作用d.完整的TFIID能支持各种激活因子的作用TAFII介导各种激活因子的作用类型I启动子上游控制元件(Upstreamcontrolelement，UCE)核心启动子CorepromoterPromotertranscribedregion+1-45+20CorepromoterUCE-180-107CorepromoterUCErRNA的两个元件Tjian及其同事用接头分区突变法研究人类rRNA基因，结果显示UCE是最佳转录所必需的，但本底水平的转录不一定需要UCE的参与，而核心元件是转录所必需的Tjian及其同事用接头分区突变法研究人类rRNA基因的UCE和核心元件间插入或缺失不同长度的DNA序列，证实两个元件间的距离对转录起始也是非常重要的。两者之间插入或缺失碱基对，启动子强度将减弱，而且缺失比插入更敏感。rRNA的两个元件间的距离对启动子强度的影响UBFSL-1(Selectivityfactor1)Trans-factors(Upstreambindingfactor)UBF：能结合于UCE和CorepromoterSL-1:由TBP(TATA-bindingprotein)和3种TAFI组成SL-1本身不能结合于启动子，但能同RNApol结合SL-1：使RNApolI正确的定位在起始位点RNA聚合酶I的转录起始复合物UCECorepromoterUBFUBFRNAPOLTAFITAFITAFITBPRNA聚合酶I的转录起始复合物的装配类型III启动子基因内启动子：基因外启动子:基因内I型启动子：由被中间元件分开的A盒和C盒组成5SrRNA基因基因内II型启动子：由被中间元件分开的A盒和B盒组成tRNA基因U6snRNA基因，7SKRNA基因类似类型II启动子，有TATA框，能与含TBP的转录因子结合混合启动子：海胆硒代半胱氨酸tRNA(ser)sec基因ThreetypesofpromotersforRNApolymeraseIIIBydeletionInternalpromoterof5srRNAgene:+55~+803’端序列缺失对5SrRNA基因转录的影响a.Brown及同事对爪蟾5SrRNA基因3’端序列进行缺失，于体外进行转录。3’端序列缺失但没越过启动子序列，仍能转录，只是产物比全长rRNA短，转录事件的发生表明启动子是完整的，3’端序列缺失到启动子序列，转录终止b.只有当3’端序列缺失延伸到＋80位时，才无转录产物的合成transcriptionfactorsforRNAPolⅢInitiationfactorsAssemblyfactorsTFⅢBTFⅢATFⅢCTBP

2prRNApolⅢ的转录起始复合物的装配tRNA基因内启动子BetweenSL1、TFⅢBandTFⅡDFactorComponentsFunctionsRNAPolSL1TBP&3pr本身不结合DNA，使RNApol正确定位于起始位点ⅠTFⅢBTBP&2prⅢTFⅡDTBP&10-12pr特异性地结合TATAboxⅡ1.转录前起始复合物的装配都是由能识别启动子内特异性位点的装配因子开始的。在DNA序列上，它吸纳、招募PIC的其他组分。转录起始的一般规律3种聚合酶对不含TATAbox的启动子起始前复合物的识别模型在I,II,III类启动子上，最先结合的组装因子分别是UBF，SP1，TFIIIC，随后结合含TBP的另一因子分别是SL1，TFIID和TFIIIB。对I,III类启动子而言足以结合聚合酶起始转录，但II类启动子还需要更多的通用因子参与转录。2.TBP在所有各种已知类型的真核启动子中起组织作用3.TBP的特异性由与它偶联的TAFs控制。TBP携带有某一套TAF，它就会在形形色色启动子中结合于某一个启动子位点post-transcriptionalprocessing主要内容rRNA前体的加工(自学)tRNA前体的加工(自学)mRNA前体的加工RNA的自我剪接真核mRNA前体的剪接真核mRNA前体的选择性剪接RNA的编辑（一）rRNA前体的加工原核细胞有3种rRNA：16S、23S和5SrRNA真核细胞有4种rRNA：28S、18S、5.8S和5SrRNA三种rRNA是一个转录单位，一起转录的原核生物RNaseⅢⅢⅢⅢEE三种rRNA是一个转录单位，一起转录的真核生物4种rRNA，是两个转录单位，18S、5.8S和28SrRNA的前体是45S，是一个转录单位，5SrRNA是单独的一个转录单位。核仁是其转录、加工和装配成核糖体的场所40S亚基60S亚基核酸内切酶在两端切断，E.coliRNAaseP是5’成熟酶核酸外切酶:RNAaseD从3’端逐个切去附加的顺序3’端加上-CCA-OH核苷酸的修饰（二）tRNA前体的加工原核生物tRNA核苷酰转移酶CTP、ATP3’端加上-CCA-OH（1）甲基化如：AAm核苷酸的修饰（1）（1）（3）（2）（4）（2）还原反应如：UDHU（3）核苷内的转位反应如：Uψ（4）脱氨反应如：AI第一步:核酸内切酶切除插入序列，不需ATP；第二步:RNA连接酶连接，需要ATP。核tRNA的酶促拼接由RNA聚合酶III转录，加工与原核相似，但3’端的CCA都是后加的，还有2’-O-甲基核糖。真核生物（三）mRNA前体的加工细菌多数不用加工，转录与翻译是偶联的。也有少数多顺反子信使RNA必须由内切酶切成较小的单位，然后翻译。原核生物初始转录产物：hnRNAs（heterogeneousnuclearRNAs，核内不均一RNA），是mRNA的前体（pre-mRNA）hnRNA的物理结构是核糖核蛋白

(hnRNP

heterogeneousnuclearribonucleoproteins)真核生物mRNA前体的剪接信号内含子相同的开头和结尾5’GU…..AG3’内部有个保守的A参与形成分支剪接中间物3’剪接位点AG前有一个嘧啶复含区（PPT）鸡卵清蛋白基因及其转录、转录后加工鸡卵清蛋白基因5’端加帽子3’端加尾剪接（splicing）成熟的mRNA（四）RNA的自我剪接(Self-splicing)Ⅰ型内含子（groupⅠ

intron）的自我剪接Ⅱ型内含子（groupⅡ

intron）的自我剪接Ⅰ型内含子的自我剪接GroupⅠThestructureofgroupⅠintronsⅡ型内含子的自我剪接OP5’POH3’OPHOA2’外显子I外显子IIPOAOHOH5’POH3’OPPOAO5’POH3’P活性中心Ⅱ型内含子的二级结构及活性中心SplicingreleasesmitochondrialgroupIIintronsintheformoflariats(套索结构).Definition:

泛指具有催化功能的RNA的分子核酶（ribozyme）（五）真核mRNA前体的剪接Splicingmechanism:similartogroupⅡintronStructureofsnRNAs:similartogroupⅡintronSplicesome（剪接体）snRNAsproteinssnRNA:smallnuclearRNA(核内小分子RNA)snRNP:

smallnuclearribonucleoprotein(小分子核内核糖核蛋白):U1、U2、U4、U5、U6snRNAsnRNPshnRNAsOtherproteinsSpliceosomesareellipsoidal(椭圆形)

particleswithseveraldiscreteregions.Pre-mRNAGroupⅡMechanismofspl