第12章 分子发光分析法

2023/2/1

仪器分析王元兰主编

第12章分子发光分析法molecular

luminescence

analysis

2023/2/1第一节概述、定义被测物质处于基态的分子吸收能量（电、热、化学和光能等）被激发至激发态，然后从不稳定的激发态返回至基态并伴随有光辐射，此种现象称为分子发光。通过测量辐射光的强度对被测物质进行定量测定的分析方法称为分子发光分析法。2023/2/1、分子发光的类型：根据分子受激时所吸收的能源性质及辐射机理的不同，分子发光可分为：1.光致发光：当分子吸收了光能而被激发到较高能态，返回基态时发射出波长与激发光波长相同或不同辐射的现象。

2.荧光：分子受光能激发后，由第一电子激发单重态跃迁回到基态的任一振动能级时所发出的光辐射

3.磷光：激发态分子从第一电子激发三重态跃迁回到基态所发出的光辐射。

4.化学发光：基于某些物质在进行化学反应时，由于吸收了反应时产生的化学能而产生激发态物质，当回到基态时发出光辐射。

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5.电致发光：吸收电能之后的发光现象。

6.生物发光：若化学发光是由生物体内的生物化学反应产生的。

荧光和磷光是光致发光，是吸收受激分子处在不同类型的电子激发态时所产生的光辐射现象。两者的区别在于荧光在光照停止后几乎立即停止，而磷光寿命较长。2023/2/1三、荧光分析法

利用物质的分子吸收光所产生的荧光光谱对物质进行测定的方法。2023/2/1、荧光和磷光的产生

荧光和磷光是基于*，*n跃迁。第二节荧光和磷光分析基本原理1.分子能级与跃迁分子能级比原子能级复杂，在每个电子能级上又包含一系列振动能级和动能级，如图。2023/2/12023/2/11.单重态S（singletstate):

一个所有电子自旋都配对的分子的电子态。2.三重态T（tripletstate）:分子中电子对的电子自旋平行的电子态。单重态与三重态分子的区别：1）S态分子在磁场中不会发生能级的分裂，具有抗磁性，而T态具有顺磁性；2）电子在不同多重态间跃迁时需换向，不易发生；3）S1态的能量高于T1，S2的高于T2，且S2>T2>S1>T1>S0，T1是亚稳态；4)S态，T2

态，T1的寿命不同。2023/2/13.振动弛豫在荧光和磷光分析的溶液体系中，溶质和溶剂之间碰撞的概率很大，溶质的激发态分子可能将过剩的振动能量以热能形式将多余的能量传递给周围的溶剂分子，而自身从激发态的高振动能级失活，跃迁至同一激发态的最低振动能级，这种现象称为振动弛豫.4.内部转化和系间窜跃

内部转化（IC）：相同多重态间的无辐射去激。系间窜跃（ISC）：不同多重态间的无辐射跃迁。5.外转换外转换是指溶液中的激发态分子与溶剂分子或其他溶质分子之间相互碰撞而失去能量，并以热能的形式释放，常常发生在第一激发单重态或激发三重态的最低振动能级向基态转换的过程中。外转换常常会使荧光或磷光减弱或“猝灭”。2023/2/16.荧光发射和磷光发射处于S1或T1态的分子返回S0态时伴随发光现象的过程为辐射去激，分子从S1态的最低振动能级跃迁至S0态各个振动能级所产生的辐射光称为荧光。当受激分子降至S1的最低振动能级后，经系间窜跃至T1态，并经T1态的最低振动能级回到S0态的各振动能级所辐射的光称为磷光。2023/2/1二、激发光谱和发射光谱1.激发光谱固定荧光的发射波长（即测定波长），不断改变激发光（即入射光）波长，以所测得的改发射波长下的荧光强度对激发光波长作图，就得到荧光（磷光）化合物的激发光谱。

2.发射光谱使激发光的强度和波长固定不变（通常固定在最大激发波长处），测定不同发射波长下的荧光强度，即得到发射光谱

.2023/2/1

3.激发光谱与发射光谱的关系

①Stokes位移在溶液的荧光光谱中，荧光波长总是大于激发光的波长，这种波长移动的现象称为Stokes位移。

原因:

a.激发分子在发射荧光前，通过振动弛豫和内转换去活过程损失了部分激发能；b.辐射跃迁可能使激发分子下降到基态的不同振动能级，然后通过振动弛豫进一步损失能量；c.溶剂与激发态分子发生碰撞导致能量损失.2023/2/1②

发射光谱的形状与激发波长无关③

镜像规则

荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样）成镜像对称关系。原因：吸收光谱的形状取决于第一电子激发态的各振动能级的分布，而发射光谱的形状取决于基态各振动能级的分布。而基态和第一激发态的各振动能级分布极为相似。2023/2/1三、荧光效率1.分子产生荧光必须具备的条件（1）具有合适的结构，能吸收激发光；（2）吸收了与其本身特征频率相同的能量后，具有一定的荧光量子产率。2.荧光效率(荧光量子产率)是指荧光物质吸收光后发射出的荧光光量子数与其所吸收激发光光量子数之比.荧光效率越高，辐射跃迁概率就越大，物质发射的荧光也就越强。2023/2/1四、荧光与分子结构的关系强荧光分子都具有大的共轭π键结构、给电子取代基和刚性平面结构等，而饱和的化合物及只有孤立双建的化合物，不呈现显著的荧光。1.共轭π键体系发荧光的物质分子中必须含有共轭双键这样的强吸收基团，且共轭体系越大，π电子的离域性越强，越易被激发而产生荧光。大多数能发射荧光的物质为含芳香环或杂环的化合物。随共轭芳环增大，荧光效率提高，且荧光光谱向长波长方向移动。2023/2/12.刚性平面结构具有刚性平面结构的有机分子具有较强的荧光。由于它们与溶剂或其他溶质分子的相互作用比较小，通过碰撞去活的可能性较小，有利于荧光的发射。3.取代基效应芳香化合物的芳香环上的取代基不同，则物质的荧光光谱和荧光强度不同。通常，给电子取代基如—OH、—NH2、—NR2和—OR等可使共轭体系增大，导致荧光增强。而吸电子取代基，如—COOH、—NO、—NO2、卤素离子等，将减弱甚至会猝灭荧光。4.电子跃迁类型电子跃迁为型，荧光很弱或不发荧光.

类型的跃迁,

发生荧光辐射强.2023/2/1五、影响荧光强度的因素

1.溶剂的影响

除一般溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、配位键的形成都将使化合物的荧光发生变化；2.温度的影响荧光强度对温度变化敏感，温度增加，外转换去活的几率增加。3.溶液pH

对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制；2023/2/14.内滤光作用和自吸现象

自吸现象：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收光谱的长波长端重叠，产生自吸收；如蒽化合物。内滤光作用：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射的荧光，如色胺酸中的重铬酸钾；2023/2/15.溶液荧光的猝灭碰撞猝灭；氧的熄灭作用等。第三节荧光和磷光分析仪

2023/2/1一、荧光分析仪器利用荧光进行物质定性定量分析的仪器有荧光计和荧光分光光度计，由激发光源、单色器、样品池、检测器和信号记录系统五部分组成。荧光分析仪器有两个单色器，一个是激发单色器，置于样品池前，用于获得单色性较好的激发光；另一个是发射单色器，置于样品池和检测器之间，用于分出某一波长的荧光，消除其它杂散光干扰。2023/2/11.光源常用的光源是高压汞灯和氙弧灯。2.单色器采用光栅作为单色器。3.样品池用低荧光的石英材料制成，其形状是四面透光的方形。4.检测器检测器位置与激发光成直角。荧光计采用光电管作检测器，荧光分光光度计采用光电倍增管（PMT）作为检测器。2023/2/1二、磷光分析仪器由激发光源、单色器、样品池、检测器和信号记录系统五部分组成。1.样品室测定低温磷光一般在液氮温度(77K)下进行，盛放试液的样品池需放置在盛液氮的杜瓦瓶内。固体表面室温磷光分析则需特制的样品室。2.磷光镜有些物质既产生荧光，又能产生磷光。为了在有荧光现象的体系中测定磷光，常采用一种叫磷光镜的机械切光装置，利用荧光与磷光寿命的差异消除荧光干扰。

第四节荧光分析法和磷光分析法的特点与应用

2023/2/1一、荧光和磷光分析法的特点1.荧光分析方法的优点

(1)灵敏度高

(2)选择性强

(3)提供比较多的物理参数2.磷光分析方法的特点（1）磷光辐射的波长比荧光长（2）磷光的寿命比荧光长二、荧光分析法和磷光分析法的应用

2023/2/11.荧光分析法的应用很多无机离子能与具有π电子共轭结构的有机化合物形成荧光配合物，故可用荧光法测定。目前采用有机试剂进行荧光分析的元素已近70种，其中较常采用荧光法测定的元素有铍、铝、硼、镓、硒、镁、锌、镉及某些稀土元素等。2.磷光分析法的应用磷光分析法在药物分析、临床分析及环境分析领域得到了一定的应用。它与荧光法互相补充，已成为痕量有机物分析的重要手段。

3.联用技术的检测器第五节化学发光分析法

2023/2/1吸收化学能使分子发光的过程称为化学发光。化学发光分析是利用某些化学反应所产生的光发射现象而建立的一种分析方法。一、概述该方法已经广泛应用于生物科学、食品科学、药物检测、环境监测、农林科研等领域，可以测定数十种元素、大量无机物质和有机化合物。2023/2/1二、基本原理principle1.化学发光反应

在化学反应过程中，某些化合物接受能量而被激发，从激发态返回基态时，发射出一定波长的光。

A+B=C+D*D*→D+h（1）能够发光的化合物大多为有机化合物，芳香族化合物；（2）化学发光反应多为氧化还原反应，激发能与反应能相当E=170～300kJ/mol；位于可见光区；（3）发光持续时间较长，反应持续进行；化学发光反应存在于生物体(萤火虫、海洋发光生物)中，称生物发光(bioluminescence)。2023/2/12.化学发光效率化学效率：发光效率：时刻t的化学发光强度(单位时间发射的光量子数)：dc/dt分析物参加反应的速率；2023/2/13.化学发光强度与化学发光分析的依据在化学发光分析中，被分析物相对于发光试剂小得多，对于一级动力学反应：

dc/dt=Kc；K为反应速率常数。定性依据：（1）在一定条件下，峰值光强度与被测物浓度成线性；（2）在一定条件下，曲线下面积为发光总强度(S)，其与被测物浓度成线性：2023/2/14.化学发光反应的类型（1）气相化学发光反应a.一氧化氮与O3的发光反应

NO+O3→NO2*NO2*→NO2+h发射的光谱范围：600～875nm，灵敏度1ng/cm-3；b.氧原子与SO2、NO、CO的发光反应

O3

→O2+O（1000C石英管中进行）

SO2+O+O→SO2*+O2

SO2*→SO2*+h最大发射波长：200nm；灵敏度1ng/cm-3；2023/2/1O3

→O2+O（1000C石英管中进行）

NO+O→NO2*

NO2*→NO2+h发射光谱范围：400～1400nm；灵敏度1ng/cm-3；氧原子与CO的发光反应：

CO+O→CO2*

CO2*→CO2+h发射光谱范围：300～500nm；灵敏度1ng/cm-3；

氧原子与NO的发光反应：2023/2/1c.乙烯与O3的发光反应

乙烯与O3反应，生成激发态乙醛：

CH2O*→CH2O+h最大发射波长：435nm；对O3的特效反应；线性响应范围1ng/cm-3～1g/cm-3；2023/2/1（2）火焰中的化学发光反应

在富氢火焰中，也存在着很强的化学发光反应；a.一氧化氮NO+H→HNO*

HNO

*→HNO+h发射光谱范围：660～770nm；

最大发射波长：690nm；

在富氢火焰中：

NO2+2H→NO+H2O该反应十分迅速；2023/2/1b.硫化物挥发性硫化物SO2、H2S、CH3SH、CH3SCH3等在富氢火焰中燃烧，产生很强的化学发光（蓝色）：SO2+2H2→S+2H2OS+S→2S2*

S2*→S2+h发射光谱范围：350～460nm；

最大发射波长：394nm；灵敏度：0.2ng/cm-3；

发射光强度与硫化物浓度的平方成正比。2023/2/1（3）液相中的化学发光反应

机理研究较多，在分析中应用最多；可测痕量的H2O2、Cu、Mn、Co、V、Fe、Cr、Ce、Hg、Th等。应用最多的发光试剂：鲁米诺（3-氨基苯二甲酰肼）；化学发光反应效率：0.15～0.05；鲁米诺在碱性溶液中与双氧水的反应过程：

该发光反应速度慢，某些金属离子可催化反应；利用这一现象可测定这些金属离子。2023/2/15.化学与生物发光分析的应用（1）该发光反应速度慢，某些金属离子可催化反应；利用这一现象可间接测定这些金属离子。可测痕量的Cu2+、Mn2+、Co2+、V4+、Fe2+、Fe3+、Ni2+、Ag+、Au3+、Hg2+等（2）可检测低至10-9mol/L的H2O2；（3）间接测定某些生物试样

氨基酸+O2

酮酸+NH3+H2O2氨基酸氧化酶葡萄糖+O2+H2O葡萄糖酸+H2O2通过测定生成的H2O2，确定氨基酸、葡萄糖含量。葡萄糖氧化酶2023/2/1

草酸二酯(能量提供体)+高浓度双氧水+稠环芳烃(能量接受体)+金属离子+溶剂组成的反应体系，可发出很强的可见光，发光效率高，使用不同的稠环芳烃，发射出不同颜色的光(冷光源)。2023/2/1生物发光分析应用1

在pH7～8；荧光素酶(E)和Mg2+的存在下，荧光素(LH2)与磷酸三腺甙(ATP)的反应，生成磷酸腺甙(AMP)荧光素和荧光素酸的复合物和镁的焦磷酸盐(ppi)：

ATP+LH2+E+Mg2+

AMP·LH2·E+Mgppi+2H+pH7-8复合物与氧反应，产生化学发