第10章 紫外可见分光光度法

第10章

紫外-可见分光光度法河北医科大学药学院李珺沬

Tel/p>

E-mail:smile0315@126.com10.1基本原理10.2紫外-可见吸收光谱和分子结构的关系10.3紫外-可见分光光度计10.4定性和定量分析方法10.5有机化合物分子结构研究简介光谱发展简史1665年，牛顿，揭示太阳光是复合光1802年，渥拉斯登，发现太阳光谱中的暗线1815年，夫琅和费，发现“夫琅和费”线1859年，本生、基尔霍夫，物质发射光波长与吸收光波长一致密勒，将光谱图由可见光区扩展到紫外光区概述远紫外近紫外可见近红外中红外

远红外（真空紫外）10nm~200nm200nm~380nm380nm~780nm780nm~2.5m2.5m~5.0m5.0m~1000m1.定义：研究物质在紫外-可见光区分子吸收光谱的分

析方法。（电子光谱）灵敏度：10-4~10-6g/mL准确度：0.5%2.应用：定性：鉴别不同官能团和化学结构不同的化合物；鉴别结构相似的不同化合物。定量：单一组分的测定；多种混合组分不经分离进行同时测定。10.1基本原理

10.1.1紫外-可见吸收光谱的产生及特征

1吸收峰：曲线上吸收最强的部位→最大吸收波（λmax）谷：峰与峰之间吸收最弱的部位→最小吸收波（λmin）肩峰：在吸收峰斜坡上的折点。末端吸收：在图谱短波端只呈现强吸收而不成峰形的部位。强带：εmax>104的吸收峰。弱带：εmax<102的吸收峰。生色团与助色团生色团：有机化合物分子结构中含有重键，能在紫外-可见光范围内产生吸收的原子基团。简单的生色团由双键或叁键体系组成，如C＝C、C＝O、—NO2、偶氮基—N＝N—、乙炔基C≡C、腈基—C≡N、—C＝S等。

助色团：有一些含有非键电子的杂原子饱和基团(如—OH、—OR、—NH２、—NHR、—X、—SR等)，它们本身没有生色功能(不能吸收λ>200nm的光)，但当它们与生色团或饱和烃相连时，能使该生色团或饱和烃的吸收峰向长波方向移动，并使吸收强度增加，这样的基团称为助色团。红移与蓝移由于化合物结构的改变或受溶剂的影响，使吸收峰向长波方向移动称为红移（长移），向短波方向移动称为蓝移(紫移)（短移）。增色效应与减色效应由于化合物结构改变或其他原因，使吸收强度增加，称为增（浓）色效应，使吸收强度减小称为减（淡）色效应。

10.1.2Lambert-Beer定律(光吸收定律)吸光光度法的理论依据研究光吸收的最基本定律布格(Bouguer1729年)朗伯（1760年）定律：光吸收与溶液层厚度成正比比尔（1852年）定律：光吸收与溶液浓度成正比二者的结合称为朗伯-比耳定律

1.Lambert-Beer定律：当一束平行单色光垂直照射到样品溶液时，溶液的吸光度与溶液的浓度及光程（溶液的厚度）成正比关系。

数学表达：A＝-lgT=Ecl

A：吸光度，T：透光率，l：吸收池厚度，

c：溶液浓度，E：吸光系数注意：平行单色光均相介质无发射、散射或光化学反应A=cl:摩尔吸光系数A=Eclc:mol/Lc:g/100mlA=cl

:百分吸光系数摩尔吸光系数ε的讨论吸收物质在一定波长和溶剂条件下的特征常数；不随浓度c和光程长度l的改变而改变。在温度和波长等条件一定时，ε仅与吸收物质本身的性质有关，与待测物浓度无关；可作为定性鉴定的参数；同一吸收物质在不同波长下的ε值不同。在最大吸收波长λmax处的摩尔吸光系数，常以εmax表示。

εmax表明了该吸收物质最大限度的吸光能力，也反映了光度法测定该物质可能达到的最大灵敏度。εmax越大，表明该物质的吸光能力越强，用光度法测定该物质的灵敏度越高。

ε=104~105：强吸收；ε<102

：弱吸收。Lambert-Beer定律吸光光度法的理论基础和定量测定的依据，应用于各种光度法的吸收测量。Lambert-Beer定律的加合性A=Aa+Ab+Ac+……10.1.3偏离Beer定律的因素标准曲线法测定未知溶液的浓度时，发现：标准曲线常发生弯曲（尤其当溶液浓度较高时），这种现象称为对Lambert-Beer定律的偏离。1.化学因素Lambert-Beer定律的假定：所有的吸光质点之间不发生相互作用；假定只有在稀溶液(c<10-2mol/L)时才基本符合。当溶液浓度c>10－2mol/L时，吸光质点间可能发生缔合等相互作用，直接影响了对光的吸收。故：Lambert-Beer定律只适用于稀溶液溶液中存在离解、缔合、互变异构、配合物形成等，使吸光质点的浓度发生变化，影响吸光度。例：铬酸盐或重铬酸盐溶液中存在下列平衡：

CrＯ42-+2H＋

=Cr2Ｏ72-+H2Ｏ溶液中CrＯ42-、Cr2Ｏ72-的颜色不同，吸光性质也不相同。故：此时溶液pH对测定有重要影响。2.光学因素(1)非单色光E1=E2→A=EclE1<E2→吸光度增加→正偏差E1>E2→吸光度降低→负偏差谱带宽度(2)杂散光不在谱带宽度范围内(3)散射光和反射光

谱带宽度范围内散射光：真溶液→空白对比补偿浑浊溶液→A偏高反射光→A偏高(4)非平行光→A偏高3.透光率的测量误差（1）暗噪声光电检测器或热检测器与放大电路等各部件的不确定性引起。（2）信号（散粒）噪声分子轨道理论：一个成键轨道必定有一个相应的反键轨道。通常外层电子均处于分子轨道的基态，即成键轨道或非键轨道上。10.2紫外-可见吸收光谱和分子结构的关系10.2.1电子的跃迁类型跃迁类型有机化合物的紫外-可见吸收光谱，是其分子中外层价电子跃迁的结果：σ电子、π电子、n（p）电子。轨道：电子围绕分子或原子运动的概率分布。分子轨道：当两个原子靠近而结合成分子时，两个原子的原子轨道线性组合生成两个分子轨道。一个分子轨道具有低能量——成键轨道一个分子轨道具有高能量——反键轨道分子中n电子的能级，基本上保持原来原子状态的能级——非键轨道（比成键轨道能级高，比反键轨道能级低）

当外层电子吸收紫外或可见辐射后，就从基态向激发态(反键轨道)跃迁。有机化合物：σ→σ＊、π→π＊、n→σ＊、n→π＊、电荷迁移跃迁。无机化合物：电荷迁移跃迁、配位场跃迁。（1）σ→σ＊跃迁处于σ成键轨道上的电子吸收光能后跃迁到σ＊反键轨道。

所需能量最大吸收光谱位于远紫外区(λ<150nm，真空紫外分光光度计检测)。例如：甲烷：λmax125nm，乙烷：λmax135nm。（2）π→π＊跃迁处于π成键轨道上的电子吸收光能后跃迁到π＊反键轨道。所需能量较小吸收光谱处于远紫外区的近紫外端或近紫外区强吸收，摩尔吸光系数ε>104例如：不饱和烃、共轭烯烃和芳香烃类。乙烯：λmax165nm，ε>104。共轭向长波移动：丁二烯：λmax217nm，ε=21000

（3）n→π＊跃迁含有杂原子不饱和基团的化合物，其非键轨道中孤对电子吸收能量后，向π＊反键轨道跃迁。所需能量最低吸收波长：200~400nm弱吸收，ε=

10～100分子中孤对电子和π键同时存在时发生n→π＊跃迁例如：丙酮：λmax为279nm，ε=

22（溶剂环己烷)。（4）n→σ＊跃迁含N、O、S和卤素等杂原子基团化合物，其杂原子中孤对电子吸收能量后向σ＊反键轨道跃迁。所需能量较大吸收光谱大部分在远紫外区，近紫外区仍不易观察（吸收波长为~200nm）例如：一氯甲烷：λmax173nm，甲醇：λmax183nm，三甲基胺：λmax227nm。10.2.2吸收带及其与分子结构的关系R带由n→π＊跃迁引起的吸收带，是杂原子不饱和基团生色团的特征。n*跃迁引起C=O、—NO2、—NO、—N=N—λ~300nm弱带（

<100），浓溶液极性溶剂，吸收峰短移K带相当于共轭双键中π→π＊跃迁所产生的吸收峰。*跃迁引起强带（

>104）随共轭系统延长，*跃迁的吸收带向长波方向移动，吸收强度增强B带芳香族（包括杂芳香族）化合物特征吸收带。*跃迁引起λ~256nm

~200在气态或非极性溶剂中，苯及其许多同系物的B谱具有精细结构（多重吸收带）原因：振动跃迁在基态电子上的跃迁上的叠加蒸气：孤立分子震动、转动能级溶液：部分振动能力极性溶剂：不表现振动光谱，精细结构消失E带芳香族（包括杂芳香族）化合物特征吸收带。*跃迁引起E1带出现在180nm（=4.7×104）E2带出现在200nm（

=7.0×105）当苯环上有取代基时，苯的三个特征谱带都会发生显著的变化，其中影响较大的是E2带和B带。10.2.3影响吸收带的因素位阻影响（1）结构因素异构现象跨环效应在有些β-、γ-不饱和酮中，虽然双键与酮基不产生共轭体系，但适当地立体排列，使羰基氧的孤电子对和双键的电子发生作用，以致使相当于n→π＊跃迁的R吸收带向上波移动。同时其吸收强度增强。基团的π轨道与一个杂原子的p轨道有效交叠时，也会出现跨环效应（2）溶剂效应改变溶剂极性，引起吸收带形状的变化。非极性→极性，精细结构消失，吸收带变向平滑。改变溶剂极性，吸收带的最大吸收波长发生变化。

非极性→极性，π→π＊跃迁：长波移动；

n→π＊跃迁：短波移动。溶剂选择：（1）溶剂应能很好地溶解被测试样，溶剂对溶质应该是惰性的。即所成溶液应具有良好的化学和光化学稳定性。（2）在溶解度允许的范围内，尽量选择极性较小的溶剂。（3）溶剂在样品的吸收光谱区应无明显吸收。（3）pH的影响酸性、中性、碱性都有明显影响10.3

紫外-可见分光光度计0.XXX光源单色器吸收池检测器信号处理及显示器I0It参比样品未考虑吸收池和溶剂对光子的作用注意比较

A=lg(I0/It)＝lg(1/T)10.3.1主要部件1.光源

发出所需波长范围内的连续光谱，有足够的光强度，稳定，发光面积小，连续光谱。紫外区：氢灯，氘灯可见区：钨灯，卤钨灯光源波长范围(nm)适用于氢灯185~375紫外氘灯185~400紫外钨灯320~2500可见，近红外卤钨灯250~2000紫外，可见，近红外氙灯180~1000紫外、可见（荧光）能斯特灯1000~3500红外空心阴极灯特有原子光谱激光光源特有各种谱学手段氙灯氢灯钨灯2.单色器将光源发出的连续光谱按波长顺序色散，并从中分离出一定宽度谱带的装置。

①进口狭缝：光源的光由此进入单色器；②准直镜：透镜或返射镜使入射光成为平行光束；③色散元件：将复合光分解成单色光；棱镜或光栅；④聚焦透镜：透镜或凹面反射镜，将分光后所得单色光聚焦至出射狭缝；⑤出口狭缝。棱镜：玻璃350～3200nm，石英185～4000nm光栅：波长范围宽，色散均匀，分辨性能好，使用方便3.吸收池（比色皿）厚度(光程)：0.5,1,2,3,5…cm材质：光学玻璃吸收池——可见光区熔融石英吸收池——可见、紫外光区匹配4.检测器10.3.2光学性能与类型1.光学性能波长范围：195~820nm波长准确度：显示值与实际值之间的误差≤±0.5nm波长重现（复）性：≤0.5nm透光率测量范围：0~150%（T）吸光度测量范围：-0.1730~+2.00（A）光度准确度：透光率满量程误差≤±0.5%光度重复性：重复测量透光率的变动性≤±0.5%分辨率：单色器分辨两条靠近的谱线的能力。杂散光：以测光信号较弱的波长处所含杂散光强度百分比为指标。如：220nm处NaI≤±0.5%2.基本的光路类型（1）单光束分光光度计简单，价廉，适于在给定波长处测量吸光度或透光度，一般不能作全波段光谱扫描，要求光源和检测器具有很高的稳定性。（2）双光束分光光度计自动记录，快速全波段扫描。可消除光源不稳定、检测器灵敏度变化等因素的影响，特别适合于结构分析。仪器复杂，价格较高。（3）二极管阵列检测分光光度计由光源发出，色差聚光镜聚焦后的多色光通过样品池，再聚焦于多色仪的入口狭缝上。透过光经全息栅表面色散并投射到二极管阵列检测二极管阵列的电子系统。

紫外-可见分光光度计补充：分光光度计的校正1.波长的校正F线（486.13nm）C线（656.28nm）可见光区紫外光区：苯蒸气2.吸光度的校正硫酸铜、硫酸钴铵、铬酸钾标准溶液3.吸收池的校正A:试样溶液；B:参比溶液A:参比溶液；B:试样溶液△A<1%AB10.4定性和定量分析方法10.4.1定性鉴别和纯度检测

定性鉴别的依据→吸收光谱的特征吸收光谱的形状吸收峰的数目吸收峰的位置（波长）吸收峰的强度相应的吸光系数1.定性鉴别（1）对比吸收光谱特征数据

（2）对比吸光度（或吸光系数）的比值

例：VB12（3）对比吸收光谱的一致性

将试样与已知标准品配成相同浓度的溶液，在同一条件下分别描绘吸收光谱，核对其一致性。10.4.2纯度检测化合物无吸收，杂质有较强吸收，少量杂质可被检测化合物有强吸收，杂质弱吸收或无吸收，化合物吸光系数降低杂质吸收强于化合物吸收，吸光系数增大杂质有吸收，可使化合物吸收光谱变形（1）杂质检查（2）杂质的限量检测通常用峰谷吸收度的比值控制杂质限量10.4.2单组分样品的定量方法选择吸收峰处，提高灵敏度，减少测量误差选择无其他物质干扰，较高的吸收峰不选择末端吸收溶剂不干扰被测组分的测定组分测定波长大于溶剂的截止波长1.吸光系数法2.标准曲线法配制一系列浓度不同的标准溶液，在测定条件相同条件下，分别测定吸光度，以标准溶液浓度为横坐标，相应吸光度为纵坐标，绘制A-c

关系图。在相同条件下，测出样品溶液吸光度，从标准曲线中查出样品溶液的浓度。例如：芦丁含量测定0.710mg/25mL3.对照法10.4.3计算分光光度法简介测量依据——吸光度的加和性：两组分吸收光谱不重叠（互不干扰）

在处测定组分a,在处测组分b两组分吸收光谱部分重叠

：测A1→b组分不干扰→可按单组分定量测两组分吸收光谱完全重叠——混合样品测定1.解线性方程组法过程：2.双波长法3.导数光谱法10.4.4光电比色法1.显色反应及其条件显色反应：在可见分光光度法中，将试样组分转变成有色化合物的化学反应。显色剂：与被测组分化合生成有色物质的试剂。

1）显色反应的要求：①被测物与生成有色物有确定的定量关系；②反应产物有足够稳定性；③反应产物与试剂颜色有明显差别④反应产物摩尔吸光系数足够大，灵敏度高；⑤选择性好。2）反应条件的影响①溶剂与试剂用量、性质吸光度A与显色剂用量cR的关系会出现如图所示的几种情况。选择曲线变化平坦处。②酸碱度在相同实验条件下，分别测定不同pH值条件下显色溶液的吸光度。选择曲线中吸光度较大且恒定的平坦区所对应的pH范围。缓冲溶液保持溶液pH③时间实验确定④温度及其他3）反应条件的控制2.测定方法各种类型的紫外可见分光光度计和相应的各种测定方法。10.5有机化合物分子结构研究简介10.5.1有机化合物的紫外吸收光谱1.饱和碳氢化合物只能产生σ→σ*跃迁，吸收峰在真空紫外区2.含孤立助色团和生色团的饱和有机化合物当饱和单键碳氢化合物中的氢原子被氧、氮、卤素、硫等杂原子取代时，产生n→σ*跃迁、吸收峰向长波方向移动。通过共轭作用，形成大π键，吸收峰向长波方向移动(红移)，吸收强度也明显增加。3.共轭烯烃均含有羰基，存在n、σ、π三种电子，能实现n→π*跃迁(270～300nm，ε=10~20)，n→σ*跃迁(180nm左右)和π→π*跃迁(150nm左右)。

4.α，β-不饱和羰基化合物α,β不饱和醛酮：

乙烯基π→π*跃迁吸收带红移至220～260nm，ε=104左右；羰基R带红移至310～350nm，ε＜1005.芳香族化合物(1)苯和取代苯苯：E1、E2、B吸收带：π→π*跃迁极性溶剂中，B带