综合实验设计 水稻转化

生物学综合实验技术水稻愈伤组织诱导及转GUS基因的鉴定一、实验目的及要求：通过农杆菌法将带有报告基因的农杆菌转入烟草中，诱导获得转基因植株。了解农杆菌转化植物的原理，掌握农杆菌的培养和侵染植物的方法。二、实验原理

农杆菌重组子中携带经改造的Ti质粒（含有帮助T-DNA跳到植物染色体上的Vir区）和包含T-DNA的双元载体pBinGUS，质粒pBinGUS上T-DNA上插入了报告基因（GUS）和卡那霉素筛选标记基因NPTII。转化是通过诱导形成愈伤组织，侵染时农杆菌吸附于植物的表面伤口部位，受伤后双子叶植物分泌的酚类化合物透过农杆菌的细胞膜，活化vir区基因，vir区基因的活化，促使T-DNA进行加工和转移。T-DNA进入植物细胞后整合到核DNA上。共培养可使T-DNA上携带的编码抗生素的抗性基因得到表达，因此，转化了的水稻外植体可在含有相应抗生素的培养基上生长。植物基因转化受体系统指用于转化的外植体通过组织培养途径或其他非组织培养途径，能高效、稳定地再生无性系，并能接受外源DNA整合，对转化选择抗生素敏感的再生系统。具备条件：（1）高效稳定的再生能力（2）较高的遗传稳定性（3）具有稳定的外植体来源（4）对选择性抗生素敏感（5）对农杆菌侵染有敏感性图4：农杆菌介导水稻遗传转化A.水稻愈伤与农杆菌共培养B.选择C.分化D.生根E.炼苗和移栽农杆菌介导水稻的遗传转化gus基因简介gus基因是目前常用的一种报告基因，是β－D－葡萄糖苷酸酶(gus)基因，其表达产物β-葡萄糖苷酸酶(GUS)能催化裂解一系列的β－葡萄糖苷酸

，它可以将5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸酯（X－Gluc）分解为蓝色的物质,也可以将4-甲基-伞形花酮-β-D-葡萄糖苷酯(4-MUG)分解为蓝色物质。其检测方法简单、快速、灵敏、稳定，且背景活性低。gus基因的最大优点是它能测定外源基因表达的具体细胞和组织部位，这是其它报告基因所不能及的。三、实验方案与步骤Ⅰ水稻愈伤组织诱导Ⅱ农杆菌感受态细胞的制备与转化Ⅲ水稻的农杆菌介导遗传转化Ⅳ水稻抗性愈伤组织的筛选与分化ⅤGUS基因的染色Ⅰ水稻愈伤组织诱导1.水稻种子消毒：在超净工作台上，取大概40粒去壳、胚完整的水稻种子放入50mL无菌三角瓶中，用无菌水洗一遍之后倒掉无菌水，再倒入75%酒精之后，摇瓶30-60s，用无菌水再洗一遍后倒掉无菌水，倒入2%NaClO，不时搅拌，30min。然后用无菌水洗3次，每次摇瓶1min，倒掉无菌水，将种子放入带无菌滤纸的培养皿中，分开排布，吸干。2.水稻种子接种与观察将吸干的种子接入YN培养基，注意使胚朝上。每瓶接10粒，每小组5瓶。写上日期、接种人、放入培养室25℃暗培养。1周后调查计算污染率，2周后调查计算愈伤组织诱导率。污染率=污染种子数/总种子数×100%愈伤组织诱导率=出愈伤种子数/总种子数×100%3.水稻愈伤组织的继代培养在超净工作台上打开培养皿，用镊子挑取自然分裂的胚性愈伤组织（淡黄色，致密呈球状），置入YYN培养基中，在28℃光照培养箱，继代培养1周。（如不马上用于转化，需转移至暗处，于25℃继续培养1周）Ⅱ农杆菌感受态细胞的制备与转化挑取根癌农杆菌LBA4404单菌落于3mL的YEB液体培养基（含Rif50mg·L-1）中，28℃振荡培养过夜；取过夜培养菌液1mL接种于50mLYEB（Rif50mg·L-1）液体培养基中，28℃振荡培养至OD600为0.5；取2mL菌液，13000rpm，离心30s,弃上清；加入1000µL20mMCaCl2，使农杆菌细胞充分悬浮，冰浴30min；13000rpm，离心30s，弃上清，置于冰上，加入500µL预冷的20mMCaCl2，充分悬浮细胞，冰浴中保存，24h内使用，或液氮中速冻1min，置-70℃保存备用。在200µL感受态细胞中加入2-6µLpCAMBIA1301质粒DNA，冰浴5min，液氮中速冻5min；迅速转入37℃水浴中，热激5min；加入1mLYEB液体培养基，28℃慢速振荡培养2－4h；3000rpm离心4min，去一部分上清，留取200µL菌液涂布于含有50µg·mL-1Kan和50µg·mL-1Rif的YEB平板；放置约0.5h，待水份干后，28℃培养约24h至长出菌落。Ⅲ水稻的农杆菌介导遗传转化在侵染前三天挑取含有GUS基因的农杆菌接种到3mLLB液体培养基中（25mg·L-1链霉素和50mg·L-1卡那霉素），28℃、200rpm培养至对数晚期(18-24h)。利用分光光度计测量菌液OD600值大约在0.6左右将1中获得的菌液按1：100接种到50mL新鲜的NGN液体培养基中（25mg·L-1链霉素和50mg·L-1卡那霉素），28℃、200rpm培养至OD值为0.5左右（大约5-6h）。把50mL菌液转入2个50mL离心管中，4℃、4000g10min，弃上清，加等体积的NGNM+AS培养基重悬菌体。准备NGN溶液：向50mL离心管中加入40mLNGN,注意：取800µL溶液滴加在GN培养基滤纸上（培养基上铺一层干净滤纸）。将水稻愈伤组织浸入准备好的农杆菌中，侵染20min，期间要缓慢摇动。将浸染后的菌液倒出废液缸，用灭菌过的针管或枪头把残余的菌液吸净，再用滤纸把愈伤组织吸干，置于准备好的GN培养基上。22℃黑暗培养2d。Ⅳ水稻抗性愈伤组织的筛选与分化将共培养的水稻愈伤组织用无菌水洗涤6次，用无菌水+羧卞（500mg·L-1）洗涤2次（洗涤时要不停的摇晃50mL离心管，每洗涤一次用针管把无菌水吸出），用无菌纸吸干后置于工作台吹30min。将水稻愈伤组织置于N6D2S固体筛选培养基上，26℃黑暗培养，每2周继代一次，筛选4周。经2次筛选生长旺盛的抗性水稻愈伤组织转至XFM再生培养基上，分化培养4周以上，每两周继代一次。将经过分化培养的水稻分化苗转至GM培养基上，于三角瓶中生根壮苗。待水稻幼苗长至10cm左右，打开封口膜，炼苗2-3d，将水稻再生苗转至盆钵中。ⅤGUS基因的染色挑取5块抗性愈伤组织或5个抗性苗叶片与非转化的对照放入7mL离心管，加入2mLGUS染色液，然后37℃水浴8h以上观察水稻愈伤组织或者叶片的颜色，是否有蓝色的斑点出现。染色后的愈伤组织或叶片在离心管中70%酒精脱色24h。体式显微镜下观察水稻转基因和非转基因组织的颜色，拍照并比较其异同。实验操作及实验报告要求（一）实验操作要求1．实验课前预习实验内容，熟悉实验目的、实验原理、操作步骤以及实验注意事项。2．实验过程中严谨操作、仔细观察、认真实验并进行实验记录。3．准确认真完整清楚记录实验现象、实验结果和数据。4．必须掌握操作步骤和实验流程后才能进行实验。（二）实验报告要求1．实验报告严格按照如下格式和内容书写。实验名称实验人、学号、实验日期实验目的实验原理实验材料方法和步骤实验结果（需照相机拍照）结果讨论和结论

实验思考题2．在写实验报告时，实验目的和原理应按照该次实验内容和实验步骤写出，要明确具体、有针对性。实验材料包括实验所用的实验植物或组织、重要的实验试剂和仪器设备。实验结果中应包括全部实验过程中观察到的现象、实验结果和实验数据。实验数据中的图表要有图名和表名，图名位于图下方，表名位于表格上方。图表需大小合适、标注清楚。图表内容和所包含