酶的定向分子进化

酶的定向分子进化酶的定向分子进化简介定向进化常用方法易错PCR例子酶的定向分子进化简介酶分子的定向进化是指不需事先了解酶的空间结构和催化机制，而是人为地创造特殊的进化条件，模拟自然进化机制，在体外对酶基因进行改造，并定向筛选、获得具有某些预期特征的进化酶。主要包括：随机突变、构建突变基因文库、定向选择。单一/一组基因多样性文库多样性文库筛选功能基因非功能基因目的基因反复进行该进化策略有以下三个显著特征：A.进化的每一关键步骤都受到严密控制B.可引入一个全新的功能，来执行从不被生物体所要求的反应，甚至为生物体策划一个新的代谢途径C.能从进化结果中探索蛋白质结构和功能不需要了解酶的空间结构和催化机制设计难度小优点变异量大周期短1.易错PCR易错PCR是指通过改变PCR的反应条件，如：调整反应体系中4种dNTP的浓度、增加Mg+的浓度、加入Mn2+或使用低保真度的Taq酶等，使碱基在一定程度上随机错配而引入多点突变，构建突变库，筛选出所需的突变体。该方法关键在于选择适当的突变频率，一般为每个基因2-5个碱基替换。另外，迭代错误倾向PCR可使小的有益突变累积而产生大的提高。尽管这种方法已有不少成功的例子。但毕竟遗传变化只发生在单一分子内部，属于无性PCR进化范畴。2.DNAshufflingDNAshuffling由美国Stemmer于1994年首次提出，该法是对一组基因群体（进化上相关的DNA序列或曾筛选出的性能改进序列）进行重组创造新基因的方法。当DNAshuffling用来重组一套进化上相关的基因时，又被称为familyshuffling，例如：shuffling4种头孢菌素酶基因，酶活增加了270-540倍，而单基因shuffling只增加了8倍。3.StEP重组交错延伸重组（StEP）重组是一种简化的DNAshuffling技术。其原理是在PCR样反应中，将含不同点突变的模板混合；随之进行多轮变性、短暂复性／延伸反应，在每一轮PCR循环中，那些部分延伸的片段可以随机地杂交到含不同突变的模板上继续延伸，由于模板转换而实现不同模板间的重组，这样重复直到获得全长基因片段，重组的程度可以通过调整反应时间和温度来控制。第一次退火、延伸第二次退火、延伸4.随机引物体外重组法随机引物体外重组法(RPR)是用一套随机序列引物，产生互补于模板不同位置的短DNA片段库由于碱基错配，这些短DNA片段也含有少量的点突变），然后进行类似于DNAshuffling的全长基因装配反应，获得多样性文库。与DNAshuffling相比，RPR具有以下优点：a.可用单链DNA或mRNA为模板，且对模板量要求少。b.克服了DNAshuffling中DNase所具有的序列偏爱性，保证了子代全长基因中突变和交叉的随机性。c.片段组装体系与片段合成体系缓冲系统可兼容，组装前无需纯化操作。d.随机引发DNA合成不受模板DNA长度的限制，便利了小肽的改造。5.过渡模板随机嵌合生长过度模板随机嵌合生长技术是与DNAshuffing概念上明显不同，改进的基因家族重组技术。它不包括热循环、链转移或交错延伸反应，而是将随机切割片段的基因段杂交到一个临时DNA模版上进行排序、修剪、空隙填补和连接。6.渐增切割法产生杂化酶为了解决DNAshuffling对同源序列的依赖性，benkovic研究组建立了渐增切割法产生杂化酶及α-硫代磷酸核苷酸介导的ITCHY法。其原理：控制核酸外切酶Ⅲ的切割速度不大于10碱基/min，然后间隔很短的时间连续取样终止反应，最后将A组切割产物3’端和B组切割产物5’端融合产生杂合基因产物。α-硫代磷酸核苷酸介导法（ITCHY）：首先将待重组的两基因串联在同一载体上，然后通过PCR反应或单链模板引伸反应将α-硫代磷酸核苷酸随机引入产物中，由于其抗核酸外切酶Ⅲ的切割，接下来的切割反应会在此处随机终止，连接切割产物即产生随机交叉文库3.易错PCR技术的应用以“易错PCR定向进化扩展青霉FS1884碱性脂肪酶（PEL）”为例子说明易错PCR在酶定向分子进化中的应用。质粒的提取：活化含有质粒pPIC3.5K的大肠杆菌E.coliJM109，接种至含有100μg/mL的氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃，220rpm，振荡12-16h。培养好的菌液于室温，8000rpm，离心10min收集细胞沉淀，提取质粒。易错PCR获取突变脂肪酶基因：以实验室构建的pPIC3.5K-PEL重组质粒为模板，P1、P2为引物连续两轮随机突变脂肪酶基因PEL。第一轮易错PCR扩增(100mL体系)见右图。反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性1min，55℃退火30s，72℃延伸1rain，共32个循环；72℃最后延伸7min。电泳鉴定回收。稀释第一次易错PCR回收的突变脂肪酶基因，并以其为模板，控制浓度在1μg/μL-10μg/μL范围内，以P1，P2为引物，进行第二轮易错PCR。第二轮易错PCR的反应体系参照第一轮，但反应条件稍作变化：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共32个循环；72℃最后延伸7min。1％琼脂糖电泳确认PCR结果后，再次使用回收胶，进行突变脂肪酶基因的回收。3突变脂肪酶重组表达载体构建：使用EcoRI、BamHI分别对突变脂肪酶基因、PIC3.5K质粒进行双酶切。按照1：10的比例，将回收的突变脂肪酶基因片段和pPIC3.5K线性质粒用T4DNALigase连接，构建突变脂肪酶基因的重组表达载体。获得脂肪酶基因随机突变库:将重组质粒转化到感受态的大肠杆菌E.coliDH5α，确定转化后平板长出单菌落，用含100μg／mL氨苄青霉素的LB液体培养基将大肠杆菌菌落刮下，获得脂肪酶基因突变库，加入等体积的30％甘油混合，80℃保存。突变脂肪酶在毕赤酵母的表达：大量抽提突变脂肪酶重组表达载体pPIC3.5K-EP-PEL，并用SalⅠ酶，37℃酶切过夜。乙醇沉淀法回收线性化载体。采用电击法将线性化载体转化到新鲜制备的毕赤酵母GS115感受态细胞中。突变脂肪酶的初筛：电击转化后，将YMD板上长出的毕赤酵母单克隆，全部点印至YPOM固体平板上，并标上序号。恒温培养箱30℃培养，观察每个茵落产水解圈情况。每个YPOM固体平板点印一个产野生型脂肪酶的菌落做对照。比较每个菌落水解圈大小。挑取并标记产水解圈，且水解圈大于对照菌落的突变菌株，YPD液体培养基活化，并甘油保菌，用于下一步复筛。突变脂肪酶的复筛：YPD液体培养基活化后的酵母菌转接至MGY液体培养基中扩增。当菌液OD600达到2-6时，即可将菌体转接MMY培养基。收集一定体积的MGY培养物，4℃，4000rpm，离心5min，去除MGY培养基，将菌体转移到MMY培养基中诱导产酶。称取2.0g琼脂，加入100mL0.05mol／LpH9.4缓冲液，微波炉溶解后，加入2mL橄榄油乳化液，