药品生产相关的微生物基础知识

2023/2/11药品

生产相关的微生物基础知识段秀林2023/2/12第一部分微生物基础知识简介2023/2/13一、自然界中微生物生存的环境人类生活的环境充斥着大量微生物海拔100英里（约160公里）以上海平面以下600英尺（约182米）的地方都可以发现微生物的踪迹1英里=5,280英尺或1.609公里2023/2/14微生物分布特点微生物无处不在气源性微生物革兰氏阳性菌较多它们可形成芽孢，难以杀灭因此，药品生产需要HVAC水源性则革兰氏阴性菌居多不会生成孢子但会形成细菌内毒素耐热性差G+G-2023/2/15首先分享几幅图片给大家一个感性认识葡萄球菌2023/2/16乳酸杆菌2023/2/17

芽孢杆菌2023/2/18

青霉是种真菌，属于子囊菌。有的能产生青霉素，救了无数人的命。产生无性孢子。2023/2/19酵母菌2023/2/110根霉（Rhizopus)是种真菌，属于接合菌。能产生无性孢子菌丝体的直径约12um黑的是孢子囊2023/2/111爱滋病病毒2023/2/112

禽流感病毒SARS病毒是一类新发现的冠状病毒2023/2/113甲型H1NI2023/2/114二、常见微生物种类基本特点细菌0.5～5μm，生长态时不耐热，部分能形成耐热芽孢真菌5μm～50μm，形成芽孢随空气扩散，不耐热病毒小于0.1μm，一般不耐热，0.22μm过滤不了2023/2/115三、真菌和细菌大小真菌5μm~50μm细菌0.5~5μm主要成员酵母、霉菌细菌细胞组成酵母是单细胞，其它为多细胞均为单细胞细胞质成份遗传物质(DNA)被双层核膜包裹(真核)，并且还有如线粒体、叶绿体及高卡基体等被膜包裹的细胞器。遗传物质(DNA)祼露并游离于细胞质内(原核)，并且不含有其它有膜细胞器。繁殖方式有性（如大型真菌或无性如酵母），霉菌则二者兼有无性（裂殖）孢子霉菌产生分生孢子（生长繁殖，类似于植物的种子)，虽不耐热，但会飘浮于空气中而难以消除。酵母不会产生孢子。主要只有两个属产生孢子（内生孢子），又名芽孢：Bacillus-芽孢杆菌属和Clostridium-梭菌属，细菌芽孢属于休眠体，一个细菌细胞产生一个芽孢生长条件20-25oC,3-5天30-35oC,1-2天杀灭程度不耐热，但难用消毒剂消毒（因孢子处于漂浮状态）生长态菌不耐热（极个别除外），但形成芽孢后耐热。2023/2/116四、细菌的结构及生长条件细菌一般结构包括细胞壁、细胞膜、细胞质、细胞核，特殊结构包括荚膜、鞭毛、菌毛、芽孢。然而，细菌的芽孢，并不是繁殖的手段，而是休眠体。2023/2/117革兰氏阳性菌：气源性，身体上部，呼吸道革兰氏阴性菌：则是水源性的，细胞结构不同生物指示剂(BI)均为革兰氏阳性菌，灭菌用BI为非致病菌。2023/2/118五、细菌芽胞（孢）的形成及其特性成熟芽孢孢子壁母细胞孢子壁的形成生长态细胞摘自/microbes/spores.asp内生孢子产生于Gram+

细菌:

芽孢杆菌属Bacillus梭菌属Clostridium仅含核酸及少量萌发必需物皮层含DPA和Ca2+复合物能抵御各种恶劣环境可休眠上百万年真菌孢子因不具上述特性而不耐热2023/2/119六、什么是芽孢？当某些细菌遇到不良生存环境条件时，为保护自身，在细胞内形成一外壁厚而坚硬的体眠体，该体眠体即称芽孢（Spore）或孢子。由于其对不良环境的耐受性远高于生长态细胞，常被用于挑战灭菌工艺，以确认被灭菌物品无菌的可靠性。2023/2/120芽孢的特性主要产生于Gram+

细菌的两个属芽孢杆菌属Bacillus梭菌属Clostridium能抵御各种恶劣环境，可存活上百万年，因为它有厚的皮层结构仅含核酸及少量萌发必需物含水量极低休眠体，内生孢子，不可再生（每个细胞只产生一个芽孢）；真菌孢子属于分生孢子，不具上述特性。2023/2/121芽孢的特点耐热80℃下长期存活100℃下有相当高的存活率100℃以上死亡过程符合一级动力学方程影响芽孢耐热性的因素芽孢存在的介质受热时的湿度2023/2/122芽孢的利用生物指示剂（BI）对特定灭菌工艺具有一定耐受性并能用于定量测定灭菌效力的微生物制剂（USP32）特点芽孢用于制备生物指示剂的微生物应具有相当的耐受性、稳定性、易培养、及非致病性应用于被验证产品、灭菌工艺、生产工艺符合有关法规的要求 2023/2/123

第二部分

药品无菌生产的微生物知识2023/2/124一、无菌操作岗位人员的主要培训内容1、有关法规、规定、制度药品法、GMP、规章制度，无菌操作有关制度、规定、工艺规程及岗位操作法等;2、无菌基本概念无菌产品定义、污染物及污染源（微粒、微生物、热源等）

3、无菌控制方法要点环境控制及监测方法，空气净化技术，水的净化，物料进入无菌区的要求和程序，人员进入无菌区的要求和程序，消毒剂和消毒方法等2023/2/1254、岗位标准操作程序（SOP）训练各种岗位标准操作程序的训练，如洗瓶机的操作，洗胶塞机的操作，设备清洗方法，场地清洗方法，无菌灌装岗位的操作（包括洗手方法，无菌工作服穿着要求，无菌操作程序及技巧，天平使用规则，称量复核程序，灌装的计算，调整及复核等）

5、组长岗位职责人员管理，无菌操作的准备程序，组织清场、换批、复核计量，生产记录检查等2023/2/1266、机修人员无菌概念的培训生产工艺和设备的无菌要求，生产流水线的准备及故障排除、试车、保养及维修等

7、无菌操作岗位的文件管理物料清单，无菌记录，清洁记录，设备运行维修记录，生产指令单，各岗位（洗瓶、洗塞、称量、灌装等）操作记录，批生产记录等2023/2/127二、洁净与污染1、干净与洁净：

干净：肉眼所见，是宏观。

洁净：微粒、菌落，是微观。2、一般区：是指洁净区之外，未规定有空气洁净度级别要求，但有卫生要求的区域。2023/2/1283、洁净室（区）：需要对尘粒及微生物数量进行控制的房间（区域）。其建筑结构、装备及其使用均具有减少该区域内污染源的介入、产生和滞留的功能。（全封闭的结构，人员、物料出入门必须分别设置并有各自的净化用室和设施，人员、物料进入洁净室必须经过净化。生产布局要顺应工艺流程，尽量减少迂回、往返；进入洁净间的工艺用水必须符合规定，无菌间不得引入饮用水；进入洁净间的空气必须经过净化并符合规定。）2023/2/1294、污染：当一个产品存在有不需要的物质时，它即受到污染。2023/2/130（1）尘粒污染包括肉眼可见与不可见的白点、纤维、微粒等来源：尘埃、衣物洁具、金属粒子、制剂制备中的粉尘、人体2023/2/131①尘埃5.7%来自地面行驶的车辆，34%来自采掘、炼钢、水泥制造和磨面等工业性粉尘，57%来自燃料的燃烧如锅炉、机动车、火力发电厂，其他如土地干燥产尘、表面腐蚀等。2023/2/132大气中的含尘浓度场所≥0.5㎛粉尘计数浓度（个/㎥）

市中心15—35╳107市郊8—20╳107田野4—8╳107香烟烟雾50╳107/ML（大多<0.3㎛）2023/2/133②衣物、洁具各种布料发尘量布料种类>0.5

㎛发尘量（万/分钟）普通的确良91．73粗孔尼龙绸0．546尼龙绸0．546纯涤纶11．64绵纶丝纺织417．3棉双面卡603．3洁具使用过程中脱落大量的纤维、颗粒。2023/2/134③金属粒子洁净间有机械动作的设备运行中会产生大量金属粒子，特别是大容量注射剂的压盖机。2023/2/135④制剂制备中的粉尘制剂制备中的粉碎、过筛、混合、制粒、整粒、压片、颗粒分装、胶囊填充、某些轻质原料的称量等工序均可以产生大量粉尘。2023/2/136⑤人体

人体皮屑情况部位数量（个）

皮肤表面1．75平方米

皮肤更替5天一次脱落尘粒7．1亿/天

2023/2/137洁净室人员动作与微粒发生率动作或状态发生率（万/分钟）

（0.3-1.0㎛）

不动10

手臂和头轻微活动50

手臂、手、头部都动作100

坐下、起立250

行走（60米/分钟）500

行走（90米/分钟）750

行走（130米/分钟）1000

跳跃1500—30002023/2/138⑥花粉一朵花开放时可以产生几十万到上千万个花粉，是严重的过敏源。花种1朵花开放时的花粉数粒径/㎛黑松148万40-60等披花59万80-100冬枪41万欧洲枫28万2023/2/139（2）微生物污染包括细菌、真菌、病毒。微生物广泛存在于空气、水、土壤和人的身上。2023/2/140某城市空气的含菌浓度场所浮游菌浓度（个/㎥）火车站4.97╳104

商业区4.4╳104

公园6.98╳103

植物园1.05╳1032023/2/141人体带菌情况

部位数量（个）

手100-1000/平方厘米

前额1000-10万/平方厘米

头皮100万/平方厘米

腋窝1万-1000万/平方厘米

鼻分泌物1000万/克

唾液10亿/克

2023/2/142三、污染的四大媒介1、空气：空气本身并不产生污染，但空气是污染最主要、最危险的携带者。2、水：纯水本身并不产生污染，但无论怎样仔细的蒸馏或过滤，总会含有一定量的可溶性的有机物和盐类，这些可溶性物质就是微生物生长的养料。工艺用水：饮用水、纯化水、注射用水2023/2/1433、表面：与制剂室有关的表面是指设备、设施、容器、地板、墙壁等有关物体的表面。由于空气中的湿度，所有表面都包上一层含水的薄膜。这层薄膜由于静电吸引而饱含尘埃微粒与微生物，许多时候，表面还覆盖一层油状物，更易受到尘粒和微生物的污染。2023/2/1444、人体：人是最大的污染源与污染的传播媒介。（1）人自己本身会产生数以千万计的微粒，并随着人体热量所形成的热流而扩散。（2）人体本身携带了无数的微生物（见上表），呼吸、咳嗽会产生大量的微水滴，这些微水滴既含有大量的尘粒，也含有大量的微生物。（3）化装品如口红、眉笔、底粉不但产生大量尘粒，还是微生物的良好营养物质。耳环、戒指、项链、手表，隐藏了大量的尘粒与微生物。2023/2/145四、人员进出洁净区的要求（1）人员：应预防药品不受人的污染。（2）衣服：无菌工作服要维护良好，且穿戴要正确；工作服无破缝、无污渍；穿戴工作服要系紧衣扣，无头发或自身衣服露出。10万（D）级洁净区的着装要求：罩住头发和胡须，穿戴该区域专用工作服、专用鞋或鞋套。1万（C）级洁净区的着装要求：罩住头发、胡须和小胡子，上衣/裤子或连体服、紧腰、高领、专用鞋或鞋套，所用材料不产生污染。2023/2/146四、人员进出洁净区的要求（续）100（A）级洁净区着装的要求：戴兜帽、口罩、穿无菌衣、戴无尘灭菌手套、穿无菌鞋或鞋套，所用材料不产生污染，无私人衣物，每次进入洁净区均需穿新灭菌的工作服。2023/2/147四、人员进出洁净区的要求（续）（3）正确的更衣要求：在净化室工作，必须遵守洁净室内每一个细节的工作规范；不允许将任何有害的物质带入洁净室；避免污染带给产品可能的严重损害；人员的清洁和卫生是很重要的；进入洁净室必须卸妆；2023/2/148四、人员进出洁净区的要求（续）（4）穿洁净工作服的标准操作规程进入更衣室的更衣程序：换干净鞋—卸装—取下手表/首饰—换内衣（需要时）—洗手—戴帽子—戴口罩

—穿洁净服—换鞋和/或鞋套—镜前检查着装—收拾整理—洗手—戴工作手套—进入洁净室。2023/2/149五、工具进入洁净区的要求1、对进入洁净区的工具进行监控。2、器具本身及部件都必须进行清洁消毒。3、脏的，油腻的工具必须清洁并消毒。4、洁净区配备维修工具箱。2023/2/150六、在无菌区工作的要求1、只有洁净区工作人员和授权人员方可进入洁净室；

2、在洁净室内不要快速走动，避免不必要的移动；

3、不要从层流区附近穿过，不可避免时至少要离开1米；

4、所有地面上的物品，均视为已被污染。2023/2/151六、在无菌区工作的要求（续）6、休息时，站着，手臂沿身体下垂，不要两臂交叉，也不要放在臀部；

7、休息时，座着，把手放在膝盖上，不要交叉双手或双腿；

8、工作中必要时才讲话；

9、工作时，可使用电话，不可通过气锁讲话。

2023/2/152七、无菌检查的局限性历史的教训：1962年，美国FDA颁布第一部GMP1970-1975年，美国输液污染至败血症400多起

--有问题的产品全部通过了无菌检查无菌检查的风险取样量为20瓶时污染率与通过无菌检查概率的关系批产品污染率％5101520通过无菌检查的概率％3612412023/2/153药典对无菌保证的定量标准1973年的英国药典和1980年USP增补版提到了无菌的量化标准Fo不小于8分钟经灭菌后，产品中污染菌存活的概率不大于百万分之一。中国药典在2000版起，收载了此标准。无菌保证值：污染菌存活概率的负对数，经灭菌后，产品的无菌保证值不小于62023/2/154“无菌”的标准及概念“每批产品中，污染品概率不得超过一百万分之一”，无菌的这一量化标准应当可以用试验来证明的。用无菌检查法显然是不可能的。然而，每瓶产品微生物存活的概率却可计算的。这就需要测试产品灭菌前微生物污染数、D值，使用对数规则，并用生物指示剂试验来证实。量化指标+计算+试验，使无菌标准成为工业界可执行的标准

2023/2/155

第三部分

热力灭菌基本原理2023/2/156

热对微生物的作用当高温破坏了细胞中起生命作用的蛋白质、酶及核酸时，细胞死亡。生命基本物质的破坏本质上是化学变化实验证明微生物受热死亡速度符合一级动力学方程2023/2/157微生物存活数与灭菌时间关系图

半对数座标Y轴：微生物取对数X轴：时间为10进制普通座标tlgN102030123Y轴及X轴均为普通座标（示意）tN1020301010010002023/2/158芽孢的耐热参数：D值指一定温度下将微生物杀灭90％或下降一个对数单位所需要的时间。lgNt1234t1t2D2023/2/159灭菌温度对D值的影响

灭菌温度低时，达到同一灭菌效果的时间就长115℃121℃125℃lgNt△lgN=1D125D121D1152023/2/160F0值：达到同一灭菌效果的概念

F0值即标准灭菌时间指产品在灭菌过程中获得的与标准参照条件（121℃）相同灭菌效果的曝热时间lgNtLgNoLgNt121℃117℃△LgNFTFo2023/2/161不同灭菌温度下的灭菌率灭菌温度℃灭菌率L1000.0081050.0251120.1261150.2511160.3161180.5011200.7941211.0001221.251231.59灭菌率：为达到与某一温度下灭菌1分钟相同的灭菌效果，在121℃下灭菌所需要的灭菌时间

100℃灭菌时1分钟，相当于121℃灭菌0.008分钟，即Fo值为0.008分钟。105℃灭菌40分钟时，Fo约为1分钟，能使D值为1分钟的芽孢数量下降1个对数单位2023/2/162

第四部分

消毒、灭菌与常见的灭菌方法2023/2/163消毒

消毒：是指对病原微生物的繁殖体的致死作用，但不能杀死芽孢等全部微生物。所以消毒是不彻底的，不能代替灭菌。消毒剂：凡用于消毒的化学药品统称为消毒剂，有液体的、固体的和气体的。常用的消毒剂2023/2/164名称作用机制常用浓度性质与用途乙醇蛋白质变性、溶解细胞70%～75%能迅速杀死细菌繁殖体，对一般病毒有一定的消毒作用，对芽孢无杀灭作用。洗必泰破坏细胞膜，使胞浆外渗0.1%～0.5%表面活性剂，对革兰阳性细菌、阴性细菌均有杀菌作用，但对前者作用较强。甲醛阻抑菌细胞核蛋白质合成37%～40%能破坏细菌繁殖体及许多芽孢、真菌和病毒。来苏尔损伤细胞膜2%能杀灭大多数致病菌的繁殖体，对芽孢作用较弱。新洁尔灭破坏细胞膜，使蛋白质变性0.05%～0.1%季胺盐类化合物，阳离子表面活性剂，抗菌谱较窄，对革兰阳性菌有较强作用，对革兰阴性杆菌，特别是铜绿假单胞菌不敏感，在中性和弱碱性溶液中效果最佳。过氧化氢蛋白质、酶类变性2%～3%强氧化剂，利用新生氧杀灭细菌繁殖体、芽孢、病毒，真菌有相对的抗性。2023/2/165影响消毒剂活性的因素：温度浓度酸碱度微生物的种类有机物质其他物理化学因素2023/2/166灭菌凡能杀灭物体中所有活的微生物的作用称为灭菌。灭菌的手段及设备，分别称为灭菌法及灭菌器灭菌法是指用适当的物理或化学手段将物品中的微生物杀灭或除去的方法。常用的物理方法有：热力、气体灭菌、辐射灭菌、物理阻留过滤除菌，还有脉动强光和等离子体等灭菌。2023/2/167灭菌方法重点介绍：湿热灭菌干热灭菌2023/2/168湿热灭菌-1湿热灭菌通常指一定压力下的蒸汽灭菌，也包括过热水灭菌（水浴式或喷淋式）实际上只要微生物处于达到水－水蒸气平衡状态下的灭菌过程，都是湿热灭菌例：实验室给微生物取样瓶灭菌时通常加入1ml水并密封。水分的存在有利于灭菌2023/2/169湿热灭菌特点蒸汽有利于蛋白质的变性和酶的失活，从而杀灭细胞蒸汽热穿透性强灭菌效率高温度相对较低灭菌时间相对短灭菌过程不产生任何化学物理污染灭菌设备控制参数少，运行稳定，方便管理2023/2/170湿热灭菌工艺之一美国FDA规定的残存概率法灭菌过程8≤F0<12分钟适用于热稳定性不很好的产品通过控制工艺过程的微生物污染和灭菌工艺参数使产品无菌无菌保证值不小于62023/2/171湿热灭菌工艺之二过度杀灭法F0不低于12热稳定性好的产品以彻底杀灭任何污染的微生物为实现无菌的手段无菌保证值不小于62023/2/172其它湿热灭菌工艺？F0值低于8的灭菌工艺热稳定性很差的产品以无菌生产工艺为基础，灭菌是提高无菌保证水平的辅助手段不计算F0值，污染概率不大于0.1%除血液制品外，发达国家这类大容量注射剂几乎没有小容量注射剂也少见2023/2/173无菌灌装与流通蒸汽灭菌PDA《参数放行》-1999-10-21文件中指出：如果产品在最终灭菌前采取无菌灌装，那么该产品的灭菌工艺可以采用较小的F0值（如F0≤8min）这当然是对热稳定差的产品采用的方法此提法和欧盟GMP无菌药品附录一致这一原则还没有被我国制药行业所认可，我国企业只认可流通蒸汽灭菌，却忽视了无菌制造工艺的关键要求2023/2/174不同工艺无菌保证比较表过度杀灭法Fo>1210-6热稳定性好的产品以杀灭微生物作为实现无菌的手段残存概率法Fo>810-6热稳定性较差产品工艺过程将防止产品被耐热菌污染放在首位，而不是仅依赖最终灭菌去消除污染

流通蒸汽法不计算Fo0.1%热不稳定产品加热是无菌生产工艺（除菌过滤）的补充手段除菌过滤法LRV>70.1%不能加热的产品LRV=logreductionvalue过滤对数下降值，一般上游为107下游为1，则LRV=7由于后续无菌操作较多，最终产品达到的无菌保证水平远低于除菌过滤的本身的能力2023/2/175干热灭菌机理干热灭菌与湿热灭菌的动力学特征相似，符合“对数规则”，但灭菌的机理却并不相同。干热灭菌为何需较高的温度？水份的影响：湿度低机理不同：干热灭菌是使微生物氧化而不是使蛋白质变性2023/2/176干热灭菌要点干热灭菌的介质通常是热空气用对数规则描述微生物杀灭过程，准确性较差温度高，200℃以上，有可能到320℃用于玻璃容器、手术器械等无菌生产工艺中安瓿、西林瓶的灭菌和去热源2023/2/177干热灭菌与去热原的关系去热原的工艺条件比孢子杀灭程序要苛刻得多，通常相当于标准干热灭菌时间FH

的数十倍。如果干热法去热原工艺能使细菌内毒素下降3个对数单位，就不必再进行微生物的生物指示剂挑战性试验。2023/2/178第五部分

灭菌工艺的验证2023/2/179灭菌工艺的验证灭菌工艺验证资料是国外药品（注射剂）注册的必报材料灭菌工艺条件（灭菌介质、温度时间参数、装载方式等）灭菌设备和灭菌工艺的验证（前者与后者不同）灭菌工艺验证资料包括灭菌设备的安装确认灭菌设备的运行确认灭菌工艺的验证先对设备温度仪表和验证用仪表进行校