临床血液学检验-1-7-造血检验基本方法2细胞化学染色检验

第一章造血与血细胞检验

第七节骨髓检查

二、细胞化学染色1普通染色免疫细胞化学染色细胞形态学检验技术细胞化学染色2【细胞化学染色概述】细胞化学染色的概念细胞形态学化学（化学反应）酶类、脂类、糖类、铁、蛋白、核酸等细胞化学染色3细胞化学染色的临床应用细胞化学染色的基本步骤帮助识别细胞了解细胞的生理状态及功能辅助诊断及鉴别诊断血液系统疾病取材：新鲜骨髓片或血片制片染色：固定、有色沉淀反应（显色）、复染显微镜检查：观察染色是否成功，观察目标细胞的染色结果填写报告单：定性（阳性/阴性）、半定量（阳性率/阳性积分/阳性程度）登记及存档4固定物理法

化学法

干燥固定

火焰固定

蒸汽固定

液体固定

5偶氮偶联法

雪夫反应

联苯胺法

普鲁士蓝反应

金属沉淀法

显色

6

复染的目的在于使各种细胞能显示出来以便于观察。选择复染液的颜色应与有色沉淀的颜色有明显的对比度，即能使细胞结构显示又能清楚地看出细胞化学染色结果复染

7（一）用于贫血的细胞化学染色（铁染色）『用于贫血的常规细胞化学染色』外周血网织红细胞计数（Ret/Retic/RC）

骨髓铁染色8【复习：外周血网织红细胞计数（Ret/Retic/RC）】『问题』在瑞氏染色下，能否较准确地区别成熟红细胞与未完全成熟的红细胞（网织红细胞）网织红细胞计数有哪两种方法？在手工操作法中，我们染色及观察的是哪种化学物质网织红细胞计数的参考值是多少？有什么临床意义手工活体染色法和仪器法RNA0.5％～1.5％反映骨髓中红系的造血情况，用于贫血的诊断、鉴别诊断及疗效观察不能，未完全成熟的红细胞在瑞氏染色下表现为嗜多色红细胞94Fe3+＋3K4［Fe(CN)6］Fe4［Fe(CN)6］3＋12K+亚铁氰化钾亚铁氰化铁（普鲁士蓝色）酸性【骨髓铁染色】染色原理及方法贮存铁铁蛋白含铁血黄素10作用液30min流水冲洗5min，待干1％藏红花染1min，水洗待干骨髓片标本片12作用液需要新鲜配制：浓盐酸0.25ml＋1.25ml20%亚铁氰化钾溶液（两者比例为1∶5）23411正常血细胞的染色结果细胞外铁：位于骨髓小粒内或巨噬细胞胞质内（即幼红细胞外）细胞内铁：位于幼红细胞胞质内的铁铁粒幼红细胞：胞质中出现蓝色铁颗粒的幼红细胞。计数100个中幼红和晚幼红细胞中铁粒幼红细胞的百分比即为细胞内铁阳性率铁粒红细胞：胞质中出现蓝色铁颗粒的红细胞环形铁粒幼红细胞：幼红细胞胞质中蓝色颗粒6颗以上，围绕核周1/2以上者病理情况1213细胞外铁（＋＋＋＋）细胞外铁（＋＋＋）细胞外铁（＋＋）细胞外铁（＋＋＋）细胞外铁（＋＋＋）细胞外铁（＋）细胞外铁（－）14铁粒幼细胞铁粒幼细胞幼红细胞环形铁粒幼细胞、铁粒红细胞15参考值骨髓细胞外铁：（+）~（++），约2/3人为（++），1/3人为（+）骨髓细胞内铁：铁粒幼红细胞的阳性率为19%~44%，以I型为主，少数为II型16临床应用：用于贫血的诊断及鉴别诊断贫血细胞外铁细胞内铁缺铁性贫血阴性明显减低或为0铁粒幼细胞性贫血明显增多增高环形铁粒幼细胞（≥15％）骨髓增生异常综合征（MDS）RA-RS常增高增高环形铁粒幼细胞≥15％RCMD-RS非缺铁性贫血溶贫、巨幼贫、再障等正常或增高正常或增高感染、肝硬化、慢性肾炎、尿毒症等增高减低17细胞内铁细胞外铁细胞外铁细胞内铁细胞内铁细胞外铁细胞内铁细胞外铁细胞内铁隐性缺铁缺铁性贫血早期缺铁缺铁性贫血铁转运或利用异常继发性贫血铁负荷铁粒幼细胞贫血巨幼细胞贫血再障MDS红白血病图贫血时铁染色常见的四种情形1819（二）中性粒细胞碱性磷酸酶染色（NAP染色）

染色原理及方法：Kaplow偶氮偶联法α-磷酸萘酚钠＋H2Oα-萘酚＋磷酸钠＋坚牢蓝RR不溶性棕黑色沉淀pH9.6碱性磷酸酶成熟中性粒细胞胞质中20固定液30s，水洗待干作用液5～15min，水洗，待干1％藏红花3min，水洗，待干新鲜血片标本片12作用液需要新鲜配制：α-磷酸萘酚钠溶液1.5ml，在37℃预热5min＋坚牢蓝RR1.5mg33421正常血细胞的染色结果阳性反应呈棕黑色颗粒，定位于成熟中性粒细胞胞质内。其他细胞呈阴性油镜下计数100个成熟中性粒细胞，记录其阳性程度（－）、（＋）、（2＋）、（3＋）、（4＋），分别记为0、1、2、3、4分。计算阳性细胞总数为阳性率，阳性细胞的分数总和为阳性积分2223NAP（＋＋＋）NAP（＋＋＋＋）NAP（＋＋）NAP（＋＋）NAP（＋）NAP（＋）NAP（－）嗜酸性粒细胞（－）24参考值：阳性率＜40％，阳性积分14～113。各实验室之间可有较大差异，应建立各实验室的参考值临床应用NAP染色主要用于骨髓增生性肿瘤（MPN）的诊断与鉴别诊断。NAP是怀疑骨髓增生性肿瘤时应作的常规细胞化学染色慢粒NAP显著减低，甚至为0，其他MPN为正常或增高慢粒NAP显著减低，甚至为0，类白NAP显著增高鉴别其他疾病25图NAP染色（慢粒血片）26图NAP染色（类白血片）27（三）急性白血病形态学分型的细胞化学染色『急性白血病细胞分型的常规细胞化学染色』过氧化物酶（POX）染色/苏丹黑B（SBB）染色特异性酯酶（NAS-DCE）染色非特异性酯酶（α-NAE/α-NBE/NAS-DAE/ANAE等）染色过碘酸-雪夫（PAS）染色酸性磷酸酶（ACP）染色28『问题』在各系各阶段血细胞中，最难鉴别的细胞是什么细胞正常和一般疾病病人的骨髓片中可以看到原始细胞吗在什么情况下，骨髓片中能看见大量的原始细胞如何鉴别原粒、原淋及原单？原始细胞原粒细胞＜2％，原红＜1％，其他原始细胞罕见急性白血病骨髓中原始细胞≥20％MDS（RAEB）骨髓中原始细胞5～20％细胞化学染色（一组）29过氧化物酶（POX）染色（1）染色方法及原理复方联苯胺法二氨基联苯胺法四甲基联苯胺法改良Pereira法（碘化钾法）30过氧化氢四甲基联苯胺亚硝基铁氰化钠蓝色颗粒棕色颗粒图POX染色原理（四甲基联苯胺法）水联苯胺蓝过氧化物酶试剂试剂31（2）正常血细胞的染色反应染色成功的标志：成熟中性粒细胞为阳性反应各系细胞染色反应粒系：除早期原粒外，其余为阳性单核系：除早期原单外，其余为弱阳性淋巴系：阴性浆细胞系、红系、巨核系：均呈阴性32333435【苏丹黑B染色（SBB染色）】（1）染色方法及原理（2）正常血细胞的染色反应（3）临床应用同POX染色。POX更特异，SBB更敏感36特异性酯酶染色（氯乙酸AS-D萘酚酯酶染色，CE染色）（1）原理及方法图氯乙酸AS-D萘酚酯酶染色法原理氯乙酸AS-D萘酚重氮盐（坚牢紫酱GBC）红色沉淀特异性酯酶（氯乙酸AS-D萘酚酯酶）AS-D萘酚试剂试剂37（2）正常血细胞的染色反应染色成功的标志：成熟中性粒细胞为阳性反应各系细胞的染色反应粒系：早期原粒为阴性，其余为阳性单核系：阴性淋巴系：阴性浆细胞系、红系、巨核系：均为阴性3839非特异性酯酶染色（1）染色方法及原理：需同时进行NaF抑制试验最特异根据酯酶特异性高低特异性酯酶(氯乙酸AS-D萘酚酯酶)非特异性酯酶

pH值不同

酸性酯酶(酸性α-醋酸萘酚酯酶)碱性酯酶(α-丁酸萘酚酯酶)中性酯酶

α-醋酸萘酚酯酶醋酸AS-D萘酚酯酶

40（2）各系血细胞的染色反应粒系：多为阴性，少数可呈阳性，阳性反应不能被NaF抑制（α-NBE染色特异性较高，粒系为阴性）单核系：早期原单为阴性，其余为阳性，阳性反应可被NaF抑制淋巴系：多为阴性，少数可呈弱阳性，阳性反应不能被NaF抑制其他细胞

414243【酯酶双染色】染色原理及方法：在同一张涂片上进行特异性酯酶染色和非特异酯酶染色

CE染色与α-NAE染色CE染色与α-NBE染色各系血细胞的染色反应临床应用：对AML-M4的诊断具有意义44过碘酸-雪夫反应（PAS染色，又称糖原染色）（1）染色方法及原理细胞内含有乙二醇基的糖类在过碘酸氧化作用下产生双醛基，后者与雪夫（Schiff）染料作用，使无色品红变为紫红色物质沉积，定位于含有多糖成分的部位45（2）正常血细胞的染色反应染色成功的标志：成熟中性粒细胞为阳性反应各系血细胞的染色反应粒系：早期原粒阴性，其余为阳性，呈弥散状阳性单核系：早期原单阴性，其余为阳性，呈细颗粒状阳性淋巴系：多数为阴性，少数为阳性，呈粗颗粒状阳性或块状阳性红系：阴性巨核系：阳性其他细胞4647酸性磷酸酶（ACP）染色（1）染色方法及原理，同时做抗酒石酸酸性磷酸酶染色正常血细胞的染色结果：粒系、单核系、淋巴系、浆细胞系、巨核系、红系等均呈阳性，抗酒石酸酸性磷酸酶染色均呈阴性临床应用：主要用于毛细胞白血病（HCL）的诊断及鉴别诊断，毛细胞为阳性或强阳性，不被酒石酸抑制48本组细胞化学染色的临床应用鉴别原粒、原单及原淋细胞鉴别急性白血病的类型急性白血病分类细胞化学染色鉴别急性白血病类型示例49细胞类型原粒原单原淋POX阴性或阳性（常为阳性）阴性或弱阳性（常为弱阳性）阴性NAS-DCE阴性或阳性（常为阳性）阴性阴性α-NAEα-NBENAS-DAEANAE阴性或阳性（NaF不抑制）阳性（NaF完全抑制）阴性或阳性（NaF不抑制）PAS阴性或阳性（弥散状阳性）阴性或阳性（细颗粒阳性）阴性或阳性（粗颗粒阳性）ACP阳性（酒石酸抑制）阳性（酒石酸抑制）阳性（酒石酸抑制）50白血病慢性白血病急性白血病慢性淋巴细胞白血病慢性粒细胞白血病急性淋巴细胞白血病急性髓细胞白血病M0（微分化）M7（巨核细胞）M3（早幼粒细胞）M2（粒细胞部分成熟型）M6（红、白细胞）M5（单核细胞）M4（粒、单核细胞）M1（粒细胞未成熟型）原淋原粒原粒+原单原单骨髓中白血病性原始细胞20%早幼粒细胞化学染色51ALL原淋M1原粒M4原粒+原单M5原单细胞化学染色52【细胞化学染色鉴别急性白血病的类型】POX染色：最重要、首选的常规细胞化学染色，是鉴别急性淋巴细胞白血病和急粒髓细胞白血病的重要指标原始细胞阳性率≥3%为AML的M1～M5原始细胞阳性率＜3%为ALL等

CE染色：能较特异地识别粒系细胞，用于辅助鉴别急性白血病的类型（M1、M2、M3、M4）非特异性酯酶染色及NaF抑制试验：能较特异地识别单核系细胞，用于辅助鉴别急性白血病的类型（M4、M5）PAS染色：可以鉴别淋巴细胞与粒、单核细胞，用于辅助鉴别急性白血病的细胞类型。本法还用于鉴别幼红细胞增生的性质5354原始细胞：原淋55原始细胞：原单+原粒56『作业』鉴别铁染色结果的相关概念贮存铁铁蛋白含铁血黄素细胞外铁细胞内铁铁粒幼细胞环形铁粒幼细胞铁粒红细胞57『作业』骨髓铁染色的参考值？贫血时铁染色常见以下四种结果，分别说明机体内铁处于哪种状态外铁减少，内铁正常外铁减少或消失，内铁减少外铁增高，内铁减少外铁增高，内铁增高58『作业』POX染色、CE染色、非特异性酯酶染色及NaF抑制试验、PAS染色这四种染色，粒系、单核系、淋巴系各阶段细胞的结果是怎