第七章之后四基因治疗

基因治疗1.基因治疗历史与现状20世纪80年代初，Cline首次对β-珠蛋白生成障碍性贫血患者进行基因治疗尝试1990年9月，美国批准世界上首个基因治疗方案。腺苷酸脱氨酶（ADA）基因。1989-1995，企业界投入10亿美元从事研究；1995-1996年，NIH对美国已进行的103个基因治疗研究方案进行了评估；急功近利、不切实际；1996年，载体研究初见成效，非病毒型载体改建成功，在细胞中表达效率提高了100倍以上。开展基因治疗临床试验的主要国家和地区国家或地区临床方案数%病例数%美国27874.4220070.2英国184.81113.5法国143.8892.8德国82.1672.1意大利82.1391.2加拿大71.9481.5瑞士71.9341.1埃及10.3150.5日本30.850.2中国20.540.1新加坡20.5190.6韩国10.310以色列10.300已进行基因治疗临床试验的受试对象与疾病类型类型临床方案数%病例数%肿瘤23462.7213468.1单基因遗传病5314.22969.4基因标志41112277.2感染性疾病30840512.9健康志愿者20.560.2其他133.5662.1恶性肿瘤中，恶性黑色素瘤约占40%，转移肿瘤占14%，恶性胶质瘤占11%，乳腺癌10%，肾癌7%，结肠癌6%等。基因治疗临床试验所采用的主要载体与转移方法载体或方法临床方案数%病例数%逆转录病毒载体15441.3119438.1脂质体6918.572523.1腺病毒载体6316.936411.6牛痘病毒载体246.41304.1产RV细胞215.642013.4裸DNA133.5692.2基因枪41.1351.1腺相关病毒载体30.8361.1电穿孔20.5200.62.基因治疗的概念与策略基因治疗的定义：

将正常功能性基因置换或弥补缺陷基因的手段，广义地讲，即将新的遗传物质转移进某个体的细胞内从而获得治疗效果，导入的基因可以是与缺陷基因对应的功能性同源基因，也可以是与缺陷基因无关的治疗基因。基因治疗的策略基因置换(genereplacement)基因修复(genecorrection)基因增补(geneaugmentation)基因失活(geneinactivation)免疫调节(immuneadjustment)基因治疗的途径invivo，称为活体直接转移，指将外源基因直接注入体内有关的组织器官，使其进入相应的细胞。更简单、直接和经济，疗效也比较确切，常用的体内基因直接转移手段有病毒介导、脂质体介导和基因直接注射等。exvivo，称为在体转移，指在体外将外源基因导入细胞，再将这种细胞回输到病人体内。该方法经典、安全且效果容易控制，但技术复杂。3.基因转移的方法物理方法：包括裸DNA直接注射、微粒轰击、电穿孔、显微注射等。化学方法：磷酸钙共沉淀法、DEAE-葡聚糖转染法、脂质体转染法等。生物学方法：逆转录病毒载体、腺病毒载体、单纯疱疹病毒载体、腺相关病毒载体、嵌合病毒载体。几种常见的基因导入靶细胞的方法的比较名称机制转染效率用途优缺点影响因素细胞核微注射直接注射50-100%稳定转化需要特殊仪器,处理样品数量少,高效注射技术,DNA浓度电穿孔高压在膜上形成微孔较高瞬时表达,稳定转化需要精密仪器,可用于动、植物细胞和细菌电场强度，脉冲长度，温度，DNA浓度，培养液原生质体融合细胞膜融合50-100%瞬时表达,稳定转化操作复杂，不能进行共转染，慎用于筛选营养缺陷型变异株溶菌酶，PEG浓度，温育时间脂质体转染脂膜融合50-60%瞬时表达,稳定转化操作简单，可用于体内试验脂质体质量，DNA浓度磷酸钙共沉淀内吞作用20%瞬时表达简单有效，适用于贴壁、非贴壁细胞Ca2+，DNA浓度，pH，沉淀时间，氯喹、甘油和丁酸钠处理基因治疗的载体可分为病毒性载体和非病毒性载体两大类。

病毒性载体包括逆转录病毒（Rt）、腺病毒（Ad）、疱疹病毒(HSV)及腺相关病毒（AAV）等。

非病毒性载体主要包括脂质体、分子偶联载体、裸露DNA等常见病毒载体的优缺点比较载体优点缺点主要用途逆转录病毒，单链RNA病毒，约10kb基因组小并且简单，生物学特性清楚，可有效整合到靶细胞的基因组中，并稳定持久表达所带外源基因，表达时间较长，病毒基因组以转座的方式整合，可高效感染分裂细胞插入容量有限，可能会与有复制能力的病毒重组，有致癌的危险Exvivo基因治疗，肿瘤基因治疗腺病毒，双链DNA病毒，36kb生物学特性清楚，可感染分裂和非分裂细胞，在非分裂细胞中也可进行高效的体内感染，病毒滴度高，外源基因表达水平较高不与宿主基因组整合，表达时间较短，病毒蛋白免疫原性强，可引起免疫反应及炎症反应，插入容量有限（7-8kb）Ivvivo基因治疗，特别适于原位使用，尤其是肺部，肿瘤基因治疗常见病毒载体的优缺点比较（续）载体优点缺点主要用途腺伴随病毒，单链DNA病毒，4.6kb无毒、无致病性，免疫原性弱，可位点特异性整合于人19号染色体，长期表达外源基因，可感染分裂和非分裂细胞，在骨骼肌、心肌、肝、视网膜等组织中表达较高基因组小，携带外源基因能力有限（4kb），需腺病毒等辅助复制，难得到高滴度病毒Ivvivo及exvivo基因治疗，遗传疾病基因治疗，获得性慢性疾病的基因治疗单纯疱疹病毒，双链DNA病毒，152kb插入容量可达50kb以上，可同时装载多个目的基因，具有嗜神经性，可潜伏感染，可感染分裂和非分裂细胞分子生物学特性尚未完全阐明，神经毒性在神经系统疾病的基因治疗方面得到了广泛应用4.基因治疗的靶细胞生殖细胞基因治疗(germcellgenetherapy)

精细胞、卵细胞、早期胚胎体细胞基因治疗（somaticcellgenetherapy）

造血干细胞、成纤维细胞、肝细胞、肌细胞、淋巴细胞靶细胞的选择需考虑：①最好为组织特异性细胞；②细胞较易获得，且生命周期长；③离体细胞较易受外源基因的转化；④离体细胞经转染和一定时间培养后再植回体内，仍较易成活。造血干细胞优点：骨髓移植技术相当成熟；骨髓造血干细胞具有不断分裂，分化成各种血细胞的潜能；基因产物在骨髓细胞成熟后可以通过血液循环遍布全身。缺点：骨髓造血干细胞在骨髓细胞中所占比例很低，仅0.1%。成纤维细胞

容易获取和体外培养，也容易植回体内；易转染、并能稳定地表达外源目的基因，合成和分泌的蛋白质可通过血液供各种类型细胞使用；植回的成纤维细胞很容易被取出。肝细胞

肝脏是人体代谢过程的中心，是基因治疗的重要靶器官。肌细胞

肌肉组织数量大，易获取；成肌细胞容易分离培养，并易于基因转移；基因转移成肌细胞易移植回肌肉，并易与原位肌纤维融合；丰富的血管可以将基因产物运输到全身。淋巴细胞

在提取、体外培养、回输体内、基因转移效率和体内高效表达等方面均不存在问题。唯一的缺点是回输体内后的寿命不长，需要经常输入。可供基因治疗选择的某些遗传病遗传疾病缺失的基因产物细胞类型严重联合免疫缺陷腺苷脱氨酶T/B淋巴细胞慢性肉芽肿病细胞色素B嗜中性细胞Gaucher病糖脑苷酶巨噬细胞镰状细胞贫血β-珠蛋白红细胞α和β地中海贫血α和β珠蛋白红细胞Lesch-Nghan症群次黄嘌呤磷酸核糖转移酶基低神经节Duchene肌萎症抗萎缩素肌肉Parkinson病多巴胺脑黑质肺气肿α-1抗胰酶肺上皮囊性纤维化CF跨膜传导调节剂肺/胰腺上皮苯丙酮尿症苯丙氨酸羟化酶肝细胞家族性高胆固醇血症低密度脂蛋白质体肝细胞血友病A和B因子Ⅷ和Ⅸ血小板、肝细胞等5.恶性肿瘤的基因治疗细胞因子导入疗法“自杀”基因疗法肿瘤抑制基因疗法耐药基因疗法反义基因疗法细胞因子导入疗法：细胞因子是免疫活性细胞分泌的蛋白多肽类物质，它们可以作用于细胞本身和其他细胞。将许多编码细胞因子的基因作为目的基因导入细胞，使其在宿主或局部肿瘤中稳定、持续表达，通过增强肿瘤微环境中抗癌免疫达到治疗的目的。自杀基因治疗：就是将细菌、病毒和真菌中特有的药物敏感基因导入肿瘤细胞，通过此基因编码的特异性酶类将原先对细胞无毒或毒性极低的药物前体在肿瘤细胞中代谢成有度的产物，以达到杀死肿瘤细胞的目的，也称前药转换疗法。肿瘤抑制基因疗法：肿瘤抑制基因的失活与肿瘤发生密切相关。将正常的肿瘤抑制基因导入肿瘤细胞中可代替和补偿缺陷的基因，以抑制肿瘤的生长或逆转其表性，这种替代疗法是从根本上攻克肿瘤的关键环节。耐药基因疗法：药物耐受是肿瘤治疗中常见的问题，它同时也明显阻碍了肿瘤化疗的效果。决定细胞这种耐药性的基因成为多耐药基因（MDR）。将一些耐药基因转移至造血干细胞，以降低化疗药物对骨髓的毒性，这样就可能用高剂量的药物杀死肿瘤细胞而不破坏骨髓细胞.反义基因疗法：是指利用人工合成的反义RNA或DNA导入靶细胞，阻断