基因工程抗体

基因工程抗体及其进展【摘要】着对分子生物学研究和抗体分子结构功能的深入研究,利用细胞工程和遗传工程对抗体分子进行改建并赋予其新的功能,进而开发了新的抗体应用领域，使单克隆抗体技术又向前发展了一步。基因工程抗体是按人类设计所重新组装的新型抗体分子，可保留或增加天然抗体的特异性和主要生物学活性，去除或减少无关结构，从而可克服单克隆抗体在临床应用方面的缺陷。细胞工程产生的鼠源单克隆抗体及基因工程产生的人源单克隆抗体。抗体产生的技术革命为抗体治疗开辟了广阔的前景。【关键字词】基因工程抗体人源化抗体小分子抗体广阔的前景基因工程抗体以其独特的优点（免疫原性低、可按人的意愿加以改造等）正逐渐取代动物源性单抗。随着基因工程和蛋白质工程等生物技术在抗体研制领域的广泛应用，适应不同需要的基因工程抗体的种类日趋多样化，构建日趋合理化，在体内的生物学效应也日臻完善，使之较天然单抗的治疗效果更好，范围更广，并在初步临床试用中展示了光辉的前景。分子生物学技术的发展，推动了免疫球蛋白遗传学的研究。抗体的研究从原来的血清学方法、氨基酸水平分析发展到大免疫球蛋白基因结构、表达及调控DNA水平的研究，揭示了抗体多样性、等位基因排斥现象、抗体的分泌型和膜结合型形式、H链类别转换以及亲和力成熟机制等多种生物学现象。自1975年Milstein和kOhler等人研制出单克隆抗体以来，抗体技术得到了广泛的应用和发展，但在生物研究和临床疾病的治疗中却遇到了一定的困难。异源性鼠抗体在人体内诱生免疫应答，产生抗小鼠抗体；人单克隆杂交瘤制备困难，生产量少，稳定性差;获得特异性类别抗体比较困难。随着对抗体基因的研究和DNA分子重组技术的应用，通过基因改造获得特异性抗体成为可能。1989年Huse等首次构建了抗体基因库，从而使抗体的研究从细胞水平进入到分子水平，并推动了第3代抗体一基因工程抗体技术的发展。至此，抗体的产生技术经历了三个阶段：经典免疫方法产生的异源多克隆抗体；细胞工程产生的鼠源单克隆抗体及基因工程产生的人源单克隆抗体。抗体产生的技术革命为抗体治疗开辟了广阔的前景。1、基因工程抗体概述及分类基因工程抗体又称重组抗体，是指利用重组DNA及蛋白质工程技术对编码抗体的基因按不同需要进行加工改造和重新装配，经转染适当的受体细胞所表达的抗体分子。目前报道的基因工程抗体很多，分类方法不一，大体可以分为三类。1-1完整的抗体分子该类抗体类似于天然抗体分子，但经改造后更接近于人的免疫球蛋白，可在一定程度上降低HAMA。1•1•1-甘欠合抗体（chimericantibody）由在基因水平上连接的小鼠抗体V区及人抗体C区组成。这种抗体含75%〜80%人抗体，20%鼠抗体，保留了原来鼠源单抗的特异性,但对人体仍具一定的免疫原性。1.1.2.人源化抗体(humanizedantibody)1.1.2.人源化抗体(humanizedantibody)又称重构型抗体、改型抗体（reshapedantibody）或CDR移植抗体（CDRgraftingantibody）:通过置换三个发夹状环的鼠抗体超变区（又称互补决定区，CDR），使构成抗原结合部位的轻重链各3个CDR区是鼠源的，其余均为人源的。该抗体对人的免疫原性大大降低，但与抗原的亲和力也有所下降。1.1.3.完整的人抗体⑰电humanantibody)这是由人淋巴细胞产生的理想的抗体分子，不包含任何鼠源成分。此种抗体不仅完全避免了HAMA的产生，而且特异性、亲和力不受影响。尽管利用人细胞制备单抗的工艺尚不成熟，但抗体库技术、体外亲和力成熟及转基因动物的研究等，已使生产完整的人抗体成为可能。1-2抗体分子片段小分子抗体片段具有免疫原性低，分子量小，易于渗入目标组织及清除，不与Fc受体阳性细胞相结合等优点，并便于发展其他效应，如与毒素相连，融合表达免疫毒素；与放射性同位素相连，在体内成像定位检查时本底低，能呈现清晰图像。1-3新型抗体分子将抗体的部分片段连接到与抗体无关的序列上或被其他功能性分子所取代，使这些抗体不仅具有与抗原结合的特性，还能发挥其他效应。2基因工程抗体的临床应用近年来随着生物工程技术的发展，许多基因工程抗体陆续问世，并在医学领域的许多方面都极具应用潜力，如病毒感染、肿瘤、自身免疫性疾病、同种异体移植物注射、哮喘、中风和青光眼治疗,尤其在诊断和治疗肿瘤性疾病及抗感染方面优势明显。2-1在肿瘤性疾病诊疗方面的应用放射性标记抗体在肿瘤影像和治疗中很重要，并可有效进行药代动力学评估。以标记抗体注入人体内显示肿瘤部位抗原与抗体结合的放射浓集称放射免疫显像，由于基因工程抗体如单链抗体、Fab片段等分子量小、能很快清除、组织穿透力强，所以更适于放射免疫显像。例如，中等大小的双特异性抗体(60KD)与半衰期较短的同位素相连，由于清除率快被用于临床影像学。治疗用的放射性标记抗体如小抗体(90KD),和半衰期较长的同位素相连，可在肿瘤部位达到较高浓度,适合用于肿瘤治疗。2002年，美国FDA批准了第一株用于肿瘤免疫治疗的放射性标记抗体(Zevalin)上市。恶性肿瘤的导向治疗，是通过重组技术将抗肿瘤相关抗原的抗体与多种分子融合，这些分子在抗体结合靶分子后可提供重要辅助功能。这些分子包括:放射性核素、细胞毒药物、毒素、小肽、蛋白、酶和用于基因治疗的病毒。对肿瘤治疗来说，设计的双特异性抗体可有效针对低水平的肿瘤相关抗原，并将细胞毒物质输送到肿瘤细胞。此外，抗体还可与携带药物的脂质体、各种PEG偶联,从而增强体内运输和药代动力学。作为免疫脂质体,转铁蛋白受体抗体可使药物通过血脑屏障到达大脑。抗体酶复合物作为前体药物也被用于基础肿瘤治疗。2-2基因工程抗体的抗感染作用预防和治疗感染性疾病常用的药物是疫苗和抗生素，但对于一些尚无有效预防及治疗手段的感染性疾病如SARS、AIDS等，抗体治疗可做为首选方案。如在治疗AIDS方面,利用抗体工程技术已成功地制备出HIV病毒整合菌的单链抗体ScAb2219,对HIV病毒感染的早期和晚期具有有效的抑制作用，并可望成为AIDS基因治疗的有效手段。呼吸道合胞病毒(RSV)易引起婴儿呼吸道疾病，如细支气管炎和肺炎，并可引起严重的并发症，目前已有人源化单克隆抗体Palivizumab经美国FDA批准上市，临床实验证明无毒、副反应,并可显著降低婴儿的住院率。我国率先建立了针对SARS的基因工程抗体库,这对于SARS的预防、诊断和治疗都将起到重要作用和深远影响。对于中和其它病原分子,FDA已批准Fab单体分子作为抗蛇毒药物;scFv片段和寡克隆复合物作为抗细菌毒素药物。

2.32.3细胞内抗体术。这项技术是指在细胞内表达并被定位于亚细胞区室如胞核、胞浆或某些细胞器，与特定的靶分子作用从而发挥生物学功能的一类新的工程抗体，最典型的是scFv,被称为内抗体。胞内抗体技术主要应用在抑制病毒复制特别是HIV21复制、肿瘤基因治疗方面，现已逐渐拓展到中枢神经系统疾病、移植排斥和自身免疫性疾病等领域。体外培养来源于无关供体的角质形成细胞同种移植物用于严重的烧伤病人的治疗,往往会引起排斥反应，而MHCI类分子是引起移植排斥的重要抗原。Mhashikar等用编码抗MHCI单链抗体的腺病毒转染角质形成细胞，结果显示明显降低了MHCI的表达，细胞内抗体介导的表型敲除是否有利于同种移植物的存活还需要进一步研究。2.4用于未来诊断的生物传感器和微矩阵技术生物传感器和微阵列技术在不久以后将有可能成为主要的体外诊断技术。对于大量诊断试剂盒，抗体有高敏感性和高特异性。从最初的玻璃界面到现在的多种蛋白亲和界面，用于诊断的抗体微矩阵界面不断发展。随着体外机械人的出现，这一技术将进一步发展,并用于微生物污染、寄生虫和生物病原体的检测。3人源性单抗的研制3-1噬菌体抗体库技术噬菌体抗体库技术是从外周血淋巴细胞或脾细胞中提取RNA或基因组DNA,设计核酸引物，用PCR技术扩增出整套的抗体基因片段如Fab或scFv,通过随即重组，插入噬菌体或噬菌粒表达载体中，与噬菌体外壳蛋白基因PIII或P伽连接，感染大肠杆菌并以融合蛋白的形式使抗体片段表达展示于噬菌体表面 ，形成含有全套抗体谱(repertoire)的噬菌体抗体库，利用抗原2抗体特异性结合进行筛选、富集，并扩增所需克隆。噬菌体展示技术是将编码外源肽或蛋白的DNA片段插入噬菌体的外壳蛋白共同表达于噬菌体表面，以利于配体的识别和结合，而插入的DNA片段对噬菌体的生物学特性无大的影响。3-1-1丝状噬菌体丝状噬菌体包括f1、fd、M13衍生的载体表达系统。这类噬菌体的基因组为闭合环状的单股正链DNA(ssDNA)，基因组DNA的长度可随插入DNA片段大小不同而变化;编码10种蛋白质，它们在分子量和拷贝数上有很大的差别，其中应用较多的是次要衣壳蛋白PIII、PW、PW、PIX和主要衣壳蛋白P伽。PIII是噬菌体的吸附蛋白，每个噬菌体平均含有5个拷贝，分子量为4.2X104,其前体在N端含有18个氨基酸的信号肽。PI作为外源性插入部位的优点是装载量大，甚至可容纳5X104外源片段;拷贝数少,有利于分离到高亲和性的表位外伽含量丰富，每个噬菌体含有2700〜3000拷贝，分子量为5.2X103，其前体含有一个23氨基酸的信号肽。P伽作为外源基因插入部位的优点是表达的抗体效价较高,但抗体亲和力较低。Gao等将VH和VL基因分别连接到PW、PIX的N2末端，经重叠PCR扩增、酶切消化后整合入载体，使之在噬菌体表面以异二聚体形式表达，成功地构建了一个噬菌体抗体库。这类载体表达系统的缺点:一些较大插入片段在增殖时易发生缺失；包装效率低，只有重组DNA链中一条以ssDNA形式合成包装到病毒颗粒;宿主细胞在噬菌体感染后会发生变化3-1-2噬菌粒验室噬菌粒是噬菌体和质粒的混合体,含有单链噬菌体的复制原点和基因间隔区间及至少一种外壳蛋白编码序列(PI或P伽)。噬菌粒作为载体应用最广泛，其优点:转化率高，比噬菌体高2〜3个数量级，可产生大量DNA及抗体蛋白；既可以表达可溶性Fab又可表达附着性Fab;在抗体库扩增时，融合蛋白渗漏表达水平低，毒性小。但是，此类载体需要有辅助噬菌体来产生单链基因，并组装成有感染力的噬菌粒。3-2核糖体展示核糖体展示技术的核心是利用体外核糖体表达载体构建ScFv抗体库，并于体外转录为mRNA,体外翻译表达，随后以固相化的抗原分子亲和筛选出核糖体mRNA2ScFv复合物中的高亲和力ScFv。这种技术在试验中不用任何细胞，是第一个完全在体外筛选有功能蛋白的方法。该技术克服了其它一些蛋白质筛选技术,如噬菌体展示需转化细菌或真核细胞，因效率不高而降低库容，减少抗体多样性的局限，并避免了宿主随细胞基因组复制过程中可能丢失产生的库容下降，同时亦解决了因抗体筛选条件不利于宿主细胞生存而导致抗体丢失这一难题。由于核糖体展示技术的体外翻译、体外筛选的特点，大大缩短了试验周期，具有省时、省力、方便、快速的特点。1997年Plukthun实验室Hanes等的多聚核糖体展示技术(polyribosomedisplay)进行改进建立了核糖体展示技术,可在体外筛选或改造功能蛋白(如抗体)。首先构建核糖体展示的DNA模板,然后依次体外转录、体外翻译和亲和筛选，转录产物mRNA不含任何终止密码子，在体外翻译过程中核糖体会停留在mRNA的3'2末端;在体外翻译和亲和筛选是保证核糖体不会从mRNA上解离，使筛选蛋白的基因型和表型以mRNA2核糖体2蛋白复合物的形式偶联在一起。经过每轮展示，筛选蛋白一般能够被富集100〜1000倍。整个过程完全在体外进行，不经转化，可以进行大容量库(>1011)的构建和筛选，可以方便地引入突变，调整筛选条件和选择压力，因此可以筛选到高亲和力的蛋白分子及进行其。定向进化的研究。1997年Roberts和Szostak与Nemoto分别独立设计了另外一种与核糖体展示类似方法，称为mRNA展示技术或RNA2多肽融合技术(RNA2peptidefusion)或体外病毒技术。这个展示系统是利用嘌吟霉素分子将mRNA分子和其所编码的多肽共价结合起来。嘌吟霉素与单链DNA连接物的3’端连接，然后这个DNA连接物再与文库编码的mRNA3'端连结。当mRNA在体外翻译时，核糖体到达mRNA和DNA的结合点并稳定下来,嘌吟霉素进入核糖体氨酰化位点,并在氨酰转移酶的作用下与所编码的多肽偶联。mRNA2DNA2嘌吟霉素分子文库可在体外翻译，然后用固相化的靶分子将纯化的RNA2多肽复合物淘选出来，像核糖体展示系统那样，这个复合物可通过RT2PCR得到进一步的扩增。其它体外筛选技术还有1998年Arnold等，1999年Forrer等建立的体外筛选酶活性技术(selectionforenzymaticactivityinvitrcl);1999年Doi和Yana2gawa建立的STABLE技术在油包水乳剂中模拟活细胞区域化进行翻译和筛选；以及Actinova公司的共价展示技术(covaeentdisplay)等。4基因工程抗体的应用前景基因工程抗体的发展已使抗体制备技术进入了一个全新的时代，此项技术已广泛深入到生物医学中的许多领域，尤其是噬菌体抗体库技术的建立，使得不经过免疫、利用抗原直接从库中筛选特异性抗体成为可能,使抗体的制备变得简单易行，稳定有效,使人源抗体的制备有了突破,这是抗体工程领域的重大进展。这极大地推动了各种性能优良抗体及多功能抗体融合蛋白的开发和应用，而且在蛋白质纯化工程中也有广阔的应用前景。随着分子生物学、分子免疫学的发展及噬菌体抗体库技术的成熟，人们可以根据需要改造和制备各种人和动物用抗体。可以预见,一个随意定向地制造抗体的时代即将到来。全人源抗体的研究在近30年中得到了极大的发展，目前全球已有500余种诊断和治疗用的单克隆抗体投放市场，100多种用于临床研究。全人源抗体在医学领域的许多方面都极具应用潜力，如病毒感染、肿瘤、自身免疫性疾病、同种异体移植物注射、哮喘、中风等疾病治疗，尤其在诊断和治疗肿瘤疾病及抗感染方面优势明显。但是全人源抗体的研究仍有许多问题等待解决，如抗体亲和力的成熟、全人源杂交瘤细胞分泌抗体的稳定性、抗体的大规模生产等。随着制备技术的完善和成熟，全人源抗体必将成为当今以及未来生命科学及生物技术的研究热点和产业化增长点。基因工程抗体的发展已使抗体制备技术进入了一个全新的时代，此项技术已广泛深入到生物医学中的许多领域，不仅可用于戒毒、血液性疾病、自身免疫性疾病、感染性疾病、器官移植、肿瘤、中毒性疾病、变态反应性疾病等方面的诊疗,而且在蛋白质纯化工程中也有广阔的应用前景。随着分子生物学和免疫学技术的不断发展,基因工程抗体势必将会对人类的生产、生活起到更大的促进作用。参考文献:【1】TodorovskaA,RooversRC,DolezalO,etal.Designandapplicationofdiabodies,triabodiesandtetrabodiesforcancertargeting[J].JImmunolMethods,2001,1(2):47266.【2】Koelemijr,KuppenPJK,VandeveldeCJH,etal.Bispecificantibodiesrecruitingmyeloideffectorcellsfortumortherapy[J].CriticalReviewsinOncology/Hematalogy,2001,38:47261.【3】GirandA,AtamanOY,BattailN,etal.Generationofmono2clonalantibodiestomativehumanimminodeficiencyvirustypeIenvelopeglycoprteinbyimmunizationofmicewithnakedRNA[J].JVirolMethodes,1999,79(1):75284.【4】DengXK,NesbitLA,MorrowKJ,etal.Recombinantsingle-chainvariablefragmentantibodiesdirectedagainstClostridiumdifficiletoxin