分子生物学实验教案详细教案

2023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作1

分子生物学实验

三峡大学化学与生命科学学院

湖北省生物学实验教学示范中心

2010年10月

2023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作2实验内容

实验一实验准备及培养基的制备与灭菌实验二质粒DNA的提取实验三质粒DNA的酶切和检测实验四大肠杆菌感受态细胞的制备及转化实验五DNA重组（连接反应）实验六植物DNA的提取及琼脂糖凝胶电泳检测实验七PCR基因扩增22023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作31.实验准备：

器皿清洗、试剂配制、灭菌分装、取用保存

2.离心机的使用

①打开离心机电源开关，进入待机状态。

②选择合适的转头

③离心管平衡误差应在0.1克以内。

④选择离心参数：

主要掌握离心机、微量移液器及高压灭菌锅的使用机及实验操作注意事项实验一实验准备及培养基制备与灭菌【实验准备内容】【实验目的】2023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作4⑤将平衡好的离心管对称放入转头内。盖好转头盖子拧紧螺丝。⑥按下离心机盖门，如盖门未盖牢，离心机将不能启动。

⑦按START键，开始离心。离心开始后（特别是高速离心时）应等离心速度达到所设的速度时才能离开，一旦发现离心机有异常（如不平衡而导致机器明显震动，或噪音很大），应立即按STOP键，必要时直接按电源开关切断电源，停止继续离心，并找出原因。⑧机器如发现故障，请及时与有关人员联系。⑨使用结束后请清洁转头和离心机腔，不要关闭离心机盖，利于湿气蒸发。

⑩使用结束后必须登记，注明使用情况。2023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作5离心机的摆放位置2023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作63.移液器的使用移液器是生化与分子生物学实验室常用的小件精密设备，移液器能否正确是用，直接关系到实验的准确性与重复性，同时关系到移液器的使用寿命。移液器由联系可调的机械装置和可替换的吸头组成，不同型号的移液器吸头有所不同，实验室常用的移液器根据最大吸用量有20ul,200ul,1ml等规格。微量移液器的操作步骤：

①将微量移液器装上吸头（不同规格的移液器用不同的吸头）

②将微量移液器按钮轻轻压至第一停点；

2023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作7③垂直握持微量移液器，使吸嘴浸入液样面下几毫米，千万不要将吸嘴直接插到液体底部；

④缓慢、平稳地松开控制按钮，吸上样液。否则液体进入吸嘴太快，导致液体倒吸入移液器内部，或吸入体积减少；

⑤等一秒钟后将吸嘴提离液面

⑥平稳地把按钮压到第一停点，再把按钮压至第二停点以排出剩余液体；

⑦提起微量移液器，使吸嘴在容器壁擦过；

⑧然后按吸嘴弹射器除去吸嘴。

2023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作82023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作9量液操作注意事项a.连续可调移液器的取用体积调节要轻缓，严禁超过最大或最小量程；b.在移液器吸头中含有液体时禁止将移液器水平放置，平时不用时置移液器于架上；c.吸取液体时，动作应轻缓，防止液体随气流进入移液器的上部；d.在吸取不同的液体时，要更换吸头；e.移液器要进行定期校准，一般由专业人员来进行。2023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作104.手提式高压蒸气灭菌锅的使用及注意事项①首先将内层锅取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角搁架相平为宜。切物忘记加水，同时加水量不可过少，以防灭菌锅烧干而引起炸裂事故。②放入内层锅，并装入待灭菌物品。注意不要装得太挤，以免妨碍蒸气流通而影响灭菌效果。三角瓶与试管口端均不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞。③加盖，并将盖上的排气软管插入内层锅的排气槽内。再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺旋松紧一致，务使漏气。2023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作11④用电加热，并同时打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的空气。待冷空气完全排尽后，关上排气阀，让锅内的温度随蒸气压力增加而逐渐上升。当锅内压力升到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。本实验用0.11MPa,121.5℃,20min灭菌。灭菌的主要因素是温度而不是压力。因此锅内冷空气必须完全排尽，才能关上排气阀，维持所需压力。⑤灭菌所需时间到后，切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至“0”时，打开排气阀，旋松螺栓。打开盖子，取出灭菌物品。压力一定要降到“0”时，才能打开排气阀，开盖取物。否则就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出瓶口，造成棉塞沾染培养基而发生污染，甚至灼伤使用者。2023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作12⑥将取出的灭菌培养基放入37℃温箱培养24小时，经检查若无杂菌生长，即可待用。5.实验室安全与卫生6.分组：5人一大组，2～3人一小组，一个实验桌1套移液枪7.准备：每组蓝枪头和黄枪头各1盒，全班另加2包，EP管1盒或1包，30ml离心管12个，培养皿10个，全班1000ml的LB培养基8.实验报告与成绩评定平时成绩50％：考勤，实验操作，实验结果，预习报告考核成绩50％：实验报告2023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作13【思考题】1.高压蒸气灭菌之前，为什么要将锅内冷空气排尽？灭菌完毕后，为什么待压力降低到“0”时才能打开排气阀，开盖取物？2.移液操作应注意哪些事项？2023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作14【LB培养基的制备及灭菌】【实验目的】通过对LB培养基的配制，掌握配制培养基的一般方法和步骤。【实验原理】

2023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作15LB培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有时又称为普通培养基。它含有酵母提取物、蛋白胨和NaCl。其中酵母提取物为微生物提供碳源和能源，磷酸盐、蛋白胨主要提供氮源，而NaCl提供无机盐。在配制固体培养基时还要加入一定量琼脂作凝固剂。琼脂在常用浓度下96℃时溶化，一般实际应用时在沸水浴中或下面垫以石棉网煮沸溶化，以免琼脂烧焦。琼脂在40℃时凝固，通常不被微生物分解利用。固体培养基中琼脂的含量根据琼脂的质量和气温的不同而有所不同。2023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作16LB培养基由于这种培养基多用于培养细菌，因此，要用稀酸或稀碱将其pH调至中性或微碱性，以利于细菌的生长繁殖LB固体培养基的配方如下：胰蛋白胨10g酵母提取物5g

NaCl10g琼脂15～20g水1000mLpH7.02023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作17【试剂】酵母提取物，蛋白胨，NaCl，琼脂；mol/LNaOH，1mol/LHCl；试管，三角烧瓶，烧杯，量筒，玻棒，培养基分装器，天平，牛角匙，高压蒸汽灭菌锅，pH试纸（pH5.5～9.0），棉花，牛皮纸，记号笔，麻绳，纱布等。2023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作18【培养基配制】LB液体培养基：配制每升培养基，应在950ml去离子水中加入胰蛋白胨10g酵母提取物5g

NaCl10g摇动容器直至完全溶解，加入200μl5mol/LNaOH调节pH至7.0，定容1L。LB固体培养基：每升培养基加入15克琼脂，0.11MPa,121.5℃,20min灭菌。2023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作19【操作步骤】1．称量按培养基配方比例依次准确地称取酵母提取物、蛋白胨、NaCl放入烧杯中。蛋白胨很易吸潮，在称取时动作要迅速。另外，称药品时严防药品混杂，一把牛角匙用于一种药品，或称取一种药品后，洗净、擦干，再称取另一药品，瓶盖也不要盖错。2．溶化在上述烧杯中可先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解。待药品全溶解后，补充水分到所需的总体积。如果配制固体培养基，将称好的琼脂放入已溶化的药品中，再加热溶化，在琼脂溶化的过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底使烧杯破裂。最后补足所失的水分。2023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作20【操作步骤】3．调pH在未调pH前，先用精密pH试纸测量培养基的原始pH值，如果pH偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/LNaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸测其pH值，直至pH达7.6。反之，则用1mol/LHCl进行调节。注意pH值不要调过头，以避免回调，否则，将会影响培养基内各离子的浓度。对于有些要求pH值较精确的微生物，其pH的调节可用酸度计进行（使用方法，可参考有关说明书）。2023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作21【操作步骤】4．分装按实验要求，可将配制的培养基分装入试管内或三角烧瓶内。分装过程中注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。(1)液体分装分装高度以试管高度的1/4左右为宜。(2)固体分装分装试管，其装量不超过管高的1/5，灭菌后制成斜面，分装三角烧瓶的量以不超过三角烧瓶容积的一半为宜(3)半固体分装试管一般以试管高度的1/3为宜，灭菌后垂直待凝。2023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作22【操作步骤】5．加塞培养基分装完毕后，在试管口或三角烧瓶口上塞上棉塞，以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能。6．包扎加塞后，将全部试管用麻绳捆扎好，再在棉塞外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用一道麻绳扎好。用记号笔注明培养基名称、组别、日期。三角烧瓶加塞后，外包牛皮纸，用麻绳以活结形式扎好，使用时容易解开，同样用记号笔注明培养基名称、组别、日期。2023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作23【操作步骤】7．灭菌将上述培养基以1.1kg/cm2，121℃，20分钟高压蒸汽灭菌。如因特殊情况不能及时灭菌，则应放入冰箱内暂存。8．搁置斜面将灭菌的试管培养基冷至50℃左右，将试管棉塞端搁在玻棒上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜。9．无菌检查将灭菌的培养基放入37℃的温室中培养24～48小时，以检查灭菌是否彻底。2023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作24【思考题

】1.培养基配制好后，为什么必须立即灭菌？如何检查灭菌后的培养基是无菌的？2.在配制培养基的操作过程中应注意些什么问题？为什么？2023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作25实验二质粒DNA的提取【实验目的与意义】

质粒DNA的提取是从事基因工程工作中的一项基本实验技术，但提取方法有很多种，以下介绍一种最常用的方法。

碱裂解法：此方法适用于小量质粒DNA的提取，提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列。

通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒DNA。2023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作26【实验原理】

碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离的目的。2023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作27细菌裂解的方法碱裂解法：0.2molNaOH+1%SDS煮沸裂解法:沸水煮沸40秒SDS裂解法：10%SDS,一般用于质粒大量提取。2023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作28DNA抽提原理DNA是具有一定结构的物质，一些特殊的环境会导致DNA的变性，如加热、极端pH值、有机溶剂、尿素、酰胺试剂等，而适宜的环境又可以使DNA复性。2023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作29DNA抽提原理

SDS是一种阴离子表面活性剂，既可使细菌细胞裂解，又可使一些蛋白质变性，因此用SDS处理细菌，会导致细菌细胞壁的破裂，从而使质粒DNA以及基因组DNA从细胞中同时释放出来。

释放出来的DNA在强碱性（NaOH）条件下发生变性。再用酸性乙酸钾来中和，使溶液处于中性，质粒DNA将迅速复性，而基因组DNA因分子较大，难以复性。离心后，质粒DNA将在上清中，而基因组DNA则与细胞碎片一起沉淀至离心管底部。通过这种方法即可将质粒DNA从细菌中提取出来。2023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作30【仪器、材料与试剂】（一）仪器1.恒温培养箱2.台式离心机3.恒温摇床4.高压灭菌锅（二）材料1.葡萄糖2.三羟甲基氨基甲烷（Tris)3.乙二胺四乙酸（EDTA)4.氢氧化钠5.十二烷基硫酸钠（SDS)6.乙酸钾7.冰乙酸8.氯仿2023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作31【仪器、材料与试剂】9.乙酸10.胰RNA酶11.氨卞青霉素12.蔗糖13.溴酚蓝14.酚15.8－羟基喹啉16.β巯基乙醇17.盐酸18.含pUC19质粒的大肠杆菌19.EcoRⅠ酶20.吸头、小指管2023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作32【仪器、材料与试剂】（三）试剂1.溶液Ⅰ50mmol/L葡萄糖，10mmol/LEDTA，25mMTris-HClpH8.0。2.溶液Ⅱ0.4mol/LNaOH,2%SDS，用前等体积混合3.溶液Ⅲ60mL的5mol/LKAc11.5ml冰乙酸28.5mLH2O4.TE缓冲液或水（+20μg/mlRNase

）:10mmol/L，Tris-HClpH8.01mmol/L，EDTApH8.02023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作33【仪器、材料与试剂】5.70％乙醇（放-20℃冰箱中，用后即放回）6.胰RNA酶将RNA酶溶于10mmol/LTris-HCl(pH7.5)、15mmol/LNaCl中，配成10mg/ml的浓度，于100℃加热15min,缓慢冷却至室温，保存于－20℃。7.凝胶加样缓冲液（6×）40％蔗糖、0.25％溴酚蓝2023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作34Plasmidchromosome质粒(plasmid)

Plasmid独立于细菌染色体外的双链环DNA分子。

2023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作35多克隆位点ori复制起始点遗传标记Amppolylinker2023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作36

质粒的结构

2023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作372023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作38【操作步骤】一、菌种的活化1.用接种环挑取

1环冷冻保存的含质粒

DNA大肠杆菌工程菌（本实验是含人

Bcl-2重组质粒的

DH5α），划线接种于含有

Amp的

LB固体培养基平板上，

37℃倒置培养约

12h(过夜

)。2.用接种针或消毒牙签从新活化的E.coli

DH5α菌平板上挑取一单菌落，接种于2mlLB液体培养中，37℃振荡培养12h左右，直至对数生长期。3.取0.5ml菌液转接于50mlLB液体培养基中，37℃振荡扩大培养2－3h（OD600nm≤0.5，细胞数<108）。2023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作39二、提取步骤1.将2ml含相应抗生素（Amp:50μg/ml)deLB培养基加入到试管中，接入上述的含pUC19质粒的大肠杆菌，37℃培养过夜。2.取2.0ml培养液在4℃、4000rpm离心2min，吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥，3.加100μl的溶液I，使菌体充分悬浮，室温静置10min。4.加200μl新配置的溶液II，温和上下颠倒2-3次，冰浴静置5min。5.加150μl的溶液III，上下颠倒混匀数次，冰浴静置15min。6.4℃，12000rpm离心15min。2023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作407.取上清转至另一离心管中，加等体积（400μl）的酚：氯仿（1：1），充分混匀，室温，12000rpm离心5min。吸上清液至另一离心管中。8.向上清液中加入2倍体积（约1ml）预冷的无水乙醇，混匀后，室温放置5～10min。12000rpm离心5min。倒去上清液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。9.加1ml预冷的70%乙醇，4℃，12000rpm离心5min，洗涤沉淀。10.弃上清，沉淀自然干燥后，加20μlTE缓冲液溶解沉淀。11.加2μl10mg/ml的RNaseA酶，-20℃保存。402023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作41产品序列号及组成K2200-50(50次)K2200-250(250次)KarrotenTM

DNAMiniColumn502502mlCollectionTube50250BufferK1(Cellresuspensionsolution)15ml75mlBufferK2(CellLysissolution)15ml75mlBufferK3(Neutralizationsolution)20ml100mlBufferKB(Columnbalancesolution)30ml150mlBufferKW(Wash

solution)使用前加入70%乙醇40ml使用前加入70%乙醇200mlBufferKE(Elution

solution)5ml25mlKarrotenPlasmidDNAExtractionkit

质粒DNA提取试剂盒组成

2023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作42KarrotenPlasmidDNAExtractionkit

质粒DNA提取试剂盒

1.将带有目的质粒的E.coli

接种于裝有5mlLB/适当抗生素的10-20ml的培养管中，37℃搖床培养20-24h，以扩增质粒。用一个10-20ml培养管或培养瓶，其体积至少有培养液的3-4倍。2023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作432.取一KarrotenTMMiniColumn柱裝在一个2ml收集试管上(已备)。加入500μlBufferKB平衡液至柱子內，室温下10,000rpm离心1min，使平衡液完全流过柱子。弃去收集管中的平衡液.（保留空的收集管，继续往下使用）。特别注意：柱子不平衡，将导致质粒ＤＮＡ产率和纯度的减少。

2023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作443.取1.5~5.0ml的菌液，于室温下12,000rpm离心3min以沉淀菌体。

4.倒出或吸出培养基。往沉淀中加入250μlBufferK1，振荡使细胞完全悬浮。细胞沉淀的完全重悬对于获得高产量是十分重要的。

5.往重悬混和液中加入250μlBufferK2，轻轻颠倒混匀5-10次。室温静置2-5分钟。避免剧烈混和裂解液，否则会使染色体DNA断裂而使得到的质粒纯度降低。裂解反应不要超过5min。（当使用完BufferK2以后，须盖紧其瓶盖保存好，避免与空气中的CO2反应。）2023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作456.往上述混和液中加入350μlBufferK3(可以预冷至4℃，也可以在常温)，并温和地上下颠倒离心管10-20混匀，直至形成白色絮狀沉淀。7.在4℃，12000rpm离心10min,或者在常温12000rpm离心3-4min.(提高离心速度和时间有利于沉淀贴壁更加紧密，但是常温长时间的离心会造成质粒DNA降解)8.小心将细胞离心的上清液转至已平衡的柱子內，室温下10,000rpm离心1min，使裂解液完全流过柱子。弃去收集管中的过滤液.9.把柱子重新装入2ml收集管中，加入700μlBufferKW(用70%乙醇溶解)至柱子，室温10,000rpm离心1min，弃去洗涤液。

注意：冻干的BufferKW在使用之前必须按标签的提示用70%乙醇溶解。如果BufferKW在使用之前是置于冰箱中的，须将其拿出置于室温下。2023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作4610.（可选）重复用700μl70%乙醇（室温）洗涤柱子。室温下10,000rpm离心1min。注意：这一步对需要提取细胞转染用途的质粒来说是必要的。其它的分子生物学实验不需要。

11.弃收集管中的滤液，将空柱子套回2ml收集管内收集管。室温下,13,000rpm离心2min以甩干柱子基质残余的液体。（注意：省去这一步将导致残留乙醇于质粒ＤＮＡ中）。

12.把柱子装在一个干凈的1.5ml离心管上，加入30-50μl（具体取决于预期的终产物浓度，如果需要高浓度，可以用15μl）的BufferKE(可用灭过菌的超纯水或TE缓冲液代替)到柱基质膜的中央，室温放置0.5-1min,13,000rpm离心1min以洗脱DNA。第一次洗脱可以洗出80%左右的结合DNA。如果再洗脱一次的话，可以把残余的DNA洗脱出来(不推荐)2023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作47常见问题可能原因对策DNA产量低细胞在加入BufferK2前未完全打散保证完全重悬细胞细胞裂解不好适当增加Bufferk2的作用时间。BufferK2没有盖紧考虑更换新配制K2，成份：0.2MNaOH，1%SDS。纯化柱未平衡使用前平衡BufferK2出现沉淀一般出现在低温时

可以水浴提高温度溶解产物出现高分子质量DNA污染物加入BufferK2后过度混匀细胞裂解液加入溶液后不要涡旋或剧烈地混匀裂解时间太长适当缩短裂解时间产物不能酶切乙醇没有完全从柱子上去除掉在洗脱前甩干柱子2023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作48【思考题

】1.在质粒DNA提取过程中，BufferK1\BufferK2\

BufferK3各起什么作用？2.碱裂解法提取质粒DNA的原理是什么？3.分离基因组DNA和质粒DNA有哪些不同之处？4.在BufferKE中为什么要加入EDTA？

【实验安排】

一个上午2023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作49溶液Ⅰ：50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris.Cl(pH8.0)，10mmol/LEDTA(pH8.0);葡萄糖增稠，使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部；EDTA抑制DNase的活性。这一步溶液中还可以加入RNase，不受EDTA影响，并且可以在后续步骤中被除去。其实作用不大，葡萄糖可用水来代替。2023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作50实验三质粒DNA的酶切和检测

【实验目的】

通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术

【实验原理】

DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖－磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。具有不同的相对分子质量的DNA片断泳动速度不一样，可进行分离。2023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作51【实验原理】

DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA，也可分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子。如上次实验提取的pUC19质粒，有3种构型：超螺旋的共价闭合环状质粒DNA(covalentlyclosedcircularDNA,简称CCCDNA),开环质粒DNA,即共价闭合环状质粒DNA1条链断裂（opencircularDNA,简称OCDNA),线状质粒DNA,即共价闭合环状质粒DNA2条链发生断裂（linearDNA,简称LDNA)。这3种构型的质粒DNA分子在凝胶电泳中的迁移率不同。因此电泳后呈3条带，超螺旋质粒DNA泳动最快，其次为线状DNA，最慢的为开环质粒DNA。2023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作52影响琼脂糖电泳迁移的主要因素DNA的大小DNA的构象琼脂糖浓度缓冲液2023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作53【仪器、材料与试剂】（一）仪器1.恒温培养箱2.琼脂糖凝胶电泳系统3.台式离心机4.高压灭菌锅5.凝胶成像系统（二）材料1.三羟甲基氨基甲烷（Tris)2.乙二胺四乙酸（EDTA)3.溴化乙锭4.硼酸5.溴酚兰6.蔗糖7.琼脂糖8.DNAmarker9.pUC19质粒2023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作54【仪器、材料与试剂】（三）试剂1.5×TBE(5倍体积的TBE贮存液)配1000ml5×TBE:Tris54g硼酸27.5g0.5mol/LEDTA20mlpH8.02.凝胶加样缓冲液（6×）溴酚蓝0.25％蔗糖40％3.琼脂糖4.EB0.5μg/ml5.EcoRⅠ酶2023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作55【实验步骤】1.取5μl质粒DNA溶液，加1μl酶切缓冲液，EcoRⅠ酶1μl（2U),无菌水补至总体积10μl，37℃保温3小时，加凝胶上样缓冲液（6×）2μl，准备电泳。酶切溶液：EcoRⅠ酶切位点5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-3’DNABufferEcoRⅠddH2OTotal5μl1μl1μl3μl10μl2023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作562023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作572023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作582.制备琼脂糖凝胶称取0.3g琼脂糖，放入锥形瓶中，加入30ml0.5×TBE缓冲液，置微波炉或水浴加热至完全溶化，取出摇匀，则为1％琼脂糖凝胶。3.胶板的制备①取有机玻璃内槽，洗净，晾干，用橡皮膏将有机玻璃内槽的两端边缘封好（一定封严，不能留缝隙）。②将有机玻璃内槽放置于一水平位置，并放好样品梳子。③将冷却到60℃左右的琼脂糖凝胶液，缓缓倒入有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面（注意不要形成气泡）【实验步骤】2023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作59【实验步骤】

④待胶凝固后，取出梳子，取下橡皮膏，放在电泳槽内。⑤加入电泳缓冲也至电泳槽中。4.加样用移液枪将已加入上样缓冲液的DNA样品加入加样孔（记录电样顺序及点样量）。5.电泳①接通电泳槽与电泳仪的电源（注意正负极，DNA片断从负极向正极移动）。DNA的迁移速度与电压成正比，最高电压不超过5V/cm。②当溴酚蓝燃料移动到距凝胶前沿1～2cm处，停止电泳。6.染色将电泳后的凝胶浸入EB溶液中，染色15min,以观察在琼脂糖凝胶中的质粒DNA带（戴手套操作）。2023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作60【凝胶电泳操作注意事项】1.缓冲系统：在没有离子存在时，电导率最小，DNA不迁移，或迁移极慢，在高离子强度的缓冲液中，电导很高并产热，可能导致DNA变性，因此应注意缓冲液的使用是否正确。长时间高压电泳时，常更新缓冲液或在两槽间进行缓冲液的循环是可取的。2.琼脂糖：不同厂家、不同批号的琼脂糖，其杂质含量不同，影响DNA的迁移及荧光背景的强度，应有选择地使用。3.凝胶的制备：凝胶中所加缓冲液应与电泳槽中的相一致，溶解的凝胶应及时倒入板中，避免倒入前凝固结块。倒入板中的凝胶应避免出现气泡，影响电泳结果。4.样品加入量：一般情况下，0.5cm宽的梳子可加0.5ug的DNA量，加样量的多少依据加样孔的大小及DNA中片段的数量和大小而定，过多的量会造成加样孔超载，从而导致拖尾和弥散，对于较大的DNA此现象更明显。2023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作61【凝胶电泳操作注意事项】5.电泳系统的变化会影响DNA的迁移，加入DNA标准参照物进行判定是必要的。6.DNA样品中盐浓度会影响DNA的迁移率，平行对照样品应使用同样的缓冲条件以消除这种影响。7.DNA迁移率取决于琼脂糖凝胶的浓度，迁移分子的形状及大小。采用不同浓度的凝胶有可能分辨范围广泛的DNA分子，制备琼脂糖凝胶可根据DNA分子的范围来决定凝胶的浓度。小片段的DNA电泳应采用聚丙烯酰胺凝胶电泳以提高分辨率。2023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作62【实验结果】在凝胶成像系统中紫外灯观察拍照（戴手套操作）。DNA存在处显出桔红色荧光条带。1234结果照片图1.DNA相对分子质量标准物（marker)2.pUC19质粒DNA经EcoRⅠ完全酶解3.pUC19质粒DNA经EcoRⅠ部分酶解4.自提的pUC19质粒DNA（此结果提得较好，为1条带，以超螺旋质粒DNA为主。有时结果是3条带，分别为超螺旋质粒，线状质粒和开环质粒。还有时结果为2条带）2023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作63【思考题】1.如何提高琼脂糖凝胶电泳的分辨率？2.EB染色的特点和注意事项是什么？3.酶切缓冲液的功能是什么？4.凝胶加样缓冲液的两种成分的作用是什么？5.如果电泳图谱出现连续模糊的带纹，原因是什么？【实验安排】时间实验内容14:00-17:008:00-11:00质粒DNA的酶切17:00-18:3011:00-12:30琼脂糖凝胶电泳18:30-19:0012:30-13:00染色、拍照2023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作64实验四大肠杆菌感受态细胞的制备与转化【实验目的】学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞和将外源质粒DNA转入受体菌细胞的技术及转化体筛选的技术方法。【实验原理】感受态细胞(Competentcells):

受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl2，RuCl等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许多有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞(competentcell)。2023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作65【实验原理】转化（transformation）：是将异源DNA分子引入受体细胞，使其获得新的遗传性状的一种技术方法。进入细胞的DNA分子通过复制表达，才能实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。转化过程所用的受体细胞一般是限制－修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。2023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作66【实验原理】转化的方法：1.化学的方法(热击法)；使用化学试剂（如CaCl2）制备的感受态细胞，通过热击处理将载体DNA分子导入受体细胞；2.电转化法：使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞，通过高压脉冲的作用将载体DNA分子导入受体细胞。2023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作67【实验原理】克隆的筛选：主要用不同抗生素基因筛选。常用的抗生素有：氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、四环素、链霉素等；2023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作68【影响转化率的因素】细胞生长状态和密度。转化的质粒DNA的质量和浓度。试剂的质量。防止杂菌和其它外源DNA的污染。

2023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作692023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作702023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作712023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作72【仪器、材料和试剂】（一）仪器1.无菌超净台2.离心机3.电热恒温水浴锅4.分光光度计5.恒温摇床6.恒温箱7.超低温冰箱（二）材料和试剂1.菌株：E.coliDH5α2.质粒：PUC19质粒3.LB培养基4.含抗菌素的LB平板培养基（氨苄青霉素，浓度

50-100µg／ml5.预冷CaCl2溶液（0.1mol／L）2023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作73【实验步骤】（一）菌种活化

1.用接种环直接取冻存的大肠杆菌DH5α，在LB培养基平板表面划线，于37℃培养16小时。

2.挑取一个单菌落，转到3－5mlLB培养基中，于37℃培养3－5小时

3.将培养液全部转到100mlLB培养基中培养2－3小时，到OD600＝0.3－0.42023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作74【实验步骤】（二）感受态大肠杆菌的制备1.从新活化的E.coli

DH5α菌平板上挑取一单菌落，接种于2mlLB液体培养中，37℃振荡培养12h左右，直至对数生长期。2.取1.5ml菌液转接于30mlLB液体培养基中，37℃振荡扩大培养2－3h（OD600nm≤0.4-0.5，细胞数<108,此为实验成功关键）。3.将菌液转到30ml离心管中，冰上冷却10min；2023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作75【实验步骤】4.于4℃，4000r／min离心10min；5.倒净上清培养液，将管倒置10min以便培养液流尽；6.用6ml冰冷的0.1mo1／LCaCl2溶液轻轻悬浮细胞，冰浴30min；7.0～4℃，4000r／min离心10min，回收细胞；8.弃上清，加1.2ml冰冷的0.1mo1／LCaCl2溶液，小心悬浮细胞，分装，200µl一份，冰上放置片刻后，即制成了感受态细胞悬液。9.制备好的感受态细胞悬液可直接用于转化实验，也可加入占总体积15％左右高压灭菌过的甘油，混匀后分装于1.5ml离心管中，置于-70℃条件下，可保存半年至一年。2023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作76（三）细胞转化编号组别质粒DNA/µlTEbuffer/µl0.1mo1／LGaCl2/µl感受态菌液1受体菌ck———10——2002质粒ck10（0.5µg）——200——3阳性ck10（0.5µg）————2004转化实验组10（0.5µg）————2002023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作77【实验步骤】（三）细胞转化1.取200µl感受态细胞悬液加入pUC19质粒DNA10µl(10-100ng),轻轻摇匀，冰上放置20-30min。同时设置两管对照：受体菌对照：200µl感受态细胞＋10µlTEbuffer质粒对照：200µl0.1mo1／LGaCl2溶液＋10µl质粒DNA溶液阳性对照：200µl感受态细胞＋10µl纯质粒2.42℃水浴中保温1－2min，然后迅速冰上冷却2min。3.立即向上述管中加入0.8mlLB液体培养基，（即得转化反应原液），摇匀后于37℃振荡培养约60min，使受体菌恢复正常生长状态，并使转化体表达抗生素基因产物(Ampr)。2023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作78【实验步骤】（四）平板培养1.取各样品培养液0.1ml，涂在含100µg/mlAmp的LB平板培养基上。2.菌液完全被培养基吸收后，倒置培养皿，于

37℃恒温培养箱内培养12-16小时，待菌落生长良好而又未互相重叠时停止培养。2023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作79【实验结果】在含氨卞青霉素的琼脂平板上生长的菌落即为含有pUC19质粒的大肠杆菌含有pUC19质粒的大肠杆菌2023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作80【实验结果】

不含抗菌素平板含抗菌素平板结果说明受体菌对照组有大量菌落长出无菌落长出本实验未产生抗药性突变株DNA对照组无菌落长出无菌落长出质粒DNA溶液不含杂菌转化实验组（阳性对照）有大量菌落长出有菌落长出质粒进入受体细胞便产生抗药性表3.1培养皿内各实验组菌落的生长状况及结果分析2023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作81【计算转化率】

统计每个培养皿中的菌落数。转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率，公式如下：

转化子总数＝菌落数×稀释倍数×转化反应原液总体积／涂板菌液体积转化频率（转化子数／每mg质粒DNA）＝转化子总数／质粒DNA加入量(mg)

感受态细胞总数＝对照组２菌落数×稀释倍数×菌液总体积／涂板菌液体积感受态细胞转化效率＝转化子总数／感受态细胞总数2023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作82【思考题】1.感受态细胞有何特点？如何保证它的质量2.为什么要设置阴性对照？3.如阴性对照中长出菌，原因？4.在Amp培养板中，菌的密度过高或培养时间过长时会在阳性菌的周围长出一些小的卫星菌落，它们是Amps的，原因？5.还有哪些方法可以将外源基因导入受体细胞？各有什么优缺点？【实验安排】从制备感受态细胞到转化一天可完成2023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作83实验五重组DNA（连接反应）【试验目的】通过本实验学会重组DNA连接及鉴定重组子的方法【实验原理】外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组，这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经过酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。连接酶有两种：E.coli和T4DNA连接酶。两种连接酶都有将具黏性末端的DNA片段之间的连接在一起的功能。T4DNA连接酶还能使两个具平末端的双链DNA连接在一起。2023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作84【实验原理】为防止载体本身的自连，可通过牛小肠碱性磷酸酶(CIP)处理克服：牛肠道分离，切除DNA、RNA和dNTP上的5‘磷酸基团,从DNA片段上除去5’磷酸以防自身连接。DNA重组的方法主要有：具互补黏性末端片段之间的连接和具平末端DNA片段之间的连接重组质粒转化宿主细胞后，还需对转化菌落进行筛选鉴定。842023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作85【实验原理】利用α互补现象进行筛选是最常用的一种鉴定方法:

载体：含有β-半乳糖苷酶基因lacZ的调控序列和β-半乳糖苷酶N端146个aa的编码序列（α肽链）

宿主：缺失了lacZ基因，可编码β-半乳糖苷酶C端序列

α-互补：宿主lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体可以与质粒载体带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶隐性突变体之间实现互补。

在这样的系统中，转化质粒的细菌获得了amp抗性，自连质粒可以合成正常的酶，而重组质粒的细菌不能合成正常的酶。在培养基中添加酶的诱导物IPTG，乳糖的类似物X-gal乳糖酶作用下显示蓝色，蓝斑是载体自连产物，而白色克隆是重组质粒。852023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作862023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作872023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作882023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作892023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作902023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作912023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作922023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作93pUC192686bpEcoRISaclKpnlSmal

XmalBamHlXbalHincllPstlSphlHindlllamprlacllacZ`ori0447Amlll806Ppai1765Ctr10i11779Gsul1784Scal2177Xmnl2294Sspl2501Aatll26117EcoO1092674Ndel183Narl235Plac质粒pUC19932023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作94

质粒pUC19示意简图942023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作95多克隆位点启动子裂开的N端裂开的N端外源DNA半乳糖苷酶N端编码序列pUC192686bppUC192686bp染色体重组体pUC19细菌在含X-gal和乳糖操纵子诱导剂IPTG的琼脂上培养细菌在含X-gal和乳糖操纵子诱导剂的琼脂上培养pUC19含重组体pUC19的白色菌落蓝色菌落含载体pUC19的蓝色菌落半乳糖苷酶C端编码序列转化转化利用互补原理筛选重组子pUC19amprampr2023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作96【仪器、材料和试剂】（一）仪器1.台式离心机2.电热恒温水浴锅3.恒温摇床4.恒温培养箱5.超低温冰箱（二）材料和试剂1.菌株：E.coliDH5α2.质粒：PUC19质粒3.LB培养基4.含抗菌素的LB平板培养基（氨苄青霉素，浓度

50-100µg／ml）5.培养皿、接种针、玻璃涂棒、试管、酒精灯、镊子、牙签等6.预冷CaCl2溶液（0.1mol／L）962023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作97【仪器、材料和试剂】7.二甲基甲酰胺8.T4DNA连接酶9.λDNA10.EcoRⅠ酶11.3mol/LKAc(pH5.2)12.Xgal:将Xgal溶于二甲基甲酰胺，配成20mg/ml，不需过滤灭菌，分装小包装，避光贮存于－20℃。13.IPTG:取2gIPTG溶于8ml双蒸水中，再用双蒸水补至10ml,用0.22µm虑膜过滤除菌，每份1ml,贮存于－20℃。14.TE缓冲液

10mmol/LTris.HCl(Ph8.0)1mmol/LEDTA972023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作98【实验步骤】（一）质粒DNA的提取按实验一的方法提取质粒（二）制备重组DNA1、在灭菌的Eppendorf管中，加入pUC19质粒1µl（2ug/ul），2µl酶切缓冲液，1µlEcoRI酶，无菌双蒸水15µl，至反应混合物总体积为20µl，离心均匀，37℃反应3h(酶及缓冲液应放在冰上）。982023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作992、在另一无菌Eppendorf管中，加入λDNA1.5ug,加入1µl酶切反应液，1µl（2U）EcoRI酶，无菌双蒸水补到10µl，37℃反应3h。3、反应完毕后各取2µl酶解液做电泳分析。4、分别将余下的酶解液加入1/10体积的3mol/LKAc（pH5.2)溶液，再加入2倍体积的无水乙醇，－20℃冰箱，2h（沉淀DNA）。12000r/min4℃离心15min，弃上清，加70％乙醇洗涤沉淀物，再离心，去上清，真空干燥后，加5µlTE溶液。5、将酶切后的2个DNA片断混合于一管中，加T4DNA连接酶缓冲液2.5µl，T4DNA连接酶1µl

,加16.5µl无菌双蒸水,14℃保温14h，并做转化实验。【实验步骤】992023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作100【实验步骤】（三）制备涂菌的琼脂板LB培养基含10µg/ml氨苄青霉素，琼脂15g/l倒入培养皿，凝固4℃保存。（四）制备感受态细胞1、按实验3的方法制备感受态细胞。2、在200µl新制备的感受态细胞中，记入5µl连接产物，混匀，冰上放置30min，同时做两个对照管。受体菌对照：200µl感受态细胞＋2µl无菌水质粒对照：200µl0.1mo1／LCaCl2溶液＋2µl质粒DNA溶液3、将管放到42℃水浴中保温1－2min，4、冰上冷却1－2min。5、每管中加入0.8mlLB液体培养基，（轻轻混匀）。37℃温浴45min，慢摇，1002023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作101【实验步骤】6、在预制的LB琼脂板上，加40µl20mg/mlXgal

和4µl200mg/mlIPTG溶液，并用灭菌玻璃推子（酒精灯上烧后冷却），均匀涂布于琼脂凝胶表面。7、将适当体积（200µl）已转化的感受态细胞均匀涂在上面的培养皿上，将平皿放置37℃温箱30min，至液体被吸收。8、倒置平皿37℃培养12－16h,出现菌落。其中白色菌落为重组DNA质粒。1012023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作102【实验结果】

经12－1h培养后，培养皿上生长着很多白色菌落＆蓝色菌落，白色菌落为DNA重组子。白色菌落为重组子蓝色菌落为不含外源DNA的质粒转化宿主菌的菌落1022023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作103【思考题】1.什么是DNA重组？它包括哪些因素？2.如何提高DNA的重组效率？

3.大肠杆菌感受态细胞制备及转化中的影响因素有哪些？4.为什么转化后的琼脂板上有的没有白色菌落？5.蓝白斑筛选的原理是什么？【实验安排】本实验约需2天1032023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作104实验六植物基因组DNA的提取及琼脂糖凝胶电泳检测【实验目的】通过本实验学习从植物组织中提取DNA的方法【实验原理】细胞提取液中含有的SDS可溶解膜蛋白而破坏细胞膜，使蛋白质变性而沉淀下来。EDTA抑制DNA酶的活性。再用氯仿－异戊醇抽提的方法去除蛋白，得到的DNA溶液经乙醇沉淀。2023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作105【仪器、材料与试剂】

(一)仪器1.低温离心机2.恒温水裕器3.台式离心机4.琼脂糖凝胶电泳系统（二）材料1.水稻幼叶2.三羟甲基氨基甲烷（Tris）3.乙二胺四乙酸（EDTA）4.氯化钠5.无水乙醇6.氯仿7.异戊醇8.琼脂糖9.十二烷基硫酸钠（SDS）2023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作106【仪器、材料与试剂】10.1.5ml、2ml离心管11.陶瓷研钵12.吸管、移液管13.DNA相对分子质量标准物（三）试剂1.DNA抽提液

200mMTris-HCl,PH7.5250mMNaCl

2.5mMEDTA0.5%SDS2.氯仿/异戊醇24:13.TE溶液10mMTris-HClpH=8.01mMEDTApH=8.02023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作107【实验步骤】⒈取幼叶5cm(约3-5g)左右放于研钵中，加入少许石英砂，再加入400μl的SDS抽提液，磨成绿色浆状。应尽快研磨，以免抽提液挥发。⒉将研磨液倒入2ml的离心管，用约400μl的SDS抽提液洗涤研钵，将之也倒入离心管中。将两次抽提液混匀。⒊将离心管置于56℃的水浴锅中放置5min。⒋加入等体积（或稍多一点）的氯仿/异戊醇（24:1），充分混匀。⒌在振荡器上摇动约45min，以充分混匀，颜色变为深绿色。⒍在离心机中以14000rpm离心5min。2023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作108【实验步骤】⒎取上清液于另一1.5ml的离心管中。小心吸取，不能弄混浊上清液，不能吸取到上清液下面的部分。若上清液混浊，则重复第4至第7步。⒏加入等体积的预冷的无水乙醇，轻轻混匀，静置直到DNA析出（室温下30min或4℃冰箱中过夜）。⒐在离心机中以12000rpm离心2-3min；去上清液(小心别弄丢DNA)。10.加入70%乙醇5ml漂洗一至两次。2023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作109【实验步骤】11.在离心机中以12000rpm离心1min，去上清液。12.倒置在干净的吸水纸上或风干（约30min）13.加入100-200μl的TE溶液，溶解后置于4℃冰箱中保存待用。14.取4μlDNA，琼脂糖凝胶电泳检测DNA浓度与质量2023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作110DNAisolationprotocol1.PlanttissuesatdifferentgrowthstagesfromyoungseedlingtomaturitycanbeusedforDNAisolation.Ahealthyleafblade(about2cmlong)iscollectedin1.5mltube.Thetubeiscappedandplacedonice.

2023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作1112.Cuttheleafinto0.5cmsegmentsinasmallmortarandadd400μlofDNAextractionbuffer.DNAextractionbuffer:Tris-HCl50mM,pH8.0,EDTA25mM,pH8.0,

NaCl300mM,SDS1%2023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作1123.Grindthetissueuntilthebufferturnsdarkgreen(don’ttakelongtime).4.Again400μloftheextractionbufferadded,mixedand600μlofitistransferredintotheoriginal1.5mltube.5.Incubateat56°Cfor30minutes,invertthesampleseveraltimesandcooltoroomtemperature6.Add600μlofchloroform:isoamylalcohol(24:1)andmixgentlybyinvertingthetubes20to25timestoformanemulsion.7.Spinat8000rpmfor10minat25-30°C.2023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作1138.Transfer450μlofthetopphasetoanewsterilized1.5mltube.9.Addtwovolumesofcold(-20°C)100%ethanolandrefrigerate(4to6°C)for15-20minutesoruntilDNAstrandsbegintoappear.10.Spinat3000rpmforthreeminutesandthenincreasespeedto10,000rpmforanadditionaleightminutesatroomtemperature.ThisdifferentialspinningstephelpstokeepDNAatthebottomofthecentrifugetube.2023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作11411.Discardthesupernatantandwashthepelletwith70%ethanol.12.Spin1minat12,000rpm.13.PouroffthesupernatantandDrythepelletinavacuumfor15minanddissolveitin50μlmlofhighsaltTEbuffer.2023/1/31三峡大学李晓玲编写与制作115【实验结果】提取得到的DNA应为一条带，如DNA降解会